产气肠杆菌EAM-Z1尿苷磷酸化酶的分离纯化及性质研究

从产气肠杆菌 (Enterobacteraerogenes)突变株EAM Z1中分离出一种具有较高转移酶活性的尿苷磷酸化酶 (UPase)。经测定这种Upase的分子量为 1 2 .8× 1 0 4,亚基分子量为 4 .3×1 0 4,由 3个同型亚基组成。N端氨基酸序列为 :MRMVDLIATKRDGGE。等电点为 4 .46。对尿苷的Km为 0 .2 9mmol L。酶反应的最适pH为 7.8,最适温度为 50℃。该酶能磷酸化尿苷、胸苷、5 氟尿苷、2′ 脱氧 5 氟尿苷及尿嘧啶 β D 阿拉伯呋喃糖 ,且具有较高的转移酶活性 ,能将尿苷和 5 氟尿嘧啶转化成 5 氟尿苷 (一种抗癌药物的中间体 ) ,其转化率为 47%。该酶的这些特性对于酶法合成核苷类抗肿瘤药物和抗病毒药物是十分有用的。     

昆虫来源的几丁质酶的分离纯化及酶学性质

几丁质酶在真菌和昆虫的生理和发育过程中起着关键作用,该酶本身及其酶抑制剂是获取生物农药的重要途径。本研究从蚕蛹体内提取几丁质粗酶,经硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-150分离得到几丁质酶。用SDS-PAGE测得该酶的分子量为88kDa。水解胶体几丁质的Km值为22.3μmol/L。酶反应的最适温度为45℃,最适pH值为6.0,金属离子和有机试剂对几丁质酶活性都有影响,其中高浓度的Mn2+对酶有较强的激活作用,而Cu2+、SDS则有较强的抑制作用。研究结果为基于几丁质酶的生物农药筛选研究奠定了基础。     

产气肠杆菌EAM-Z1尿苷磷酸化酶的分离纯化及性质研究

从产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）突变株EAMZ1中分离出一种具有较高转移酶活性的尿苷磷酸化酶(Upase)。经测定这种Upase的分子量为12.8×104,亚基分子量为4.3×10.4,由３个同型亚基组成。N端氨基酸序列为：MRMVDLIATKRDGGE。等电点为4.46。对尿苷的Km为0.29mmol/L。酶反应的最适pH为7.8,最适温度为50℃。该酶能磷酸化尿苷、胸苷、5氟尿苷、2′脱氧5氟尿苷及尿嘧啶βD阿拉伯呋喃糖,且具有较高的转移酶活性,能将尿苷和5氟尿嘧啶转化成5氟尿苷(一种抗癌药物的中间体),其转化率为47％。该酶的这些特性对于酶法合成核苷类抗肿瘤药物和抗病毒药物是十分有用的。     

球孢白僵菌胞内几丁质酶的分离纯化及性质

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)突变株CH-1316细胞裂解液经(NH_4)_2SO_4沉淀,DEAE-纤维素层析及凝胶过滤,分离出一种几丁质酶,该酶的分子量为32000;最适pH为5.0;最适温度为40℃;最适离子强度为0.2mol/L NaCl;Hg²⁺、Fe²⁺是该酶的强抑制剂;该几丁质酶完全不水解纯的片状几丁质,脱矿几丁质也不是该酶的良好底物;该几丁质酶水解几丁寡糖,但不水解几丁二糖;对几丁五糖以上的寡糖水解速度较快,而对几丁三糖和四糖水解速度则慢得多。     

毛栓菌漆酶的分离纯化及酶学性质研究

对毛栓菌产漆酶的分离、纯化及酶学性质进行研究。粗酶液经硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose柱层析,得到2种漆酶同工酶LacA和LacB。LacA和LacB回收率分别为17.1%和2.74%。SDS-PAGE电泳测得2漆酶的分子量分别为54.6 ku和7.7 ku;LacA和LacB最适作用温度分别为50℃和60℃;最适反应pH值分别为4.5和4.0;Cu2＋、Mg2＋对LacA有激活作用,对LacB影响不大;Ag＋对LacA和LacB表现为完全抑制;Fe3＋对LacA和LacB有一定的抑制作用;Ca2＋、Mn2＋、K＋、Na＋、Zn2＋对LacA和LacB影响不大。DTT、EDTA、DMSO、SDS对酶均有不同程度的抑制作用,且随其浓度的升高抑制作用增强。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

大鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及性质

根据过氧化氢酶的催化特性,采用盐析,透析,离心等技术,从大鼠肝脏中分离纯化过氧化氢酶,提纯倍数达到26倍,酶活性回收率为57%。为一般实验室分离纯化大鼠过氧化氢酶提供了一种有效的方法。酶学性质研究表明,该酶最适温度为37℃,最适pH值为7.5,在此条件下,以过氧化氢为底物的Km值为56 mmol.L-1。     

黄杆菌(Flavobacterium sp.)几丁质酶的纯化和性质

黄杆菌(Flavobacteium sp.)在几丁质的诱导下产生几丁质酶.通过(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE纤维素柱层析、Sephacryl 300柱层析及Sephadex G-75柱层析,从Flavobacterium sp.培养上清液中分离纯化了几丁质酶.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯度分析表明,纯化后的几丁质酶达到了均一的程度.用SDS-PAGE测得该酶的分子量约45D00道尔顿.该酶水解几丁质的最适pH为 7.0,最适温度为50℃,-20C贮存两年以上仍有活性.水解几丁质的Km值为5.0mg/ml.金属离子对几丁质酶活性影响较大,Ca~(2+) 、Co~(2+)’和Cu~(2+)对酶有激活作用.而NH_4~-、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)对酶有抑制作用.几丁质酶水解几丁质的产物是几丁质二糖.     

HaSNPV几丁质酶的分离纯化与毒理学研究

利用重组工程菌GS115-pPIC 9k-ChiA 4.0发酵几丁质酶粗液,经(NH₄)₂SO₄盐析、透析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析以及Sephadex G-100凝胶过滤层析分离纯化,获得电泳纯的棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV)几丁质酶,回收率为19.64%,纯化17.74倍;经HaSNPV几丁质酶毒理学研究,通过触杀作用和胃毒作用,几丁质酶使小菜蛾幼虫细胞液化,导致死亡,其作用效果与几丁质酶浓度和作用时间成正比,且胃毒作用大于触杀作用;经小麦根腐、烟草赤星、番茄灰霉和苹果炭疽等植物病原真菌的抑菌实验,表明几丁质酶可以通过酶解真菌细胞壁中的几丁质达到抑菌作用。     

链霉菌SO1菌株几丁质酶的纯化及性质

由链霉菌（Streptomycessp.）SO1菌株产生的几丁质酶（Citinase）经硫酸铵盐析、OEAE纤维素柱层析、SephadexG－100柱层桥分离纯化后,得到SDS－PAGE均一样品。用SDS－PAG测得纯化后的几丁质酶分子量为41Ku,用PAGEIEF测得等电点PI为5.4。酶反应的最适pH值为6．0,最适温度为50℃,在pH5．0～9．0、温度30～50℃时酶活性比较稳定。在相当于0.1mol／LNaCl的离子强度下酶活性最高。金属离子中的Mg²⁺、Ca     

Imipenem resistance in Enterobacter aerogenes is associated with derepression of chromosomal cephalosporinases and impaired permeability

Enterobacter aerogenes mutants with high-level resistance to imipenem were studied. They were derived from strains characterized by stable over-production of a class-I beta-lactamase. This enzyme (pI = 8.2) exhibited high affinity toward imipenem and hydrolysed the drug slowly. Imipenem-resistant mutants lacked a major 43-kDa outer membrane protein and displayed decreased permeability to cephaloridine. Introduction of a plasmid coding for the regulatory ampD gene abolished beta-lactamase production and rendered the mutants susceptible to imipenem.     

丁二酮高产菌株的选育及发酵动力学分析

目的：筛选出稳定的高产丁二酮突变菌株,并对其进行发酵动力学分析。方法：以原养型产气肠杆菌（Enterobacter aero-genes编号CICC 10293）为出发菌株,采用紫外线诱变,并结合亮氨酸平板和丁二酮平板筛选方法,获得耐高浓度底物——葡萄糖的高产丁二酮突变菌株,定名为UV-3,利用气相色谱测定代谢产物量,考察诱变前后菌株代谢途径中碳源的流向。基于Logistic和Luedeking-Piret方程,建立突变株UV-3细胞生长动力学、底物消耗动力学、丁二酮生成动力学模型,确定动力学方程。结果：突变株UV-3的丁二酮产量提高18.7倍,达到1.045g.L-1,乙偶姻产量降低48.4%,乙醇产量降低71.4%,乙酸产量提高34.6%,且遗传性质稳定。用实验数据对各种动力学模型进行了验证,拟合度均为98.5%以上。结论：紫外线是一种操作方便,效果良好的诱变方式。绘制了突变株UV-3的发酵曲线,建立了动力学模型,为优化丁二酮的生产工艺奠定一定的理论基础。     

近三年产气肠杆菌临床感染情况分析

目的 监测嵊州市人民医院近三年产气肠杆菌对常用抗生素耐药情况。方法 对嵊州市人民医院2013年至2015年间收集的产气肠杆菌临床科室分布情况进行统计,并做临床常用抗生素耐药性分析,用WHONET 5.4软件进行统计学分析。结果 分离得到的产气肠杆菌主要来源于神经外科、重症医学科和呼吸内科的痰液和尿液标本。药敏结果显示其对第一、二代头孢类抗生素耐药率普遍较高：对头孢唑啉几乎全耐药,对头孢呋辛耐药率约为55%;第四代的头孢吡肟能明显抑制产气肠杆菌生长,2013年到2015年对头孢吡肟耐药率分别为8.18%、9.14%和10.74%;对氨基糖苷类抗生素庆大霉素和丁胺卡那,以及碳青霉烯类抗生素亚胺培南和美罗培南具有很高的敏感性。结论 嵊州市人民医院院感科近年间通过对产气肠杆菌临床用药的合理监测,及时向临床医生反馈微生物实验室的耐药结果,避免了抗生素滥用,使得其对抗生素耐药率未出现明显提高。氨基糖苷类抗生素和碳青霉烯类抗生素对其仍具有很高的疗效,应继续通过药敏试验加强对其耐药性监测,指导临床合理用药。     

产气肠杆菌菌体内核苷磷酸化酶的诱导表达

目的:阿糖腺苷(Ara-A)是一种广谱抗病毒药物,临床上用于治疗多种病毒性疾病.同时也是合成阿糖腺苷单磷酸(Ara-AMP)的重要原料.本课题旨在寻找一种高效酶法生产嘌呤类阿糖核苷的方法.方法:以产气肠杆菌完整细胞为酶源,研究产气肠杆菌菌体培养条件对核苷磷酸化酶的影响及其诱导性.结果:胸苷磷酸化酶、尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶均可被多种核苷、核苷酸甚至碱基诱导.胞苷或胞苷酸的添加量为15-20mmol/L,诱导时间在0-8小时均可.经胞苷和胞苷酸诱导的菌体可使酶反应时间缩短6倍,大大提高了反应效率.经诱导的菌体,在反应后仍保持较高的核苷磷酸化酶活力;而未经诱导的菌体,一次反应后即丧失大量的酶活力.结论:核苷磷酸化酶的活性可以通过诱导而提高,以此优化阿糖腺苷的生产.     

E.aero高产1.3-丙二醇菌株选育及发酵培养基研究(Ⅰ)

以淡水湖泊泥土中分离出的300多株肠杆菌(Enterobacter)为出发菌株,利用常规筛选方法选出2株1．3-丙二醇产生菌(Enterobacter)。经UV、DES、NTG、EMS、LiCl单独及复合诱变,选育出一株(E．aero-N-56)1．3-PD高产突变株。通过单因素实验,确定了E．aero—N-56菌株1．3-PD发酵培养基为：甘油90g/L,NH4CL1．50g/L,Fe^2 0．005％,Co^2 0．004％。微量元素液12mL／L。该突变株1．3-PD产量为36．8g/L。     

E.aero高产1.3-丙二醇菌株发酵条件的研究(Ⅱ)

建立了1.3-丙二醇高产菌株(Enterobacter aerogenes简写为E.aero-N-56)1.3-PD厌氧发酵最适pH值、温度、时间、接种量分别为7.0、30℃、48h、9％;在最适发酵条件下,30L发酵罐中E.aero-N-56菌株1.3-PD产量为47.36g/L,生产率为23.68g/L·d。     

产气肠杆菌fhlA基因克隆、表达及重组菌株产氢量

【目的】本研究以产氢细菌产气肠杆菌Enterobacter aerogenes ATCC13408为研究对象,克隆甲酸-氢裂解酶(formate hydrogen lyase,FHL)系统的转录激活蛋白FHL activator(fhlA)基因,构建过表达重组菌株,以提高菌株产氢效率。【方法】利用简并引物和Genome walking技术,克隆fhlA的全长基因,将该基因连接到改造质粒pGEX-4T-2-Cat中,电击转化得到重组菌株,用厌氧发酵方法测定重组细菌的产氢量。【结果】E.aerogenes ATCC13408fhlA ORF全长2073bp,编码一个含690个氨基酸残基的蛋白(GenBank accessionGU188474)。SDS-PAGE和Western blot分析证明fhlA基因在重组菌中得到了融合表达。对重组后菌株的产氢量进行了测定,结果表明:底物产氢潜力由原来的1.23±0.08mol H2/mol葡萄糖提高到了1.48±0.04mol H2/mol葡萄糖,提高了20.36%。【结论】本研究首次克隆了E.aerogenes ATCC13408的fhlA基因,并将该基因在原菌中过量表达。重组后菌株的产氢量得到显著提高,为进一步研究和开发利用E.aerogenes ATCC13408的fhlA基因提供了基础。