南方红豆杉根际溶无机磷细菌的筛选、鉴定及其促生效果

摘要:【目的】对南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)根际溶无机磷细菌进行了分离、筛选与鉴定,并对获得的高效溶磷菌株进行了温室盆栽试验。本研究为通过生物途径改善南方红豆杉磷素供应,促进其生长提供了优良的菌株资源。【方法】利用选择培养基从南方红豆杉根际土壤中共分离出具溶磷能力的细菌;采用NBRI-BPB 培养基进行复筛获得溶磷能力较强的溶无机磷细菌;并采用钼锑抗比色法测量其在NBRIP 培养基中经4d 发酵后的可溶性磷含量;通过形态指标、生理生化测定、Biolog 系统和16S rDNA序列分析鉴定细菌种类;并进行了溶磷菌株的室内盆栽实生苗接种试验。【结论】从南方红豆杉根际共分离出4 株高效溶磷细菌,分别鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis);4株细菌对南方红豆杉苗期的生长有明显的促进作用。     

辣椒镰孢根腐病防病促生细菌的筛选及其效应

【目的】筛选辣椒(Capsicum annuum L.)根腐病防病促生细菌并明确其防病促生效应。【方法】采集健康辣椒根围土壤样品,以辣椒根腐病病原真菌茄镰孢(Fusarium solani)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板对峙法筛选生防细菌,采用选择性培养基筛选溶无机磷、溶有机磷、固氮菌和解钾菌等促生菌,钼锑抗比色法测定溶磷量,凯氏定氮法测定固氮量,火焰原子吸收光谱法测定解钾量。对特性良好组合的菌株进行16S rDNA序列分析鉴定并制作菌剂,最后采用盆栽法测定菌剂防病促生效果。【结果】共筛选得到323株特性良好的功能菌株,拮抗菌78株,溶有机磷菌87株,溶无机磷菌107株,固氮菌128株,解钾菌123株,部分菌株同时具有多个功能特性。互作组合得到6个特性良好的菌株组合,包括8株功能菌株,鉴定发现XP271和XP181为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),XP125为特基拉芽胞杆菌(Bacillus tequilensis),XP236为耐盐芽胞杆菌(Bacillus halotolerans),XP79为巨大芽胞杆菌(Bacillus ...     

基于可培养法分析亚热带植物内生与根际芽胞杆菌种类分布异质性

【背景】芽胞杆菌是农业上重要的微生物菌剂,对植物具有促生、防病、防虫等作用。【目的】了解亚热带植物内生和根际芽胞杆菌的种群分布,为其功能挖掘提供科学依据。【方法】采用可培养手段对甘蔗(Saccharum officinarum)、红麻(Hibiscus cannabinus L.)、黄麻(Corchorus capsularis L.)、黄秋葵(Abelmoschus esculentus)和玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)根际土壤和根内生芽胞杆菌进行分离,利用16S rRNA基因测序对分离菌株进行分类鉴定,并分析系统发育地位。【结果】共获得了可培养芽胞杆菌菌株144株,其中根内生芽胞杆菌82株,根际土壤62株。经16S rRNA基因测序鉴定为芽胞杆菌4个属37个种,分别为芽胞杆菌属、短芽胞杆菌属、类芽胞杆菌属和赖氨酸芽胞杆菌属。芽胞杆菌菌落数量和种类在根部及其根际土壤中差异较大,根际土壤中芽胞杆菌菌落数量远远大于根部,根际土壤中芽胞杆菌菌落含量范围为(0.2-370.0)×10~5CFU/g,而根部为(0.1-81.0)×10~3 CFU/g。根部分离获得的芽胞杆菌种类远大于根际土壤中,从作物根际土壤中共获得了芽胞杆菌19个种,从根部获得内生芽胞杆菌共32个种。阿氏芽胞杆菌(Bacillus aryabhattai)、仙草芽胞杆菌(Bacillus mesonae)和假蕈状芽胞杆菌(Bacillus pseudomycoides)同时存在于4种作物的根际土壤和根部,其他芽胞杆菌种类仅存在于1种作物的根际或者根部。【结论】亚热带作物根际土壤和根部芽胞杆菌种类和数量极为丰富,而且还存在可分离培养的芽胞杆菌潜在新物种,这为了解植物与根际微生物相互作用、根际环境生态平衡提供了理论基础和科学依据。     

贵州半夏块茎腐烂病拮抗细菌的筛选与鉴定

【目的】从半夏根际土壤筛选对半夏块茎腐烂病致病菌有拮抗活性的细菌并进行鉴定。【方法】采用稀释分离法和平板对峙法分离拮抗菌,然后根据菌落形态、生理生化特性,结合分子生物学方法进行鉴定。【结果】从半夏根际土壤共分离到228株细菌,其中菌株GZDF2、GZDF3、GZDF4对病原细菌及病原真菌均有拮抗活性,抑菌圈大小达23 mm,并且抑菌谱广。经形态学观察、生理生化特性分析和分子生物学方法,将菌株GZDF2、GZDF3、GZDF4鉴定为短短芽胞杆菌(Brevibacillus brevis)。进一步采用gyr B和rpo B基因对3株短短芽胞杆菌进行聚类分析,结果显示GZDF3菌株与其他2株短短芽胞杆菌存在遗传差异。【结论】半夏根际土壤中分离到的3株短短芽胞杆菌抑菌活性强、抑菌谱广,具有开发成生防剂的潜力。     

宁夏产枸杞根际溶磷菌分离及溶磷能力分析

采用常用的PKO(无机培养基)和蒙金娜有机培养基,从宁夏枸杞(Lycium barbarumL.)根际分离具有溶磷能力的菌株,并利用溶磷圈法测定溶磷菌株的溶磷能力。从宁夏枸杞根际共分离出88株具有溶磷能力的菌株,其中溶解无机磷能力较强的菌株4株,其溶磷圈直经(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)从高至低依次是NQ2、NQ4、NQ3、NQ1,D/d值为3.02~1.85;菌株NQ2、NQ1、NQ3和NQ4对无机磷的溶磷强度分别为91.2、82.5、75.5和74.8μg.mL-1。所分离的4株具有较强无机磷溶解能力的菌株在微生物肥料的开发方面有潜在应用价值。     

土壤中可编码乌头酸异构酶的芽胞杆菌菌株筛选及鉴定

【目的】以芽胞杆菌(Bacillus)为筛选对象,分离土壤中可编码乌头酸异构酶(aconitate isomerase,AI)的革兰氏阳性(Gram positive,G+)菌株,以丰富对AI分布的科学认识,为其生物学功能研究奠定理论与材料基础。【方法】采用土样高温预处理法、含反式乌头酸(trans-aconitic acid,TAA)唯一碳源的ACO固体平板培养法,结合16S rDNA基因序列同源性分析,筛选能够编码AI的芽胞杆菌目的菌株。【结果】共分离得到22株能够利用TAA碳源的细菌菌株,成功鉴定了其中的16株,分别为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) 2株,阿氏芽胞杆菌(Bacillus aryabhattai) 7株,短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus) 1株,未鉴定到种的芽胞杆菌(Bacillus sp.) 6株;且它们所含AI编码基因与已知AI基因在序列上存在差异。【结论】首次证明可编码AI的芽胞杆菌细菌种类具有多样性,暗示G+细菌广泛编码AI的可能性,更新了AI几乎只在G–细菌中分布的观点,为后续深入挖掘AI基因及其生物学功能研究提供更多可用微生物资源。     

解淀粉芽胞杆菌PHODB35的溶磷特性及其对番茄的促生作用

【目的】从种植番茄的根围土壤中筛选高效溶磷细菌,为减施化学肥料和开发微生物肥料提供溶磷菌种资源,并初步探索其促生机制。【方法】采用无机磷培养基利用梯度稀释涂布法从土壤中分离筛选促生菌株,通过形态特征、16S rRNA和gyrB基因序列分析对优良促生菌株进行鉴定,并分别利用正交试验和单因素试验分析环境因子和营养因子对其溶磷效果的影响,进一步利用HPLC-MS并结合相应有机酸的标准物质,明确优良促生菌株产生的有机酸种类;盆栽试验测定接菌处理后番茄株高、地上鲜重、地下鲜重、基质和植株有效磷含量评价菌株对番茄的促生作用。【结果】筛选到1株优良的促生菌株,命名为PHODB35,鉴定其为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。对环境因子的正交试验结果表明,菌株PHODB35最佳溶磷条件为pH 7.0,温度为30°C,接种量为5%;对营养因子的单因素试验结果表明,该菌株以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源、磷酸钙为磷源时,解磷效果最好,有效磷浓度为88.77mg/L。明确了菌株PHODB35产生的有机酸为葡萄糖酸。盆栽实验结果表明,菌株PHODB35对番茄幼苗有明显的促生作用,与空白对照相比,施用菌株后对株高、地上鲜重、地下鲜重、基质和植株有效磷含量分别增加28.21%、22.59%、113.06%、45.08%和16.24%,表明菌株PHODB35具有一定的肥效功能,可用于促生菌剂的研制。【结论】筛选到具有促生能力的解磷细菌,为进一步开发研制番茄促生菌剂或微生物有机肥提供资源,为菌株PHODB35在农业生产中的应用提供了理论依据和实验基础。     

烤烟根际烟碱降解细菌的多样性及其促生特性分析

【背景】挖掘兼具烟碱降解和植物根际促生细菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria,PGPR)功能的细菌资源,有助于保护土壤质量,实现绿色种植。【目的】分析烤烟根际细菌多样性,筛选可降解高浓度烟碱的PGPR。【方法】采用纯培养法在选择性培养基上分离烟碱降解细菌。通过BOXA1R-PCR分析技术、16SrRNA基因测序及系统发育树构建,对菌株的遗传多样性和分类学地位进行分析。进一步评价了菌株的吲哚乙酸(Indole-3-Acetic Acid,IAA)活性、溶磷能力、病原菌拮抗能力等PGPR指标,以筛选出高效PGPR,最后通过盆栽试验验证其促生效果。【结果】分离得到58株烟碱降解细菌,根据BOXA1R-PCR指纹图谱选取11株菌进行16S rRNA基因序列测定,结果表明,58株菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拉乌尔菌属(Raoultella)和短波单胞菌属(Brevundimonas)4个属,以芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。58株细菌中48.28%的菌株可产IAA,27.59%具备溶磷能力,37.93%具备纤维素降解能力,G2-13、G2-3及HT2-8因促生与抗病特性突出而被筛选为目标功能菌。盆栽试验结果表明,G2-13菌株对幼苗生长的促进作用明显,可使株高与地上部鲜重分别增加33.05%与53.32%。【结论】烤烟根际存在较为丰富多样的烟碱降解细菌,它们在种植业上具有潜在的应用价值。     

一株连香树根际促生细菌LWK2的分离鉴定及其全基因组序列分析

【背景】植物根际促生细菌是一类位于植物根际并能对植物生长产生促进作用的有益菌,在微生物肥料领域具有重要的应用价值。【目的】对濒危植物连香树根际的植物根际促生细菌进行分离筛选和连香树接种效应评价,挑选对连香树生长促进作用最为显著的菌种进行促生特性分析、菌种鉴定及全基因组序列测定与促生相关基因分析。【方法】利用相应筛选培养基对连香树根际土壤中解有机磷、溶无机磷和解钾细菌进行分离筛选,通过根际接种验证各菌株对连香树实生苗的促生能力。从中选取促生作用最为显著的细菌,进行解钾能力、产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)和1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)脱氨酶能力测定。利用菌体形态观察、16S rRNA基因序列分析及全基因组序列的平均核苷酸一致性比对进行菌种鉴定。最后利用基因组功能注释和比较基因组学分析对该菌株中的植物促生及重金属抗性相关基因进行解析。【结果】从连香树根际土壤中共筛选得到3株解有机磷细菌、2株溶无机磷细菌和2株解钾细菌,其中解钾细菌LWK2对连香树实生苗的生长促进作用最为显著。该菌株能够产...     

关防风根腐病拮抗细菌筛选与鉴定

【背景】由木贼镰刀菌[Fusarium equiseti(Corda)Sacc.]引起的关防风根腐病,是近年来导致关防风产量及质量下降的主要土传病害之一。生物防治因其对环境安全及人畜无害等优势,成为目前植物病害防治的一种有效手段。【目的】挖掘关防风根际土壤中对木贼镰刀菌具有良好拮抗作用的生防菌株。【方法】采用稀释平板法分离根际土壤细菌;用滤纸片法和牛津杯法对拮抗细菌进行筛选和抑菌谱检测;用抗生素标记法标记拮抗细菌并测定其定殖能力;通过盆栽实验研究其对关防风根腐病的防效;通过形态学、生理生化特征及16S rRNA基因序列确定分类学地位。【结果】从健康关防风根际土壤中分离纯化了157株细菌,筛选获得对关防风根腐病菌具有显著抑菌作用的拮抗细菌SC-119,无菌滤液的抑菌率可达68.53%,而且兼具广谱抑菌能力和良好的定殖能力;盆栽实验表明,菌株SC-119对关防风根腐病的防治效果达到67.39%,其相对防效较接种哈茨木霉菌剂、枯草芽胞杆菌菌剂和代森锰锌分别提高了29.03%、32.26%和16.13%;对菌株SC-119进行分类学鉴定,确定其为萎缩芽胞杆菌(Bacillus atrophae...     

南方红豆杉产IAA内生芽胞杆菌的分离、鉴定及产脂肽类化合物研究

通过组织研磨法对南方红豆杉(Taxus wallichiana var. mairei)新鲜组织进行内生细菌的分离，利用16S rRNA测序技术对分离的内生细菌进行鉴定分析，使用高效液相色谱-高分辨飞行质谱测定菌液提取物IAA含量，利用HPLC-TOF-MS对提取物脂肽类化合物进行分离、鉴定，结合数据库筛选菌株产脂肽类化合物种类及含量差异。结果表明，从南方红豆杉根茎叶中共分离鉴定出内生细菌31株，筛选出产IAA菌株20株，其中编号为KLBMPTC10的芽胞杆菌属菌株产IAA含量高达210.3955 μg·L^-1。在对产IAA菌株所产脂肽类化合物的研究中发现，菌株KLBMPTC10是所有产IAA内生细菌中脂肽类化合物含量最丰富的，其产Iturin A2相对含量为26.06%，明显优于其他产IAA菌株。芽胞杆菌属菌株KLBMPTC10同时具备高产IAA和脂肽类化合物的能力，可作为研究菌株进一步开发。     

Inoculations with Pseudomonas fluorescens and Bacillus cereus affect the soil enzyme activity,growth and rhizosphere microbial diversity of Taxus chinensis var. mairei

Plant and Soil - Taxus chinensis var. mairei is a rare tree endemic to China. Pseudomonas fluorescens CLW17 and Bacillus cereus CLY07 were isolated from the T. chinensis var. mairei rhizosphere and...     

植物内生真菌抗肿瘤活性菌株的筛选*

从三尖杉、南方红豆杉及香榧中分离到172株植物内生真菌,利用抗肿瘤体外细胞毒筛选模型(MTT法)对其进行活性检测。结果表明,25株内生真菌(占总分离菌株的14.5%)对KB（人口腔上皮癌）或HL-60（人白血病）细胞具有显著的抑制活性。三尖杉、南方红豆杉及香榧内生真菌的抗肿瘤活性菌株占各供测菌株的3.3%, 19.6%和8.6%。其中7个菌株的细胞毒ID50为1,000以上,占总供测菌株的4.1%。抗肿瘤活性菌株主要分布在拟青霉属及头孢霉属中。     

南方红豆杉毛状根诱导体系的建立及毛状根中 紫杉醇的分离纯化研究

目的:研究发根农杆菌对南方红豆杉转化的转化体系和毛状根中紫杉醇的提取纯化工艺;方法:采用发根农杆菌对南方红豆杉不同外植体进行诱导,并对影响毛状根转化的因素进行分析。采用超临界CO2流体萃取法、硅胶柱色谱法以及高效液相法对毛状根中的紫杉醇进行分离提纯;结果:成功构建了南方红豆杉毛状根诱导体系。其中农杆菌的种类、外植体类型、预培养和共培养时间、培养基中激素浓度均影响毛状根的转化率。毛状根经高压纸电泳检测显示表达冠瘿碱。毛状根中紫杉醇经超临界CO2法提取及硅胶柱色谱法分离提纯,采用高效液相法分析显示其纯度可达到98%。结论:发根农杆菌诱导南方红豆杉产生的毛状根中可产生紫杉醇,可作为紫杉醇的主要来源。     

1株产紫杉醇内生真菌LNUF014的鉴定及产物检测

从红豆杉的韧皮部组织中分离得到的360株内生真菌中,通过对发酵粗提的检测,共筛选到11株产紫杉醇的真菌。其中1株内生真菌LNUF014的发酵液采用有机试剂抽提紫杉醇,经薄层层析和高效液相色谱分析,初步表明该菌株的紫杉醇类物质含量为53.68μg/L。根据形态学研究和真核生物18S rDNA基因序列分析,将其鉴定为镰刀菌属(Fusarium)。产紫杉醇内生真菌的研究将对紫杉醇类抗肿瘤药物的研制具有重要意义。     

云南滇池富磷区趋化性细菌的系统多样性

从云南滇池富磷区100份土样中筛选解磷细菌(PSB),通过组氨酸激酶编码基因(cheA)筛选趋化性PSB,并通过软琼脂平板法验证其趋化性;利用钼蓝比色法测定PSB对磷酸三钙的溶解能力;基于16S rRNA基因序列分析趋化性PSB的系统亲缘关系.结果表明： 分离到的145株PSB的溶磷圈直径在0.5～2 cm,其中37株为趋化性PSB.该37株PSB对供试的4种趋化底物均具有趋化性,而且对磷酸三钙均具有解磷活性.基于16S rRNA基因序列的系统发育分析显示,这37株趋化性PSB分属于10属,共17种细菌,其中假单胞菌属种类最多(5种9株),肠杆菌属次之(3种8株),芽孢杆菌属尽管只分离到1个种(Bacillus aryabhattai),但共分离到9个菌株.     

山西历山珍稀药用植物AM真菌资源与土壤因子的关系

以山西历山自然保护区暴马丁香、连香树、南方红豆杉和领春木4种珍稀药用植物为材料,研究其根际土壤中丛枝菌根真菌(AMF)的菌根结构类型和种属分布,同时分析土壤因子与其侵染率和孢子密度的关系。结果表明:(1)暴马丁香菌根类型为中间型(I-型),连香树和领春木为重楼型(P-型),南方红豆杉为疆南星型(A-型);4种植物根际共鉴定AMF 27种,分别隶属于球囊霉属(Glomus)、无梗囊霉属(Acaulospora)、盾巨孢囊霉属(Scutellos-pora)、多孢囊霉属(Diversispora)和原囊霉属(Archaeospora)5属,其中Glomus为优势属。(2)pH与暴马丁香和领春木的侵染率和孢子密度呈正相关,但与连香树和南方红豆杉呈负相关;速效磷与暴马丁香、南方红豆杉和领春木的侵染率和孢子密度呈正相关,但与连香树呈负相关;碱解氮、有机质与暴马丁香、连香树和领春木的侵染率和孢子密度呈正相关,但与南方红豆杉呈负相关。(3)4种药用植物的菌根侵染率主要受其根际土壤碱解氮的影响,而根际AMF孢子密度主要受根际土壤pH制约。可见,历山自然保护区内AMF资源丰富,多样性程度也较高;宿主植物不同,土壤因子对其侵染率和孢子密度的影响也不同。     

南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离

对从广东乳源县的南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)内生真菌中分离和筛选产紫杉醇的内生真菌进行了研究。从南方红豆杉的树皮、茎部、叶片及叶片研磨物中分离纯化了145株内生真菌,对其中的53株内生真菌采用摇瓶发酵培养的方法筛选产紫杉醇的内生真菌。发酵物和菌丝体经研磨、离心、乙酸乙酯萃取和浓缩,经硅胶薄层层析(TLC),高效液相色谱(HPLC)以及液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析和检测,结果表明,从茎部分离的1株内生真菌能够产紫杉醇或其异构体, 产量达180 μg L^-1。通过对产紫杉醇内生真菌进行诱变、筛选以及优化培养条件等措施,大规模培养生产紫杉醇是具有可行性的。     

南方红豆杉丛枝菌根(AM)的研究

研究了南方红豆杉根部丛枝菌根真菌(AMF)侵染情况、菌根形态结构以及根际土中AMF孢子的种类与数量.结果显示:南方红豆杉可与AMF形成典型的丛枝-泡囊型菌根,侵染率在71.2%~94.4%,但是历山、蟒河自然保护区的侵染强度优于人工栽培区;在南方红豆杉根际土中共分离鉴定出5种AMF,无梗囊霉属1种、球囊霉属4种,分别是:光壁无梗囊霉、地表球囊霉、地球囊霉、缩球囊霉、明球囊霉,其中光壁无梗囊霉为优势种;南方红豆杉的根由表皮、外皮层、内皮层、中柱组成,AMF只侵染表皮层、内皮层,不能侵染中柱.这为将来利用AMF接种技术进行南方红豆杉的繁殖、移植栽培以及紫杉醇的积累等研究提供了理论依据.     

青海可可西里嗜碱芽胞杆菌资源调查

【目的】了解可可西里嗜碱芽胞杆菌资源多样性及产酶多样性,为芽胞杆菌功能资源挖掘和菌剂开发提供基础。【方法】采用Horikoshi I培养基,通过可培养法分离青海可可西里土壤中的嗜碱芽胞杆菌,利用16S r RNA基因序列初步鉴定分离获得的芽胞杆菌。采用透明圈法分析分离菌株的产蛋白酶、纤维素酶及木聚糖酶活性。【结果】从青海可可西里土壤中共分离获得66株嗜碱芽胞杆菌,根据16S r RNA基因序列相似性分析,发现它们隶属于6个属22个种,分别为芽胞杆菌属(Bacillus)、纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽胞杆菌属(Halobacillus)、咸海鲜芽胞杆菌属(Jeotgalibacillus)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)和嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillus),其中以芽胞杆菌属(Bacillus)为优势属。2株嗜碱芽胞杆菌与它们最近匹配模式菌株的16S r RNA基因序列相似性为97.00%和98.65%,为潜在新种。三种酶活检测结果表明产酶菌株约占总分离菌株的95.00%,其中55株具有产蛋白酶活性,27株具有产纤维素酶活性,8株能够产木聚糖酶。【结论】青海可可西里蕴藏着较丰富的嗜碱芽胞杆菌资源及丰富的产酶资源,为后续嗜碱芽胞杆菌的挖掘提供理论基础。