α-溶血素的表达及其纳米孔的制备

α-溶血素(α-hemolysin,αHL)是金黄色葡萄球菌分泌的一种水溶性穿孔毒素,在双脂膜上可组装成结构稳定的七聚体蛋白纳米孔,是理想的单分子检测器件。以大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S作为表达宿主菌株诱导表达野生型和单位点突变型α-溶血素,超滤膜分子截留法纯化蛋白质,使用兔血红细胞膜将αHL单体组装成七聚体蛋白纳米孔,并在人工脂双层膜上构建适于单分子分析的分子器件。通过溶血实验和单通道电流记录,证实αHL溶血活性良好,组装的αHL七聚体纳米孔在双脂膜上打孔能力和离子通透性良好,结构稳定,可作为理想的单分子检测器件。此方法为大量制备αHL单体及其在单分子分析和应用研究方面奠定了基础。     

啮齿类动物视觉电生理检测方法

作为合适的分子遗传操作哺乳动物模型，啮齿类动物凭借其多方面的优点，已被广泛应用于眼病的实验模型中。近年来在先前定性评估视觉方法的基础上，学者又提出了多种量化动物视觉的新方法。本文将探讨动物视觉电生理检测方法及其在啮齿类实验动物模型中的应用。     

硅烷化修饰的固态纳米孔

作为一种重要的单分子检测技术,纳米孔的表面特性至关重要。作者利用聚焦离子束刻蚀方法制备得到了一系列形貌可控的氮化硅纳米孔,并对纳米孔进行了表面改性修饰。结果发现,经过化学处理的氮化硅表面具有大量的硅羟键,非常利于和硅烷发生反应,从而在纳米孔表面引入活性基团,如氨基、正辛基和巯基等。通过对修饰有不同硅烷的纳米孔的表面特性和电导特性的研究发现,当硅烷分子将氮化硅表面的硅羟键变为其它功能基团时,材料表面电荷会发生变化,亲、疏水性也发生变化,从而导致电渗流的改变,影响纳米孔的电导。同时,修饰硅烷分子后,材料表面的电荷特性发生了改变,也会导致纳米孔器件的膜电容减小,介电噪声降低。     

细胞膜表面单分子事件的实时观察

单分子实时检测以高分辨率显微镜及纳米操作技术为支撑,实现在微观世界单分子水平探索和阐明生命现象的本质,进而展现生命科学的全景。本文综述了近年来单分子成像和检测领域的技术进展,以及将这些技术和创新方法在活细胞膜表面单分子事件研究中的应用,如蛋白质扩散、蛋白折叠动力学、膜受体装配及近膜区囊泡运动等。     

BK通道在细胞膜上的单分子定位及空间分布*

摘要目的：研究大电导、钙离子和电压激活的钾离子通道（BK通道）在HEK293 细胞膜上的单分子定位及其总体空间分布情况。 方法：分别用mEos2、Dronpa 等荧光蛋白标记BK通道的α亚基和辅助性β2 亚基,将这些质粒在HEK293 细胞内瞬时转染以表 达通道蛋白,然后用激光共聚焦荧光显微成像、全内反射荧光显微成像、光敏定位荧光成像等技术观察BK通道的亚细胞定位及 单分子分布,并用电生理实验技术检测荧光蛋白对BK通道有影响。结果：激光共聚焦荧光显微成像和全内反射荧光显微成像技 术只能在亚细胞水平定位通道蛋白,BK 通道在细胞膜上聚集并形成不规则的蛋白簇,它的α亚基和β2 亚基在细胞膜上完全共 定位;光敏定位荧光成像技术成功定位BK通道蛋白簇里面的单分子,虽然α和β2 亚基紧紧靠在一起,它们之间依然存在空间 距离;BK通道的质膜表达和功能特性不受荧光蛋白的影响。结论：BK通道蛋白簇里面包含大量的α和β2 亚基的蛋白单分子, 它们紧密地聚集在一起,但是并没有完全共定位,在分子水平上揭示了BK通道α和β亚基功能耦合的结构基础,为以后研究大 分子蛋白质间的相互作用机制提供了很好的分子模型,光敏定位荧光成像技术作为一种全新的单分子荧光成像手段,在基因表 达、信号通路、蛋白质相互作用等许多重要生命活动的研究中发挥重要作用。     

BK通道在细胞膜上的单分子定位及空间分布

目的：研究大电导、钙离子和电压激活的钾离子通道（BK通道）在HEK293细胞膜上的单分子定位及其总体空间分布情况。方法：分别用mEos2、Dronpa等荧光蛋白标记BK通道的α亚基和辅助性β2亚基,将这些质粒在HEK293细胞内瞬时转染以表达通道蛋白,然后用激光共聚焦荧光显微成像、全内反射荧光显微成像、光敏定位荧光成像等技术观察BK通道的亚细胞定位及单分子分布,并用电生理实验技术检测荧光蛋白对BK通道有影响。结果：激光共聚焦荧光显微成像和全内反射荧光显微成像技术只能在亚细胞水平定位通道蛋白,BK通道在细胞膜上聚集并形成不规则的蛋白簇,它的仅亚基和β2亚基在细胞膜上完全共定位;光敏定位荧光成像技术成功定位BK通道蛋白簇里面的单分子,虽然α和β2亚基紧紧靠在一起,它们之间依然存在空间距离;BK通道的质膜表达和功能特性不受荧光蛋白的影响。结论：BK通道蛋白簇里面包含大量的α和β2亚基的蛋白单分子,它们紧密地聚集在一起,但是并没有完全共定位,在分子水平上揭示了BK通道α和p亚基功能耦合的结构基础,为以后研究大分子蛋白质间的相互作用机制提供了很好的分子模型,光敏定位荧光成像技术作为一种全新的单分子荧光成像手段,在基因表达、信号通路、蛋白质相互作用等许多重要生命活动的研究中发挥重要作用。     

蛋白质在固态纳米孔中的易位行为

纳米孔是目前单分子检测的一项重要技术。除了DNA,蛋白质也成为纳米孔研究的重点对象。作者以血清蛋白为例,研究了蛋白质在氮化硅纳米孔中的易位行为,并对蛋白质的易位事件进行了分析。和DNA相比,蛋白质本身的荷电和结构特性,使其进入纳米孔的通量较低,同时,蛋白质和纳米孔表面存在吸附现象,减慢了蛋白质在纳米孔中的易位速度。当电压增大时,蛋白质的易位事件增加,过孔速度加快,吸附现象减弱。不过,在高电压下,蛋白质在电场力的拉扯下构象发生变化,出现部分或者全部解折叠。这些结果表明纳米孔提供了一个独特的获得蛋白质结构和功能信息的检测平台,可为蛋白质相关疾病的诊断和治疗提供技术支持。     

应用飞秒时间分辨瞬态吸收光谱研究蛋白质中距离相关长程电荷转移:光合细菌天线复合体LH2与TiO2纳米颗粒超分子组装体个例初探

蛋白质在生物体内电荷转移过程中所起的作用迄今仍然是一个有争议的问题.其争论焦点是蛋白质在生物电荷转移过程中是否提供特殊的电子传递通道或者是仅仅作为普通的有机介质.应用飞秒时间分辨瞬态吸收光谱研究由光合细菌天线分子和平均粒径为8 nm的TiO2组装而成的超分子系统中长程电荷转移.晶体结构研究表明,光合细菌天线分子具有由多个α-脱辅基和β-脱辅基蛋白跨膜螺旋构成的双层空心柱面体结构,其中α-脱辅基蛋白跨膜螺旋构成的小环状体套于β-脱辅基蛋白跨膜螺旋构成的大环状体中.小环状体的空腔直径约为3.6 nm.光合色素细菌叶绿素和β-胡萝卜素分子处于两环之间.细菌叶绿素距离外周胞质膜最近,预计为1 nm.本研究试图将TiO2纳米颗粒部分装入光合细菌膜蛋白的腔体中,探讨细菌叶绿素与TiO2纳米颗粒间进行的光致长程电荷转移,进而揭示蛋白质在电荷转移过程中所起的作用.实验观察到细菌叶绿素B850在LH2/TiO2中的基态漂白恢复的时间常数明显地比在LH2中短,应用长程电荷转移模型,将蛋白质视为普通介电媒体,由电荷转移速率推算得到细菌叶绿素与TiO2纳米颗粒最近表面的距离为0.6 nm,表明TiO2纳米颗粒已经成功地部分装入光合细菌天线分子的空腔中.     

应用飞秒时间分辨瞬态吸收光谱研究蛋白质中距离相关长程电荷转移：光合细菌天线复合体LH2与TiO2纳米颗粒超分子组装体个例初探

蛋白质在生物体内电荷转移过程中所起的作用迄今仍然是一个有争议的问题,其争论焦点是蛋白质在生物电荷转移过程中是否提供特殊的电子传递通道或者是仅仅作为普通的有机介质。应用飞秒时间分辨瞬态吸收光谱研究由光合细菌天线分子和平均粒径为8nm的TiO2组装而成的超分子系统中长程电荷转移,晶体结构研究表明,光合细菌天线分子具有由多个α-脱辅基和β-脱辅基蛋白跨膜螺旋构成的双层空心柱面体结构,其中α-脱辅基蛋白跨膜螺旋构成的小环状体套于β-脱辅基蛋白跨膜螺旋构成的大环状体中,小环状体的空腔直径约为3.6nm。光合色素细菌叶绿素和β-胡萝卜素分子处于两环之间。细菌叶绿素距离外周胞质膜最近,预计为1nm。本研究试图将TiO2纳米颗粒部分装入光合细菌膜蛋白的腔体中,探讨细菌叶绿素与TiO2纳米颗粒间进行的光致长程电荷转移,进而揭示蛋白质在电荷转移过程中所起的作用。实验观察到细菌叶绿素B850在LH2/TiO2中的基态漂白恢复的时间常数明显地比在LH2中短,应用长程电荷转移模型。将蛋白质视为普通介电媒体。由电荷转移速率推算得到细菌叶绿素与TiO2纳米颗粒最近表面的距离为0.6nm。表明TiO2纳米颗粒已经成功地部分装入光合细菌天线分子的空腔中。     

银染增强的纳米金标记探针对微量核酸的检测

本研究利用银染增强的纳米金技术建立了一种简单快速的核酸定量方法.该方法基于纳米金与烷巯基修饰的寡核苷酸分子共价键合作用,将纳米微粒报告基团标记在与靶核酸一端序列互补的寡核苷酸上,同时生物素化修饰另一端互补序列.靶核酸与两段寡核苷酸探针杂交后,借亲和素固定在酶标板孔内,通过纳米金催化的银染放大效应产生高灵敏的识别信号,适时记录其吸光度值从而实现核酸分子的定量.该检测方法检测单链核酸分子的灵敏度达0.1 fM,双链分子为10 fM.