茅苍术两个HMGR基因(AlHMGR)的克隆与分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是植物萜类化合物生物合成的关键酶,在茅苍术挥发油生物合成过程中起重要作用,但目前茅苍术AlHMGR全长序列尚不清楚。本研究在前期茅苍术转录组学研究的基础上,筛选AlHMGR序列,并进行其c DNA序列的全长克隆,然后分析AlHMGR的序列特征及其编码蛋白的结构特征。结果显示,所得两条AlHMGR全长cDNA序列分别为1 749 bp和1 770 bp,分别编码582个和589个氨基酸;系统进化分析表明与菊科植物朝鲜蓟亲缘关系最近。本研究还探讨了AlHMGR编码蛋白的氨基酸序列特征、蛋白结构特征及亚细胞定位。本研究结果为进一步阐明茅苍术萜类化合物生物合成和调控的分子机制提供了理论依据。     

丝颖针茅ScTIP1;1基因的克隆及对非生物胁迫的应答

利用丝颖针茅(Stipa capillacea Keng)一条EST序列并结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆了丝颖针茅的一个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因ScTIP1;1的全长编码区序列。该基因开放阅读框长度为753 bp,编码250个氨基酸,其蛋白质分子量为25.8 kD,理论等电点为6.16;序列比对及系统进化分析表明,ScTIP1;1和拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtTIP1;1蛋白的亲缘关系较近;亚细胞定位结果显示,该蛋白位于液泡膜上;实时荧光qRT-PCR检测表明,盐、干旱及低温胁迫可诱导ScTIP1;1基因的表达,且低温处理后基因的表达量变化最为明显。本研究结果为理解丝颖针茅的生态适应性提供了理论依据。     

大豆再生相关基因GmBIN2的克隆及生物信息学分析

根据前期实验获得的大豆Gm BIN2基因登录号,从大豆中克隆Gm BIN2基因的全长CDS序列,得到大豆Gm BIN2基因。对大豆再生相关基因Gm BIN2的启动子序列、氨基酸序列、编码的蛋白质结构、亲疏水性以及同源进化树进行分析,结果表明,大豆再生相关基因Gm BIN2编码区c DNA长度为1 125 bp,编码374个氨基酸,Gm BIN2编码的蛋白为亲水性蛋白;分析其蛋白功能结构域发现,Gm BIN2蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化域,为PKc-like超家族成员;构建系统进化树发现其与野生大豆亲缘较近。本研究的实验结果有利于更加深入的研究Gm BIN2基因在大豆再生过程中的关键作用,为提高大豆再生效率提供依据。     

家鸡G蛋白偶联受体78基因的克隆与组织表达图谱分析

G蛋白偶联受体(GPCR)是一大类膜受体超家族,参与了机体几乎所有的生理过程,是一类重要信号分子受体。GPR78作为GPCR超家族的成员之一,属于孤儿型受体。目前,在脊椎动物中,针对该基因结构与功能的研究极少。本研究以家鸡为动物模型,通过RT-PCR方法克隆了GPR78基因的编码区序列,并探究了该基因在家鸡各组织中的表达情况。结果显示:家鸡GPR78基因编码区全长为1020 bp,含3个外显子,可编码1个长为339个氨基酸的7次跨膜受体;该基因在家鸡脑各功能区及垂体中高表达,而在其他外周组织中均不表达。本研究为后续探究GPR78基因在家鸡中的生理功能奠定基础。     

紫花针茅WRKY53基因的克隆、序列分析及功能鉴定

植物WRKY转录因子家族在叶片衰老中起着重要的调节作用,其成员WRKY53基因与叶片衰老密切相关。本文利用紫花针茅(Stipa purpurea Griseb.)的一条EST序列,克隆获得Sp WRKY53基因的全长CDS序列,其开放阅读框为1443 bp,编码480个氨基酸,蛋白质分子量为50.9 k D,理论等电点为7.64。序列比对结果和系统进化分析表明,Sp WRKY53基因有2个WRKY序列,与已报道的小麦(Triticum aestivem L.)的WRKY53基因结构相似。亚细胞定位结果显示该蛋白定位于细胞核上。紫花针茅WRKY53基因的过表达以及表达分析表明,该基因能够加速植物叶片衰老并在多种非生物胁迫下上调表达。本研究为WRKY53基因在牧草分子育种中的进一步研究奠定了基础。     

三角帆蚌金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

采用RACE技术,获得了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)金属硫蛋白基因的全长cDNA序列.该序列全长467 bp,由长92 bp的5'UTR(untranslated region),159 bp的3'UTR,和216 bp的开放阅读框(openreading frame,ORF)组成.共编码71个氨基酸,分子量大约为7.1 ku,理论等电点为7.24.该蛋白序列中半胱氨酸含量最丰富(29.6%),其次是甘氨酸(14.1%),存在软体动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX,且C-末端的氨基酸序列也符合软体动物金属硫蛋白标签序列C-X-C-X(3)-C-T-G-X(3)-C-X-C-X(3)-C-X-C-K.蛋白序列特征分析表明,该序列与其他贝类的金属硫蛋白基因具有很高的相似性,具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员.     

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

决明丙二酰CoA:ACP转酰基酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆决明丙二酰Co A:ACP转酰基酶(MCAT)基因并做序列分析。[方法]采用RACE法从c DNA中扩增出决明丙二酰Co A:ACP转酰基酶(MCAT)的CDS全长序列,推测出MCAT基因编码的氨基酸序列并进行序列分析。[结果]分析结果显示MCAT的CDS全长1 253bp,编码405个氨基酸。通过序列比对分析发现决明MCAT蛋白包含一个酰基转移酶超家族结构域,并且发现了一段高度保守的七肽模序。[结论]获得了决明MCAT的CDS全长,其编码的蛋白可能催化丙二酰Co A的转酰基反应,为决明脂肪酸的合成通路的阐明以及后期的决明脂肪酸的基因工程研究打下了坚实的基础。     

一种新的短链脱氢/还原酶家族新成员:NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因的克隆和分析

从牛的肝脏中快速抽提总RNA,根据GenBank已发表NADP(H)-依赖的视黄醇脱氢酶基因(NRDR)的cDNA序列,设计并合成特异引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),得到牛肝内的NRDR cDNA的全长序列。经测序证实,牛肝NRDR的全长cDNA序列为1266bp,其开放读码框架在24～806bp,编码260个氨基酸(GenBank登录号：AF487454)。根据NRDR基因推导出的氨基酸序列与人、鼠、兔有高度同源性,并含有SDR超家族成员的两个高度保守的模序,在其C-端含有过氧化物酶体的靶向序列为SHL。结果表明,牛的NRDR应属于过氧化物酶体内SDR超家族成员并在维甲酸合成的限速步骤起作用的酶,也为维甲酸合成的传统通路提供一个补充。     

毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子.cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORE长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15.在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394.氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域.将获得的漆酶基因lacl与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带.结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lacl为漆酶基因.