橡胶树炭疽菌蛋白激酶A催化亚基基因的克隆及表达

为了解蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)的生长发育和致病性中的功能。本研究利用同源克隆法设计引物,采用PCR和RT-PCR的方法获得炭疽菌(C. siamense)的PKA两个催化亚基PKA-C1与PKA-C2,并基于RSF-Duet载体构建两基因原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达,利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果表明:催化亚基PKA-C1编码498个氨基酸,包含3个内含子;PKA-C2基因编码381个氨基酸,包含2个内含子;两基因均含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和S_TK_X;聚类分析显示两基因与胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)依赖cAMP蛋白激酶催化亚基序列有高度同源性。SDS-PAGE检测表明目的基因在大肠杆菌中可成功表达,大小符合预期。本研究结果为进一步分析炭疽菌的PKA催化亚基基因功能提供了帮助。     

水蕨中心体蛋白基因的克隆与原核表达

蕨类植物的精子形成是一个运动细胞器重新发生的过程,但对其精子发生的分子机制仍不甚了解。中心体蛋白(centrin)是定位于细胞中心体上的一种高度保守的钙结合蛋白,被认为可能是最早参与运动细胞器发生的蛋白质。克隆鉴定centrin蛋白为进一步分析蕨类精子发生的分子机制奠定基础。该研究从蕨类模式植物水蕨(Ceratopteris thalictroides)中克隆到了水蕨centrin基因(CtCEN),其cDNA序列全长为1 077bp,结构分析表明CtCEN基因属于EF-hand超家族的centrin基因。Centrin的系统树分析发现,藻类、蕨类以及动物等具鞭毛游动精子的生物聚为一支,而被子植物聚为另一分支,表明centrin的功能可能与运动细胞器鞭毛发生有关。原核表达和Western blot分析表明,CtCEN基因表达的蛋白能与人源centrin抗体发生结合,这一结果证实克隆到了centrin基因。     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

依据马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)外壳蛋白(CP)基因序列(885bp)设计合成了两对 引物,通过RT-PCR扩增得到长0.8kb的目的片段,将目的片段转入大肠杆菌,酶切鉴定证明 得到了含有目的片段的重组子,测定序列结果与其他PVS分离物CP基因的序列比较,发现其核苷酸同源性达95%左右;构建了含PVS CP基因的融合蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中得到表达,SDS-PAGE测定融合蛋白的分子量为58kD.     

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

依据马铃薯S病毒 (PotatovirusS ,PVS)外壳蛋白 (CP)基因序列 (885bp)设计合成了两对引物 ,通过RT PCR扩增得到长 0 .8kb的目的片段 ,将目的片段转入大肠杆菌 ,酶切鉴定证明得到了含有目的片段的重组子 ,测定序列结果与其他PVS分离物CP基因的序列比较 ,发现其核苷酸同源性达 95 %左右 ;构建了含PVSCP基因的融合蛋白原核表达载体 ,并在大肠杆菌中得到表达 ,SDS PAGE测定融合蛋白的分子量为 5 8kD。     

麦二叉蚜体内病毒结合蛋白基因的克隆和原核表达

从麦二叉蚜体内克隆了一个DNA片段,经序列测定表明该片段全长为1647bp,编码548个氨基酸.与禾谷缢管蚜的病毒结合蛋白基因核苷酸同源性为92%,氨基酸的同源性为96%,从而认为这是病毒结合蛋白基因(GenBank登录号为AF434719).构建了该基因的原核表达载体pBVSG和pETSG,用pBVSG表达出63kD的非融合目的蛋白,用pETSG表达出69kD的融合蛋白,二者均有较高的表达量.以纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了此病毒结合蛋白的抗血清,用琼脂双扩散法测定效价为1∶512.     

重组人钙网蛋白的克隆与原核表达

［摘要］目的: 克隆人钙网蛋白（calreticulin,CRT）并在E.coli中原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA,构建CRT原核表达质粒（pET-15b/CRT）并转化E.coli 的Rossetta菌株。IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA 树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定CRT表达和纯化状态。结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆,重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法,该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。     

橡胶树胞质型谷胱甘肽还原酶基因的克隆与表达分析

根据橡胶树GR1基因（Hb GR1）部分序列设计特异引物,运用RACE和RT-PCR技术克隆Hb GR1全长c DNA序列;运用DNAMAN、MEGA 6.06、Prot Param及Signal P 4.1 Server等生物信息学软件对Hb GR1序列、GR1系统进化关系及Hb GR1的基本理化性质和亚细胞定位等进行分析;利用实时荧光定量PCR技术研究Hb GR1的表达模式;构建原核表达载体p EASYE1-Hb GR1,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导融合蛋白原核表达。获得2 082 bp的Hb GR1全长c DNA,其中5′非编码区293 bp,3′非编码区298 bp,开放阅读框长1 491 bp,共编码496个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为53.68 k Da,理论等电点p I为6.18。序列分析发现Hb GR1无信号肽,在氨基酸水平上与其他植物GR1具有很高的同源性,包含植物GR典型的NADH结合结构域、二聚体结构域和高度保守的GGTCV[I/L]RGCVPKK[I/L]LVY基序。对植物GR进行系统进化分析表明,Hb GR1属于双子叶植物GR分枝,与同属大戟科的蓖麻亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明Hb GR1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达;Hb GR1表达受死皮、乙烯、茉莉酸、过氧化氢和伤害调控。SDS-PAGE电泳结果表明重组质粒p EASY-E1-Hb GR1在大肠杆菌BL21（DE3）中有效表达一个分子量约为55 k Da的融合蛋白。     

水稻甲基结合蛋白基因MBD701的克隆及原核表达

甲基结合域蛋白MBD作为与甲基化位点特异结合的重要反式作用因子,在植物生长发育中发挥着重要的调控作用.为了探讨MBD基因的结构与功能,利用RT-PCR方法克隆了水稻中编码甲基结合蛋白基因MBD701,构建了MBD701的原核表达载体pGEX-MBD701,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中实现了融合蛋白GST-MBD701的表达.结果表明,MBD701除了包含典型的甲基结合域(第138～212)外,还包含CW的锌指结构(第73～132);在37℃,1 mmol/L IPTG浓度条件下成功诱导表达了大小为65.87 kD的GST-MBD701融合蛋白,这为进一步开展MBD701的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.     

棉花HSP70基因的克隆与原核表达

以抗旱性较强的棉花品种‘KK1543’为材料,采用RT-PCR技术克隆了1个棉花HSP70基因,命名为GhHSP70。研究结果表明:GhHSP70基因开放阅读框长1 997bp,编码648个氨基酸,GhHSP70蛋白相对分子量为70.94kD,等电点为4.83。氨基酸序列比对和系统进化树分析发现,GhHSP70与欧洲大叶杨HSP70的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达到96.4%。为进一步分析基因的功能,构建原核表达载体pGEX-4T-1-GhHSP70,并在大肠杆菌中异源表达。SDS-PAGE分析表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致,重组蛋白在37℃,0.2mmol/L IPTG诱导2h时表达量最大。研究为进一步研究棉花HSP70基因功能奠定基础。     

橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因克隆及蛋白表达纯化

由橡胶树白粉菌引起的橡胶树白粉病是橡胶树的重要的叶部病害之一,严重影响橡胶的产量。然而目前对橡胶树白粉菌的致病机理研究匮乏。分支酸变位酶是莽草酸途径的关键酶,能够将分支酸转化为预苯酸,为植物提供氨基酸及大量代谢产物,在植物抗病中起到非常重要的作用。而植物病原物在致病过程当中能够分泌分支酸变位酶影响植物莽草酸途径,从而抑制植物的防卫反应。因此研究橡胶树白粉菌分支酸变位酶在其致病过程中的功能具有一定的意义。试验利用同源比对分析在橡胶树白粉菌基因组中获得一个分支酸变位酶同源蛋白,并用PCR克隆获得橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因,命名为OHCmu。后续构建GST-OHCmu融合原核表达载体,筛选最优诱导条件,并利用GST亲和层析柱对蛋白进行纯化。结果表明橡胶树白粉菌OHCmu基因大小843 bp,具有1个内含子,编码263个氨基酸;具有d5csma_结构域,属于Chorismate mutaseⅡ蛋白家族;GST-OHCmu融合蛋白外源诱导表达在供试条件下(IPTG:0.8 mmol/L, 16℃)可以有较好的表达,获得融合蛋白大小约为56 kD。经过GST亲和层析柱纯化、切割GST标签后,顺利获得浓度较高、较纯的橡胶树白粉菌OHCmu蛋白。研究结果为后续OHCmu蛋白的特性及致病机理研究提供参考。     

α-苦瓜素基因的克隆和原核表达

α-苦瓜素(Alpha-momorcharin)是一种多功能核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤、抗HIV-1和抗菌活性,并同时具有免疫抑制活性.利用PCR(polymerase chain reaction)技术从苦瓜基因组中扩增出了成熟的α-苦瓜素蛋白基因,并亚克隆到表达载体pET28a( )上,然后分别在BL21(DE3) 和RosettaTM(DE3)pLysS中进行表达.结果表明只在RosettaTM(DE3)pLysS中,重组α-苦瓜素基因能成功地表达出33 kD大小的重组蛋白,而且在18℃和22℃的温度下,经IPTG诱导后,能成功地表达出大量可溶性重组蛋白.利用重组蛋白的N末端带有的6×His 标签,通过Ni-NTA柱纯化获得了α-苦瓜素重组蛋白.Western杂交实验表明,纯化后的重组蛋白可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应.α-苦瓜素重组蛋白的获得为进一步系统研究和改造其功能与活性奠定了基础.     

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。     

龙眼花芽ANS基因的克隆与原核表达

运用蛋白质组学比较龙眼(Dimocarpus hngan Lour.)正常成花和成花逆转花芽的蛋白质组变化,结果表明,ANS蛋白(anthocyanidin synthase)在龙眼成花逆转花芽中下调表达.应用RACE方法克隆ANS蛋白的全长cDNA,长度为1477 bp,包括1个1071 bp的开放阅读框,编码357 bp的氨基酸序列,GenBmk的登录号为FJ479616(GI:218202927).将ANS在大肠杆菌中表达,获得1个约46 kD的外源蛋白.这说明ANS蛋白在龙眼成花逆转过程中起作用.     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT-PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因--黄酮醇合成酶(FLS)基因,在GenBank登录(GenBank accessionNo.EF205150),其序列全长1317 bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5kD,理论等电点为5.80.序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近.将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IFTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符.用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础.     

水牛MyD88cDNA的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞总RNA中扩增出髓样分化因子88 (mydoid differentiation factor 88,MyD88) cDNA序列,PCR产物分离纯化后,与pMD20-T载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析;构建pET28a-MyD88表达载体,并将其转化至E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、镍柱亲和层析纯化和Western blotting分析.结果显示,克隆到的水牛MyD88 cDNA全长为1 189 bp,含有1个891 bp的开放阅读框,编码296个氨基酸,理论等电点为5.65.经IPTG诱导表达后,得到一个带His·Tag的约39 kD的重组融合蛋白.用抗His单克隆抗体进行Western blotting,得到1条约39 kD特异性抗体结合带,表明水牛MyD88原核表达载体成功构建并表达.本研究为进一步开展水牛MyD88的结构功能分析奠定了基础.     

砂梨CONSTANS基因的克隆及原核表达分析

为了探索梨树植物的开花调控机制,本研究以砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)叶片为材料,采用同源序列克隆法,进行了开花调控相关基因CONSTANS的克隆,命名为PyCO,GenBank登录号为KF246572。序列分析表明,该基因包含一个1023 bp的开放阅读框,编码340个氨基酸,推测蛋白质分子量为37.81 kD,等电点为5.95。PyCO蛋白具有典型的植物CO家族的结构特征,含有2个高度保守的B-box及CCT结构域。进化树分析表明,该氨基酸序列与苹果的同源性接近93%,与碧桃、可可树、草莓等其他高等植物的CO类蛋白同源性也在70%以上。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白,分子量约为58.5 kD,为进一步探索梨树开花调控机理奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌生产菌株溶原性噬菌体pep基因的克隆、表达及功能分析

溶原性噬菌体的随机爆发是微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,B.t)发酵生产的首要危害.[目的]本文的目的就是通过研究B.t生产菌株溶原性噬菌体的遗传背景,以便从分子水平上控制其在生产中的随机爆发.[方法]通过对广东梅州某公司的生产菌株MZ1采用Mitomycin C进行诱导,提取噬菌体颗粒MZTP01的基因组DNA,克隆和表达该噬菌体的pep基因,并进行了功能分析.[结果]诱导获得的溶原性噬菌体MZTP01斑点清晰,直径约1mm,成斑时间12h;从噬菌体基因组DNA双酶切(Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ)片段中回收长度为2362bp的D片段(Genbank登录号:AY639599),又从D片段中克隆了长度为1101bp、编码367aa、分子量为47kDa的Pep基因,表达载体M15(pQE30pep)在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中表达获得了47kDDa的清晰表达带,在1h时开始产生蛋白并有逐步上升的趋势;Western blot也在47kDa处得到一条清晰的条带;可溶性分析表明PEP蛋白在重组菌株中是以不可溶的包含体形式存在的,该蛋白的产生明显地抑制了宿主的生长速度;噬菌体PEP氨基酸序列之间的同源性比较表明,噬菌体MZTP01 PEP蛋白与来自E.coli K12噬菌体的PEP蛋白的同源性程度最大.[结论]我们获得了一种新的噬菌体MZTP01,并首次报道了该噬菌体D片段的核苷酸序列及pep基因的功能,试验证明PEP表达蛋白能够水解酪蛋白,其活力相当于0.3mg/mL的胰蛋白酶.     

人Aurora B基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

目的:克隆出人AuroraB基因,并将其于大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达,获得重组蛋白.方法:利用TRIzol Reagent 法提取食管癌ECa 109细胞总RNA,RT-PCR后以其cDNA为模板PCR扩增Aurora B基因,构建pET 28a(+)-Aurora B重组质粒,将其转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG体外诱导表达重组蛋白.利用生物信息学工具对Aurora B的核酸序列和蛋白功能结构进行分析.结果:成功构建了pET 28a(+)-AuroraB重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人Aurora B基因序列同源性达到了99％;获得AuroraB蛋白,大小约39kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的28％.结论:对人AuroraB基因进行克隆、原核表达及生物信息学分析,为深入研究Aurora B在细胞周期调控中的作用机制及后续Aurora B抑制剂的体外筛选奠定基础.     

金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达

利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得FvGDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-FvGDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDESTl7-FvGDH,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4 h.融合蛋白表达量较高,实现了FvGDH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础.