融合位置特征与序列进化信息的磷酸化位点预测

磷酸化是蛋白质翻译后的主要修饰,可分为激酶特异性和非激酶特异性两种类型．以非激酶特异性磷酸化位点Dou数据集为基础,本文发展了一种基于位置的卡方差表特征χ²-pos,融合伪氨基酸序列进化信息PsePSSM表征序列,构建正负样本均衡的支持向量机分类器,S, T, Y独立测试Matthew相关系数、ROC曲线下面积分及准确率分别达到了(0.59、0.87、79.74%),(0.55、0.85、77.68%)和(0.50、0.81、75.22%),明显优于文献报道结果． χ²-pos、PsePSSM两种特征的融合在蛋白质磷酸化位点预测中有广泛应用前景．     

基于三类特征融合的O-糖基化位点预测

糖基化是蛋白质翻译后的主要修饰,O-糖基化的固定模式未知,高精度识别O-糖基化位点是机器学习面临的挑战性问题.以迄今最大的人O-糖基化位点Steentoft数据集为基础,本文首次提出了基于位置的卡方差表特征χ~2-pos,融合伪氨基酸序列进化信息Pse PSSM以及无方向的k间隔氨基酸对组分Undirected-CKSAAP表征序列,构建5个正负样本均衡的支持向量机分类器,经加权投票,独立测试准确率、Matthew相关系数及ROC曲线下面积,分别达到了89.62%、0.79、0.96,明显优于文献报道结果.χ~2-pos、Pse PSSM与Undirected-CKSAAP三种特征的融合在蛋白质糖基化、磷酸化等位点预测中有广泛应用前景.     

基于信息熵的磷酸化作用预测

磷酸化作用在多种真核细胞中具有重要的功能. 由于对蛋白质激酶底物的实验测定方法限制较多, 同时费时费力, 因此急需发展快速、自动的机器学习方法. 利用蛋白质的一级序列信息可以对不同激酶家族作用的磷酸化位点进行预测, 同时也是对实验的一种补充和指导. 如果仅对磷酸化位点附近的短肽序列进行处理会丢失相当的信息, 将对预测结果造成一定影响. 提出了一种基于信息熵的磷酸化位点预测方法IEPP(information-entropy based phosphorylation prediction), 利用熵信息对磷酸化位点周围的氨基酸位点进行选择和排除, 仅选择对磷酸化作用有效的位点参与预测. 对3个代表性激酶家族ABL, MAPK和PKA的测试表明, 敏感性(Sn)和专一性(Sp)均好于较新的PPSP和GPS算法的结果. 而且同一些在线预测网站的实时测试, 如Scansite等相比, 结果也要好于这些测试方法. 这些都证明了本研究提出的方案是一种有效的磷酸化作用位点预测方法, 且具有简单、高效、实时性好等优点.     

基于信息熵的磷酸化作用预测

磷酸化作用在多种真核细胞中具有重要的功能. 由于对蛋白质激酶底物的实验测定方法限制较多, 同时费时费力, 因此急需发展快速、自动的机器学习方法. 利用蛋白质的一级序列信息可以对不同激酶家族作用的磷酸化位点进行预测, 同时也是对实验的一种补充和指导. 如果仅对磷酸化位点附近的短肽序列进行处理会丢失相当的信息, 将对预测结果造成一定影响. 提出了一种基于信息熵的磷酸化位点预测方法IEPP(information-entropy based phosphorylation prediction), 利用熵信息对磷酸化位点周围的氨基酸位点进行选择和排除, 仅选择对磷酸化作用有效的位点参与预测. 对3个代表性激酶家族ABL, MAPK和PKA的测试表明, 敏感性(Sn)和专一性(Sp)均好于较新的PPSP和GPS算法的结果. 而且同一些在线预测网站的实时测试, 如Scansite等相比, 结果也要好于这些测试方法. 这些都证明了本研究提出的方案是一种有效的磷酸化作用位点预测方法, 且具有简单、高效、实时性好等优点.     

SARS-CoV-2非结构蛋白NSP14的生物信息学分析

目的:通过生物信息学手段预测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中非结构蛋白NSP14的性质特征。方法:以SARS-CoV-2的NSP14氨基酸序列为研究对象,通过Blastp与SARS-CoV的NSP14进行比对,并利用ProtParam、ProtScale、PredictProtein和SWISS-MODEL等生物信息学软件工具对NSP14的理化性质、结构和活性区域等进行预测。结果:SARS-CoV-2的NSP14由527个氨基酸残基构成,是一种可溶性亲水蛋白,与SARS-CoV中NSP14氨基酸序列的一致率达到95%。NSP14二级结构中无规则卷曲含量最高,该蛋白质包含了N-糖基化位点、cAMP或cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-豆蔻酰化位点等5个保守基序。NSP14同时具备N端核糖核酸外切酶和N7-甲基转移酶2个结构域,其活性区域的总面积和体积分别为1469.712?~2和1708.967?~3。结论:基于SARS-CoV-2中NSP14的氨基酸序列,运用生物信息学相关软件分析和预测了NSP14蛋白的性质和结构,为新型冠状病毒疫苗研制和药物筛选提供理论依据。     

大熊猫LSM3c DNA序列的克隆及序列分析

运用RT-PCR技术首次从大熊猫Ailuropoda melanoleuca的肌肉组织总RNA中成功克隆了LSM3的表达序列,并对其进行了测序及初步分析.结果 表明:大熊猫LSM3基因的表达序列含有一个完整的开放阅读框,长度为306 bp,编码102个氨基酸的蛋白质,分子量为11.845 kDa,pI为4.58,含有1个蛋白激酶C磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个细胞附着序列.进一步分析发现,大熊猫LSM3基因的表达序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性,其编码的氨基酸序列与其他哺乳动物完全一致.     

TTV武汉分离株DNA克隆和序列分析

用PCR技术从一武汉病人血清中分离获得TTV DNA片断,把此DNA片断克隆到pMD18-T质粒载体中,进行全序列测定并用计算机软件对核苷酸、氨基酸序列和ORF2多肽特征进行比较和分析.所分离获得的TTVDNA片断全长1333bp,含TTV完整的ORF2及部分ORF1序列,核苷酸和氨基酸序列与其它基因型为1a的TTV分离株具有极高的同源性.ORF2多肽含202个氨基酸,在N端部分和C端部分具有较高的亲水性和较强的抗原性,而中间为一段疏水区域,抗原性较弱.N端结构以α螺旋为主,含有典型的酪氨酸激酶磷酸化价点(RARD-WPGY,38-45aa)和三个潜在的蛋白质激酶C的磷酸化位点;C端富含脯氨酸,结构以β转向为主,含有三个连续的N-十四烷酰化位点,推测ORF2编码的蛋白可能是一种磷酸化蛋白.     

环境变化和时序衰老过程中酵母蛋白激酶Sch9磷酸化的调控

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)蛋白激酶Sch9与哺乳动物蛋白激酶S6K1同源.S6K1是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的底物,且与很多人类疾病相关,包括肥胖症、糖尿病和癌症.Sch9和S6K1都对不同营养条件和环境胁迫条件下的细胞生长调控很重要.Sch9激活环内的磷酸化位点570位苏氨酸残基也被称为PDK1位点,而737位苏氨酸位点也被称为PDK2位点,这两个位点的磷酸化对Sch9的活性非常重要.蛋白激酶Pkh1/2磷酸化Sch9的PDK1位点,而雷帕霉素靶蛋白复合体1(TORC1)磷酸化PDK2位点.为了深入了解Sch9在细胞中的功能,阐明不同环境条件下及时序衰老过程中Sch9的PDK1和PDK2位点磷酸化的调控就显得尤为重要.利用特异性识别570位苏氨酸残基磷酸化的Sch9蛋白和特异性识别737位苏氨酸残基磷酸化的Sch9蛋白的两种抗体,对不同环境条件下和时序衰老过程中Sch9的两个位点的磷酸化调控进行了研究.研究结果揭示了Sch9的两个磷酸化位点在营养感受、胁迫应答、热量限制和时序衰老过程中的调控方式.揭示Sch9的PDK1位点磷酸化的调控与热量限制延长出芽酵母时序寿命密切相关.     

内蒙古白绒山羊TSC2基因克隆与表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA并分析其特性及基本表达模式.利用RT-PCR分段克隆TSC2基因cDNA片段并测序,将得到的cDNA各片段核苷酸序列拼接后获得绒山羊TSC2基因编码区全长序列(HQ684023)并进行生物信息学分析.半定量RT-PCR方法检测TSC2基因在不同组织中的表达特异性.结果表明内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA编码区核苷酸序列为5184 bp,包含了编码1727个氨基酸残基的全长ORF.核苷酸序列与牛、猪、马、大熊猫、犬、恒河猴、人、小鼠及大鼠的同源性分别为97％、90％、89％、88％、87％、87％、87％、86％和86％.NCBI CDD程序预测该基因编码的蛋白质有一个Tuberin结构域和一个Rap-GAP结构域;Psite程序分析有5个N糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点、16个蛋白激酶C磷酸化位点、25个酪蛋白激酶磷酸化位点.PSORT程序预测其定位于胞内体膜.TSC2基因在内蒙古白绒山羊的睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾和肾脏等组织中都有表达,mRNA丰度在睾丸中较高,乳腺中较低.     

内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因克隆及组织表达特性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因并分析其表达模式。采用RT-PCR技术扩增TCTP基因编码区cDNA序列,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用定量RT-PCR方法检测TCTP基因在绒山羊不同组织中的表达特异性。获得的内蒙古白绒山羊TCTP基因编码区cDNA序列全长519 bp,包含了完整的ORF,编码172个氨基酸残基组成的蛋白质。核苷酸序列与绵羊、牛、猪、人、猴及大鼠的同源性在99%-95%之间。生物信息学分析表明,编码的蛋白质理论分子质量19.6 kD,等电点(pI)4.673,含有一个N端糖基化位点,一个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,定位于细胞质中。定量RT-PCR方法检测表明,TCTP基因在绒山羊肾脏、肌肉、胰腺、肝脏、睾丸和脑组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量较高,在脑中表达量较低。     

地黄核苷二磷酸激酶基因的克隆及生物信息学分析

核苷二磷酸激酶(NDPK)是一种高度保守的多功能蛋白,具有催化底物磷酸化的作用,能够参与植物的生长发育、非生物胁迫、感病应激、光合作用和能量代谢等过程。为了解地黄核苷二磷酸激酶基因(RgNDPKⅠ)的结构、功能和性质,该研究利用地黄转录组学数据,通过电子克隆的方法获得了RgNDPKⅠ基因的全长cDNA序列,长度为765 bp。生物信息学分析结果表明,RgNDPKⅠ基因的开放阅读框长度为447 bp,编码148个氨基酸,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点。RgNDPKⅠ基因编码的蛋白质定位于细胞质,是无跨膜区域的亲水性蛋白,该蛋白质与芝麻、紫花风铃的核苷二磷酸激酶相似性较高,分别为97%和96%。在多种生物中已经克隆得到了核苷二磷酸激酶基因,且不同植物核苷二磷酸激酶氨基酸序列中存在多个相似的保守结构域,推测RgNDPKⅠ基因所编码的蛋白质为核苷二磷酸激酶超家族成员。该研究结果为进一步探明RgNDPKⅠ的性质、结构、功能及表达机制提供了重要的理论依据。     

藏羊IL-2基因的RT-PCR扩增、序列分析及蛋白结构预测

设计藏羊IL-2基因特异性引物,提取藏羊脾脏总RNA,RT-PCR技术扩增IL-2基因并测序,应用生物学软件进行序列分析及蛋白结构预测。研究表明,藏羊IL-2基因长度为405 bp,编码135个氨基酸,藏羊IL-2基因与参考绵羊(登录号:NM_001009806.1,X60148.1)、山羊(登录号:NM_001287567.1,AF307018.1,U34274.1)、藏羚羊、水牛和牦牛IL-2基因的核苷酸序列同源性依次为100.0%、99.8%、99.8%、99.3%、99.0%、99.5%、98.0%和95.8%,氨基酸序列同源性依次为100.0%、100.0%、100.0%、98.5%、98.5%、100.0%、97.0%和93.3%。蛋白结构预测研究表明,IL-2蛋白具有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N-糖基化位点和1个白细胞介素-2信号。研究成果可为藏羊IL-2基因抗病功能的研究提供基础参考数据。     

大熊猫核糖体蛋白S11亚基基因(RPS11)cDNA的克隆及序列分析

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,由RPS11基因所编码,属于核糖体蛋白S17p家族,主要存在于真核生物中.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基RPS11基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基RPS11 基因的异同,本研究根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S11亚基基因(RPS11)的相关信息设计引物,运用RT-PCR 技术从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基RPS11基因,并进行了测序和序列分析.结果表明:大熊猫RPS11亚基基因的开放阅读框(ORF)长为477 bp,编码158 个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子量为18.4275 kDa,pI为10.96.拓扑预测显示该蛋白含有14个功能位点:即2 个N-糖基化位点,6个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个核糖体蛋白S17 signature位点.进一步分析发现,大熊猫RPS11基因与已报道的部分哺乳动物的表达序列及其编码的氨基酸序列都具有很高的相似性.本研究结果为丰富和完善哺乳动物RPS11基因资源库提供了基础资料.     

一个白菜花粉发育相关的新基因BcMF7的鉴定

利用cDNA-AFLP技术分析了白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino, syn. B. rapa L. ssp. chinensis)雄配子减数分裂的胞质分裂突变体(male meiotic cytokinesis, mmc)和野生型植株花蕾基因表达的差异, 克隆了其中一个在野生型花蕾中特异表达的基因BcMF7, 序列分析发现该基因的最大开放阅读框为390 bp, 编码129个氨基酸, 推测的蛋白质分子量为13.75 kD, 含有8个蛋白激酶C磷酸化位点, 2个酪蛋白激酶II磷酸化位点, 2个酪氨酸激酶磷酸化位点, 2个N-糖基化位点以及2个N-豆蔻酰化位点等, 这些位点均与细胞内信号传导、蛋白定位以及黏附等过程有关. 时空表达特点分析发现BcMF7在花粉中特异表达, 其转录本最早在花粉发育的四分体时期开始出现, 在单核小孢子时期表达丰度达到最高, 随后在成熟花粉粒形成时期表达量又有所下降. 推测BcMF7可能在花粉发育的四分体时期到成熟花粉粒形成过程的信号传导中发挥重要作用.     

基于高覆盖(磷酸化)蛋白质组对人胚胎干细胞干性维持调控网络的解析

目的:对人胚胎干细胞H9的(磷酸化)蛋白质组进行鉴定和深入分析,探讨维持人胚胎干细胞干性的核心调控网络。方法:利用新近发表的TAFT磷酸化肽段富集策略和高精度质谱鉴定技术,采用无标定量方法对H9细胞(磷酸化)蛋白进行定量分析;结合MOTIFX、iGPS、IPA等多种生物信息学分析软件,分析H9细胞的磷酸化基序-激酶、转录因子-靶基因调控网络。结果:获得了目前高度覆盖的H9细胞(磷酸化)蛋白质组数据集,鉴定到8674种蛋白质,其中3898种能够发生磷酸化修饰,包括13 676条磷酸化肽段,高可信度(class 1)磷酸化位点有11 870种。与已有的H9细胞磷酸化蛋白质组数据相比,其中2247种磷酸化蛋白质和10 025种磷酸化位点是本研究新鉴定到的。基于基序和激酶预测分析,推导出与干性维持相关的已知转录调节因子的新的磷酸化修饰基序以及调控其发生磷酸化的激酶。结合多能性转录因子对靶基因的调控信息,构建了多能性调控分子磷酸化修饰及其转录调控的核心网络。此外,还对特定位点的磷酸化修饰水平及其对应蛋白的总体丰度水平进行了比较及功能分析。基于各自的百分位数,比较磷酸化修饰水平与其对应蛋白的总体丰度,发现具有高丰度但低磷酸化修饰水平的蛋白倾向于参与物质转换或物质运输等生物过程,而低丰度但高磷酸化水平的蛋白质倾向于参与信息转导或调控过程。结论:提供了人胚胎干细胞H9高覆盖的(磷酸化)蛋白质组数据,这些数据有助于深入了解蛋白质磷酸化修饰在胚胎干细胞干性维持中所发挥的重要作用,为胚胎干细胞基础和应用研究提供了宝贵的数据资源。     

TTV武汉分离株DNA克隆和序列分析

用PCR技术从一武汉病人血清中分离获得TGV DNA片断,把此DNA片断克隆到pMD18-T质粒载体中,进行全序列测定并用计算机软件对核苷酸,氨基酸序列和ORF2多肽特征进行比较和分析。所分离获得的TTV DNA片断全长1333bp,含TTV完整的ORF2及部分ORF1序列,核苷酸和氨基酸序列与其它基因型为1a的TTV分离株具有极高的同源性。ORF2多肽含202个氨基酸,在N端部分和C端部分具有较高的亲水性和较强的抗原性,而中间为一段疏水区域,抗原性较弱。N端结构以α螺旋为主,含有典型的酪氨酸激酶磷酸化价点（RARDWYPGY,38－45aa）和三个潜在的蛋白质激酶C的磷酸化位点,C端富含脯氨酸。结构以β转向为主,含有三个连续的N－十四烷酰化位点,推测ORF2编码的蛋白可能是一种磷酸化蛋白。     

Mtss1抗体制备及小脑中不同亚型磷酸化水平的检测

肿瘤转移抑制蛋白(Metastasis suppressor1,Mtss1),又名肿瘤转移消失蛋白(Missing in metastasis,MIM)在小脑神经元发育中受到调控,依次表达两种亚型:包含Src磷酸化位点的广泛表达亚型;含Src磷酸化位点片段经RNA剪接去除的神经元特异亚型.为检测这两种Mtss1亚型的酪氨酸磷酸化水平是否因Src磷酸化位点的去除存在明显区别,制备了灵敏度较高并可特异性沉淀外源和内源表达的Mtss1的兔多克隆抗体,对发育时期与成年大鼠小脑内源Mtss1酪氨酸磷酸化水平进行检测,发现成年后的Mtss1与出生后发育时期的Mtss1均发生明显的酪氨酸磷酸化,表明剪接去除包含有Src磷酸化位点中的神经元特异亚型中,还有其他的酪氨酸残基被磷酸化,提示其他酪氨酸磷酸化激酶信号通路对Mtss1神经元亚型的调控作用.     

玉米早期花药蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析

蛋白质磷酸化修饰是调控其功能的一种重要方式。植物有性生殖过程在农作物产量形成和物种繁衍过程中起着重要作用。作为植物雄性生殖器官的花药,其正常生长发育对于保证形成功能性配子(花粉)以及完成双受精过程至关重要。本研究以重要农作物玉米(B73)为材料,利用Nano UHPLC-MS/MS质谱技术对玉米早期发育的花药在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平进行全面分析,以探究玉米花药发育过程中的蛋白调控网络和磷酸化修饰调控网络。在蛋白质组学分析中,共鉴定到了3 016个多肽,匹配到1 032个蛋白质上。通过Map Man分析,预测到了一些和花药发育相关的蛋白质,例如受体激酶(GRMZM2G082823_P01、GRMZM5G805485_P01等)。另外,在磷酸化蛋白质组学研究中,通过对Ti O2亲和层析富集到的磷酸化多肽进行质谱分析,检测到了257个磷酸化多肽,匹配到210个蛋白质上。我们的数据揭示了玉米花药发育过程中的223个磷酸化位点。与已发现的玉米中的86个磷酸化蛋白质(植物蛋白磷酸化数据库(P3DB):http://www.p3db.org/organism.php)相比,其中203个磷酸化蛋白和218个磷酸化位点为首次揭示。进一步生物信息学分析表明:磷酸化在14-3-3蛋白质、激酶、磷酸酶、转录因子、细胞周期和染色质结构相关的蛋白质介导的玉米早期花药发育过程中起着重要的调控作用。总之,本研究首次在蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学水平研究了玉米早期花药发育的蛋白质调控网络,不仅丰富了玉米蛋白质和磷酸化修饰蛋白质数据库,并为利用遗传学和生物化学手段深入研究玉米花药发育的分子调控机理提供了基础。     

内蒙古白绒山羊erk2基因的克隆及表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA并分析其基本表达模式。采用RT-PCR方法克隆白绒山羊erk2基因cDNA。通过在线软件Blast进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。定量RT-PCR检测erk2基因在绒山羊组织中的表达特异性。免疫组化法检测绒山羊睾丸中erk2表达。克隆到的内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA片段 (GenBank Accession No.JX569765) 长1 083 bp,包含了编码360个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与牛的ERK2 (Bos Taurus BC133588.1) 同源性为100％。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了活化位点“TEY”及具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S-TKc结构域。Psite分析表明,含2个N-糖基化位点、1个依赖于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、3个蛋白激酶c磷酸化位点、5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N-豆蔻酰化位点、2个异戊二烯基结合区 (CAAX box)、7个微体羧基端靶向信号、2个蛋白激酶ATP结合区标记及一个丝/苏氨酸蛋白激酶活性区域标记。PSORT (k-NN prediction) 程序预测其定位于细胞质中。定量RT-PCR分析显示erk2基因mRNA丰度在心脏、皮肤以及乳腺组织中mRNA丰度较高,脾、肾中的表达相对较低。在睾丸中检测到ERK2蛋白表达。     

果蝇程序化死亡基因5(PDCD5)同源cDNA的克隆和序列分析

 为了解人类白血病细胞凋亡相关新基因 TFAR1 9(PDCD5,programmed cell death5)在不同种属间的序列同源性 ,利用 EST(expression sequence tag)拼接、RT- PCR、DNA序列测定技术及计算机分析技术 ,首次成功地进行了果蝇 PDCD5同源 c DNA编码区基因克隆和序列分析 .发现果蝇与小鼠及果蝇与人 PDCD5在核苷酸水平上分别有 57.5%和 57.1 %的同源性 ,在氨基酸水平上分别有 46.8%和 46.4%的同源性 .功能区分析发现 ,果蝇 PDCD5c DNA编码 1 33个氨基酸 ,计算机预测可能是一种核蛋白 ,含 5个可能的酪蛋白激酶 (casein kinase )磷酸化位点 ,2个可能的 PKC磷酸化位点 ,与人 PDCD5的功能区类似 .因而果蝇 PDCD5是与人 PDCD5同源的新基因 ,可能都与细胞程序化死亡相关 .