SB转座子介导的斑马鱼增强子捕获注解分析

为了建立斑马鱼增强子捕获突变体库及研究功能基因的表达调控模式,制备了SB转座子介导的增强子捕获转基因斑马鱼(F0),通过繁育建立了组织或器官特异表达报告基因绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的品系(F1)。选择F1代的SK-3系(脑部特异表达GFP)与野生型TU系斑马鱼交配,收集受精卵(F2),于24 hpf(Hour post fertilization)、2 dpf(Day post fertilization)、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf 6个发育阶段检测报告基因绿色荧光蛋白的表达模式;然后通过Splinkerette PCR(SP-PCR)方法检测SB转座子在斑马鱼基因组中的插入位置,从而确定捕获的增强子和功能基因;最后通过胚胎原位杂交验证内源基因表达模式。结果表明,在F2代胚胎不同发育阶段,GFP表达具有明显的时空特性,前期在前脑,中脑,后脑三个部位均高水平表达,后期表达部位呈后移趋势,各个发育期表达强度基本无变化,结果提示该捕获增强子具有脑部表达特性。sp-PCR结果分析表明增强子位于基因组1号染色体35、914、498-35、914、621位置,在内源性基因ednraa位点附近。原位杂交结果表明该基因在胚胎24 hpf阶段具有转录活性。本研究结果提示SB转座子介导的增强子捕获技术可高效获得插入突变斑马鱼,对研究基因功能和获得具有自主知识产权的新基因具有重要作用。     

斑马鱼tbx2b调控心脏房室间隔发育的功能研究*

tbx2是早期心脏发育的关键基因。为进一步探究其对房室间隔(AVC)发育的影响,研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,成功构建了斑马鱼tbx2b突变体。通过T7E1酶切对其F₀进行敲除效率检测,结果显示平均敲除效率约为57.5%。F₁进一步筛选获得tbx2b杂合突变体,测序结果显示突变类型为11 bp碱基缺失的移码突变。tbx2b杂合子内交获得纯合子,tbx2b纯合突变体在5 dpf死亡并出现早期心脏环化异常表型。斑马鱼整胚原位杂交实验显示在3 dpf tbx2b纯合突变体中, 心脏腔室分化特异性标志基因nppa、nppb表达上调并异位表达在AVC,而AVC发育关键基因has2的表达消失。高效构建tbx2b突变体并初探其对下游基因的影响,为后续深入研究tbx2b对心脏AVC发育的作用奠定了基础,同时加深了人们对早期心脏调控网络的认识。     

合子基因mcm3在斑马鱼肝早期发育中的作用

目的研究斑马鱼合子基因mcm3是否参与了斑马鱼肝早期发育的调控。方法运用原位杂交分析mcm3在斑马鱼发育早期表达谱;运用mcm3 MO敲降mcm3基因功能,然后用原位杂交及转基因鱼胚胎分析肝的发育状况。结果 mcm3为合子表达基因,在中囊胚期后到尾牙期广泛表达,而在体节发生期及以后分别在体节、头部及内胚层组织高表达。进一步研究发现在mcm3功能敲降后肝变小,而中胚层器官血管心脏的发育并未受到明显影响。mcm3 mRNA回救实验表明mcm3特异的调控了肝的发育。结论斑马鱼合子基因mcm3参与了肝早期发育的调控。     

二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用

目的观察二氢叶酸还原酶基因(DHFR)功能阻抑斑马鱼胚胎的颅脑部发育情况,初步探讨二氢叶酸还原酶基因在斑马鱼神经系统发育过程中的作用。方法采用显微注射吗啡啉修饰的反义核苷酸(MO)的方法进行DHFR表达阻抑。胚胎发育至受精后48hpf观察胚胎的颅部发育情况,在60hpf时经石蜡切片进一步观察胚胎的脑发育状况。利用胚胎整体原位杂交的方法检测影响神经系统发育的关键因子ngn1和huc的表达情况。结果显微注射MO可成功的进行DHFR表达阻抑。DHFR表达阻抑组胚胎存在颅脑部发育明显异常和ngn1、huc的表达强度明显减弱,且与显微注射的MO剂量呈正相关。结论DHFR在斑马鱼颅脑发育中有重要作用;其功能阻抑可导致胚胎颅脑部发育异常,其机理与ngn1和huc的的表达减弱有关。     

利用CRISPR/Cas9技术构建tnnt2a基因突变斑马鱼及表型分析

心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)作为心肌纤维细肌丝的结构蛋白,参与心脏兴奋收缩耦联过程。tnnt2a为斑马鱼cTnT基因的亚型。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了可稳定遗传tnnt2a缺失突变斑马鱼。对tnnt2a缺失突变体进行表型分析,结果显示tnnt2a+/-斑马鱼心脏无明显异常,而tnnt2a-/-斑马鱼心脏在胚胎发育早期具有显著的突变表型,表现为心脏无搏动、心房和心室增大、心包积液,并于受精后6~7天死亡。运用real time RT-PCR检测tnnt2a、actc1a、tpm4a、myl7和vmhc基因在转录水平的表达情况,结果显示tnnt2a~-/~-(Δ2)斑马鱼tnnt2a基因在发育的各时间点表达水平均显著下降;而actc1a、tpm4a、myl7和vmhc基因在突变体胚胎发育早期表达增高,晚期则表达下降。进一步对心脏组织进行电镜观察和免疫荧光染色,结果显示tnnt2a~-/~-(Δ2)斑马鱼心脏无正常粗、细肌丝结构,同时F-actin与Tpm4的共染色也展示了心肌细胞肌丝结构的异常。本研究利用CRISPR/Cas9构建的tnnt2a突变斑马鱼表现出了心腔扩张,停搏及粗、细肌丝形成障碍等与临床扩张型心肌病相似的表型,因此可为TNNT2缺陷相关心肌病的研究提供很好的工具。     

肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响

利用斑马鱼(Danio rerio)野生型与肌间刺完全缺失突变型个体,从骨骼染色和骨骼发育相关基因表达两方面,初步评价了肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响。通过骨骼染色对比观察了两种肌间刺表型个体受精后8dpf(days post fertilization, dpf)到56dpf的骨骼发育情况,结果显示,两种肌间刺表型除肌间刺外,其他骨骼发育基本同步。此外,通过qRT-PCR实验检测分析了6个骨骼发育相关基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)在不同肌间刺表型5个胚胎发育时期(3hpf囊胚期、6hpf原肠胚期、12hpf体节期、24hpf咽囊期和72hpf孵化期)和5个胚后生长阶段(15、30、45、60和75dpf)的表达情况。结果显示:在胚胎发育时期,野生型和突变型个体中bmp2a、bmp4、smad1、smad4a基因和突变型个体中sp7基因的表达均呈现先升后降的变化趋势,且在体节期达到最高表达水平;野生型和突变型个体中runx2a基因和野生型个体中sp7基因则表现为逐渐上升的趋势。6个基因在囊胚期和原肠胚期表达量无显著差异, bmp2a的表达...     

斑马鱼胚胎发育过程中TGF-1基因的表达特征分析

为研究转化生长因子 (Transforming growth factor , TGF)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用, 通过NCBI获得TGF-1基因序列, TGF-1 cDNA全长1571 bp, 编码377个氨基酸。系统进化树分析发现, TGF-蛋白按照不同的类型严格聚类, 斑马鱼TGF-1与其他鱼类的TGF-1聚集到一个分支, 在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示, TGF-1基因为母源表达基因, 在分节期之前的表达水平比较低, 而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现, TGF-1基因在斑马鱼24 hpf 胚胎中开始有特异信号出现, TGF-1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处, 表明TGF-1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎, 发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现, 低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明, TGF-1基因参与斑马鱼胚胎发育调控, 并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-1基因的功能奠定基础。       

斑马鱼消化器官发育缺陷突变体的遗传筛选

目的正向遗传筛选斑马鱼肝脏、肠和胆囊发育缺陷突变体。方法 ENU诱变野生型斑马鱼并开展经典的F2代筛选,以lfabp为探针的全胚原位杂交、BES-H2O2-Ac荧光染料分别检测斑马鱼早期胚胎肝脏、肠和胆囊的表型。结果在128个突变基因组中筛选获得了源自14个F2家族的斑马鱼消化器官发育缺陷突变体品系23个,并按表型划分为6类。结论斑马鱼肝脏、肠和胆囊的发育调控机制有相似性和差异性。     

一个水稻畸形颖壳突变体ah的鉴定及其突变性状的遗传分析

水稻畸形颖壳突变体ah是双胚苗品系W2555中自然突变产生的。该突变体的内外稃畸形,退化;雄蕊雌蕊化,雌蕊败育;浆片同源转化为类内外稃的结构,推测该突变体可能影响B功能基因的正常发育。与野生型相比,突变体的小穗分支稀疏,每级枝梗上颖花数目减少,一般为4～6朵;小穗顶端的颖花经常不能成熟,表现为颖花始终泛白,不能转绿,因此该突变也影响花序分生组织的发育。进一步的研究证明,该突变体的发育受外界环境的影响。突变性状的遗传分析表明,该突变体由单隐性基因控制。     

斑马鱼hoxa1a基因调控颅面骨骼发育的功能研究*

hox基因编码一类高度保守的转录因子家族,人类HOXA1的突变会导致阿萨巴斯卡发育不良综合征 (Athabascan brainstem dysgenesis syndrome, ABDS),使人出现因颅骨异常导致的面部畸形和面部麻痹等症状。利用模式生物斑马鱼研究其同源基因hoxa1a的功能机制。首先利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼hoxa1a进行基因编辑,获得了hoxa1a基因突变,T7E1酶切结果显示F₀酶切效率平均为70%。F₁进一步筛选到两种突变类型,分别是插入了8 bp和删除了7 bp的杂合突变体。杂合子自交得到hoxa1a F₂纯合突变体,并且测序验证hoxa1a基因突变成功。5 dpf时,hoxa1a纯合突变体出现颅面发育异常。阿尔新蓝软骨染色和茜素红硬骨染色结果表明,hoxa1a突变体中颅骨发育异常、筛骨板断裂,鳃弓发育出现缺损。成功在斑马鱼中构建ABDS疾病模型,表明hoxa1a突变会造成斑马鱼颅面骨骼发育异常,为其功能机制研究奠定了基础,为人类ABDS疾病的致病机制研究提供了新的思路。