草酸青霉纤维素酶基因和木聚糖酶基因的调控基因POX05145的鉴定

草酸青霉能产生完整的纤维素酶和木聚糖酶酶系,其纤维素酶基因的表达主要受转录因子的调控。前期工作中,通过对草酸青霉菌株HP7-1在不同碳源培养基培养条件下转录组的比较分析,获得了调控纤维素酶和木聚糖酶产量的候选调控基因集。本研究以草酸青霉ΔPoxKu70为出发菌株,通过同源重组法,构建并获得了其中一个候选调控基因POX05145的缺失突变株ΔPOX05145。在微结晶纤维素Avicel诱导培养条件下,与出发菌株ΔPoxKu70相比,ΔPOX05145的纤维素酶产量和木聚糖酶产量发生了显著改变。其中,在诱导第2天时,ΔPOX05145对硝基苯-β-D-纤维二糖苷酶产量和木聚糖酶产量分别上升43.4%和164.7%,对硝基苯-β-D-半乳糖吡喃葡萄糖苷酶产量下降92.8%,但是,滤纸酶产量和羧甲基纤维素酶产量没有显著变化。然而,在诱导第4天时,所有纤维素酶产量和木聚糖酶产量上升100.4%~294.0%。实时荧光定量PCR检测表明POX05145在不同的时间不同程度的调控主要的纤维素酶基因和木聚糖酶基因的表达。序列分析表明POX05145含有一个GAL4类锌指结构的DNA结合功能域和一个保守的真菌特有的转录因子结构域(Fungal_TF_MHR)。     

草酸青霉转录因子POX03446对生淀粉酶产量调控的初步研究

生淀粉酶可以在淀粉糊化温度以下的温度下直接降解生淀粉,具有巨大应用价值。丝状真菌生淀粉酶的产生受转录因子的严格调控。但是,草酸青霉(Penicillium oxalicum)中生淀粉酶产生的调控机制仍不清楚。前期工作中,通过比较基因组学获得了草酸青霉HP7-1中调控生淀粉酶产量的候选调控基因集。本研究以草酸青霉ΔPoxKu70为出发菌株,用同源重组技术敲除了其中一个候选调控基因POX03446,获得了缺失突变株ΔPOX03446。在可溶性淀粉培养条件下,与出发菌株ΔPoxKu70相比,转接后第2天,ΔPOX03446的生淀粉酶产量显著下降29.8%~40.3%(p<0.01;Student’s t test);转接后第4天,生淀粉酶产量显著下降14.6%~29.7%(p<0.01;Student’s t test),表明基因POX03446正向调控草酸青霉生淀粉酶的产生。NCBI BlastP比对分析显示POX03446与草酸青霉调控木聚糖酶基因和纤维素酶基因表达的转录因子PoXlnR一致性为46%。这是第一次报道POX03446调控草酸青霉生淀粉酶的产生。     

草酸青霉中一个编码锌指蛋白的基因的功能鉴定

草酸青霉是自然界中常见的产纤维素酶的丝状真菌,其基因组含有多个纤维素酶基因,能够分泌完整的纤维素酶系。真菌纤维素酶基因的表达主要是在转录水平上受到调控。通过对草酸青霉野生菌株HP7-1及其高产纤维素酶突变株EU2106的转录组以及基因组进行分析,获得了一批可能与突变株酶活变高有关的候选基因。HP7A1874是其中的一个候选基因,该基因在EU2106中的表达水平下降了82%。HP7A1874编码一个锌指蛋白,锌指结构域是转录因子所具有的典型结构之一。本研究通过基因敲除获得该基因的缺失突变株△HP7A1874,测定了突变株的纤维素酶和木聚糖酶活性。结果表明,HP7A1874缺失突变株的纤维素酶和木聚糖酶活与野生型菌株相比并无显著差异,说明HP7A1874与草酸青霉纤维素酶基因的表达调控无关。     

斜卧青霉去泛素化蛋白酶CREB的缺失提高纤维素酶的生产

斜卧青霉Penicillium decumbens T.是1种重要的产纤维素酶丝状真菌,能有效地降解利用木质纤维素生产第2代生物燃料。为了提高斜卧青霉纤维素酶的产量,构建了去泛素化酶基因creB的敲除盒,并通过同源双交换重组的方法,获得了creB基因缺失突变株ΔcreB。该突变株呈现明显的纤维素酶表达分泌抗葡萄糖代谢阻遏效应,ΔcreB菌株的滤纸酶活、内切纤维素酶活、木聚糖酶活以及外切纤维素酶活分别提高1.8倍、1.71倍、2.06倍以及2.04倍,其胞外蛋白质含量提高了2.68倍。确定了creB基因缺失突变株具有抗碳源代谢物阻遏的生理现象,CREB对斜卧青霉生产纤维素酶的能力具有显著影响,为系统改造丝状真菌高产纤维素酶菌株提供了理论指导。     

草酸青霉可重复利用筛选标记5'氟乳清酸的构建

草酸青霉是纤维素酶高产真菌,也是科学研究的重要真菌之一.借助基因工程技术手段对工业真菌进行分子改造,可以有效提高菌株在工业生产中的经济效益,对工业菌株进行基因改造需要大量的筛选标记,目前草酸青霉中可用的筛选标记较少,因此需要构建一个草酸青霉可重复利用筛选标记转化系统.本研究构建以乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因(pyrG)作为选择标记,以草酸青霉pyrG缺失菌株为宿主菌构建转化系统.首先,构建了含有草酸青霉pyrG表达框及其终止子TT1重复序列的可重复利用pyrG筛选标记.然后,以pyrG筛选标记作为选择标记,以草酸青霉pyrG缺失菌株Δku70ΔpyrG(pyrG∷kan)为受体菌株,敲除Δku70ΔpyrG(pyrG∷kan)菌株中的kan基因,获得菌株Δku70Δkan(kan∷R-pyrG).最后,利用筛选标记中的pyrG终止子重复序列发生自我剪切,利用氟乳清酸(5-FOA)的筛选,获得pyrG缺失,kan抗性基因缺失菌株Δku70ΔR-pyrG.本研究成功建立以pyrG为筛选标记,草酸青霉pyrG缺失菌株为受体菌的可重复利用筛选系统.     

斜卧青霉转录调控因子BglR的缺失对纤维素酶生产的影响

【目的】斜卧青霉(Penicillium decumbens)作为高效分泌纤维素酶的重要丝状真菌,其纤维素酶的合成与分泌在转录水平上被调控。进一步研究纤维素酶基因表达的转录调控,构建高效高产纤维素酶的工业菌株。【方法】根据斜卧青霉114-2在不同碳源生长条件下基因组表达谱的差异,发现新的转录调控因子BglR(PDE-01706),该蛋白与产黄青霉(Penicillium chrysogenum)Pc20g04780的锌指结构蛋白具有59%同源性。通过基因同源双交换,得到BglR缺失突变株ΔbglR-1,对突变株ΔbglR-1的表型、营养生长、产纤维素酶活、蛋白分泌能力及发酵液pH变化进行研究。【结果】转录调控因子BglR的缺失可导致突变株ΔbglR-1的β-葡萄糖苷酶活力提高40%,并造成其滤纸酶活、内切葡聚糖酶及木聚糖酶活明显降低。【结论】结果表明转录调控因子BglR对于斜卧青霉纤维素酶的调控有重要作用。     

一株纤维素降解真菌的筛选及鉴定

[目的]分离筛选高效降解纤维素的真菌菌株,并研究其产酶能力.[方法]利用刚果红染色法从甘蔗地土壤中分离纤维素降解真菌,再通过测定滤纸的降解率及发酵酶活复筛.[结果]综合考虑水解圈,水解圈和菌株直径的比值(HC值),滤纸的降解率和复筛酶活,对试验真菌降解纤维素的能力进行综合评价,筛选到具有较强纤维素降解能力的真菌菌株SJ1,经形态学观察及分子生物学鉴定,该菌属于草酸青霉.其滤纸酶活、内切葡聚糖酶酶活(CMC酶活)、β-葡聚糖苷酶酶活和外切葡聚糖酶酶活(CBH酶活)分别为25.15、740.42、58.03和2.442 U/mL.[结论]菌株SJ1是一株十分具有研究开发潜力的纤维素酶生产菌株.     

草酸青霉的植物多糖降解酶基因表达调控的研究进展

植物生物质是地球上最丰富的可再生资源,对其生物炼制可生产高附加值的生物基产品。生物炼制需要使用植物多糖降解酶(plant-polysaccharide-degrading enzymes,PPDEs),如纤维素酶、木聚糖酶和生淀粉酶。丝状真菌草酸青霉(Penicillium oxalicum)能分泌完整的具有高活力的植物多糖降解酶,但其产量低限制了大规模生产及应用。草酸青霉中植物多糖降解酶的生物合成受到多种调控因子包括转录因子的严格调控。本文主要介绍在以植物生物质甘蔗渣和木薯生淀粉为原料的生物炼制中,涉及的一些关键微生物方面的问题,如从高产植物多糖降解酶的真菌菌株的筛选、育种,到草酸青霉植物多糖降解酶合成及其基因表达的调控基因的鉴定,以及酶产量提高的工程菌株的构建等,为丝状真菌资源的开发与利用提供理论指导。     

纤维素降解真菌DF14101的筛选与鉴定

纤维素是植物细胞壁的主要成分,也是人类宝贵的天然可再生资源之一。由于纤维素不易降解,严重限制了生物质废弃物中纤维素的有效利用。从海口、儋州、屯昌市郊的森林、农田以及香蕉园采集土壤和腐烂秸秆样品中,筛选获得1株产纤维素酶能力较强的真菌DF14101。在以香蕉秸秆粉为碳源的培养基中,28℃、180r/min培养5 d时,该菌株发酵液的内切葡聚糖酶酶活(CMCase)为43.98 U/m L,滤纸酶活(FPA)为14.05 U/m L。结合形态学特征和ITS序列系统发育分析结果,将该菌株鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。     

三株高效秸秆纤维素降解真菌的筛选及其降解效果

【目的】利用多种筛选方法,获得高效秸秆纤维素降解真菌,并研究其秸秆纤维素的降解能力。【方法】采用滤纸片孔洞法、滤纸条降解法、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水解圈测定法、秸秆失重法、纤维素分解率测定法、胞外酶活测定法等常规秸秆纤维素降解菌的筛选方法。【结果】筛选到3株具有较强纤维素降解能力的真菌菌株,经初步鉴定菌株98MJ为草酸青霉(Penicillium oxalicum)、菌株W3为木霉(Trichoderma sp.)、菌株W4为扩张青霉(Penicillium expansum)。菌株W4具有非常强的秸秆纤维素降解能力,10d内对秸秆的降解率可达56.3%,对纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为59.06%、78.75%和33.79%。菌株W4的胞外纤维素酶活力在14.25-49.75U/mL之间。【结论】筛选获得3株高效秸秆纤维素降解真菌菌株,其中菌株W4的纤维素酶活高于已报道的菌株,是一株十分具有研究开发潜力的纤维素酶生产菌株。