原核表达家蝇抗菌肽Phormicin A,B蛋白对大肠杆菌标准株的影响

抗菌肽是近年来新型的抗菌剂药物候选者。以家蝇防御素家族Phormicin A、B抗菌肽为研究对象,探究了其对大肠杆菌的作用效果。采用原核表达法获得二者蛋白,将其作用于大肠杆菌标准株,通过微量液体稀释法测定其最小抑菌浓度分别为20和7.5 mmol/L,并绘制了二者作用于大肠杆菌标准株的时间生长曲线。结果显示:家蝇Phormicin A、B原核表达蛋白对于大肠杆菌标准株的生长具有一定的抑制作用,此研究为应用于抗临床大肠杆菌感染药物的研发提供了一定的参考。     

家蝇Phormicin A多克隆抗体的制备及效价检测

家蝇Phormicin作为防御素家族的成员,是一类具有广普抗菌活性的抗菌肽.本研究采用原核表达法表达并纯化获得了家蝇PhormicinA蛋白.将家蝇Phormicin A原核表达蛋白与完全佐剂和不完全佐剂乳化混匀,先后免疫新西兰白兔获得其多克隆抗体.通过原核表达蛋白中和吸附实验,以及Western blot实验验证了抗体的特异性.进一步用金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫样品,进行内源性验证并测定抗体的效价.结果 显示,该多克隆抗体既可以识别家蝇Phormicin A原核表达蛋白,也可以识别金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫产生的内源性Phormicin A蛋白.本研究为进一步探索Phormicin在家蝇天然免疫和防御中的机制等后续工作打下基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽.本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征.结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫＞1龄幼虫＞3龄幼虫＞雄蝇成虫＞卵＞雌蝇成虫＞蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体＞唾液腺＞气管＞肠道＞体壁.通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降.本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征.同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础.     

家蝇抗菌肽AMPs17蛋白原核表达条件的优化及其抗真菌活性检测

目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0. 025mmol/L、0. 05mmol/L、0. 1mmol/L、0. 3mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L、1. 0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0. 05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。     

中药蛴螬多肽Probrelin抗白色念珠菌活性研究

[目的] 研究蛴螬多肽Probrelin对白色念珠菌的抗菌活性。[方法] 采用肉汤稀释法测定蛴螬多肽Probrelin对正常菌株及临床耐药菌株的最小抑菌浓度,同时结合平板计数法测定最小杀真菌浓度;通过不同浓度多肽处理后经平板计数绘制时间-杀菌动力学曲线;通过PI吸收实验检测多肽对白色念珠菌细胞膜完整性的影响;通过核酸阻滞实验检测多肽与核酸间是否具有结合作用;通过扫描电子显微镜检测多肽对白色念珠菌形态的影响;通过结晶紫染色法检测多肽对生物膜生成及成熟生物膜的影响;通过显微镜观察多肽对白色念珠菌菌丝形成的影响;通过棋盘法检测多肽与抗真菌药物间的相互效应;通过小鼠皮下感染模型检测多肽在生理条件下的抗白色念珠菌活性。[结果] 蛴螬多肽Probrelin对正常菌株及临床耐药菌株的最小抑菌浓度均为100 μg/mL,最小杀真菌浓度为100-200 μg/mL,且对白色念珠菌的杀菌动力学具有时间和浓度依赖性;该多肽以浓度依赖性的方式影响白色念珠菌细胞膜的完整性,并通过破坏白色念珠菌细胞壁的结构影响其形态,但与核酸间不具有结合作用;该多肽既可抑制白色念珠菌生物膜的形成,又可清除成熟生物膜,同时还可抑制白色念珠菌菌丝的形成;该多肽与抗真菌药物Clotrimazole间具有协同效应;在小鼠皮下感染模型中,该多肽可以有效杀灭白色念珠菌,进而抑制感染。[结论] 蛴螬多肽Probrelin对白色念珠菌具有良好的抑制杀灭活性,可以作为新的药物分子或模板分子用于抗白色念珠菌药物的研发。     

枯草芽孢杆菌BS-Z15代谢产物治疗白色念珠菌感染昆明小鼠的作用

本文就枯草芽孢杆菌BS-Z15发酵液中粗提的代谢产物(metabolites extracted from fermentation broth, MEs)对白色念珠菌的抑制作用进行了研究,并探讨了该提取物治疗感染白色念珠菌的昆明小鼠的作用。根据《产孢丝状真菌液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》测定了MEs的最小抑菌浓度(MIC),进一步在建立小鼠白色念珠菌感染模型基础上,以氟康唑(90 mg/kg)为阳性药物对照组,以生理盐水为模型对照组,以MEs高剂量(90 mg/kg)、MEs中剂量(60 mg/kg)、MEs低剂量(30 mg/kg)为实验组,采用灌胃给药法处理,以一般状况、体重、死亡率,肝脾病变程度、血清中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量变化为评价指标,分析MEs对小鼠白色念珠菌感染模型的治疗作用。结果表明,MEs对白色念珠菌的MIC为0.33 mg/mL,MEs可使酵母态白色念珠菌菌体表面凹陷致死。与模型组比较,MEs高剂量治疗小鼠表现出更好的生理状态,肝脾的损伤程度明显改善,死亡率显著降低,血清中的总抗氧化活性及SOD活性显著增加、MDA含量显著下降。比较MEs不同剂量处理的小鼠,表明治疗效果在一定浓度范围内与剂量成正相关性。说明枯草芽孢杆菌BS-Z15代谢产物对感染白色念珠菌的小鼠有一定的疗效,具有潜在的治疗白色念珠菌真菌病的药用价值。     

黄酮和甾体类化合物的抗真菌活性

用琼脂扩散法对从药用植物中分离到的12个黄酮和5个甾体化合物进行了抗真菌活性实验,其中黄芩甙元(baicalein)、funkioside C和胡萝卜甙(daucosterol)对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和白色念珠菌(Candida albicans)的生长均有抑制作用,对尖孢镰刀菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.112、0.217和0.108g/L,对白色念珠菌的MIC分别为0.264、0.310和0.078g/L。对其构效关系进行了初步讨论。     

肝病患者无菌部位酵母菌感染的临床特征及抗真菌药物的敏感性分析

目的侵袭性酵母菌感染与重症监护室和器官移植等免疫力低下患者的感染率密切相关,本研究分析了酵母菌感染无菌部位的临床分布特征,同时对7种抗真菌药物的体外抑菌活性进行了分析。方法对来自解放军302医院2012年至2017年间无菌部位分离的188株酵母菌,采用微量肉汤稀释法测定酵母菌对常用抗真菌药的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC);分析188株酵母菌的临床分布特征。结果白念珠菌(45.7%)是导致肝病患者无菌部位感染的主要酵母菌,其次是热带念珠菌(18.1%)和光滑念珠菌(16.0%),分离标本以腹水(39.9%)为主;患者年龄主要集中在50～65岁(43.6%)之间,并且以男性(70.7%)为主,光滑念珠菌是导致50～65岁年龄阶段感染的主要非白念珠菌;药物敏感性试验显示伊曲康唑对白念珠菌的MIC_(50)的值为0.25μg/mL而MIC_(90)的值达到了0.5μg/mL,同时卡泊芬净对克柔念珠菌的MIC_(50)的值为0.25μg/mL而MIC_(90)的值达到了0.5μg/mL,因此,除了白念珠菌对伊曲康唑的体外敏感性较低(19.8%)和克柔念珠菌对卡泊芬净的体外感性较低(33.3%)外,其他三唑类药物、棘白菌素类药物和5-氟胞嘧啶对酵母菌均有很高的体外抑菌活性。结论白念珠菌仍然是导致肝病患者侵袭性酵母菌感染的主要菌种,感染患者以老年男性为主,抗真菌药物对白念珠菌和非白念珠菌的体外抑菌活性不同,临床应合理选择抗真菌药物。