淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的构建及鉴定

提取淀粉酶链霉菌SM33基因组DNA,用Hind III部分酶解后回收40 kb～60 kb大小的高分子量DNA,与质粒载体pIndigoBAC536连接,电击转化EPI300感受态细胞,经蓝白斑筛选共挑取了5 184个白色克隆.从文库中随机挑选10个克隆,酶切检测平均插入片段约为50 kb,覆盖了32.4倍基因组.并且插入片段均具有9～15个Not I酶切位点,符合链霉菌基因组特征.通过对BAC文库的筛选,获得苹果酸脱氢酶基因(mdh)的保守序列,与已知的链霉菌mdh具有很高的相似性.淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的建立,对基因克隆、基因组物理图谱、次级代谢途径、新抗生素的发现以及工业用酶的应用等研究均有重要意义.     

温敏核不育水稻5460S细菌人工染色体文库的构建和鉴定

为了构建温敏核不育 (TGMS)基因区域的精细物理图谱并最终分离TGMS基因 ,以温敏核不育水稻 5 46 0S为材料 ,摸索优化了构建植物细菌人工染色体 (BAC)文库的方法 ,构建了一个高质量的BAC文库 .该文库由 1 95 84个克隆构成 ,插入片段平均长度为 1 1 0kb ,相当于水稻单倍体基因组大小的 5倍 ;以分子量分别为 1 40和2 5 0kb的 2个大BAC克隆进行稳定性传代实验 ,经 1 0 0代传代后其插入的DNA片段仍然稳定存在 ;以线粒体和叶绿体基因为探针筛选BAC文库 ,未检验出叶绿体和线粒体DNA的污染 ;以和tms1基因连锁的 3个分子标记作为探针对BAC文库进行了筛选 ,每个探针至少可获得一个阳性克隆 ,利用热不对称性交错PCR(Tail PCR)法成功分离了阳性克隆的左右末端序列 .     

苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析

以pBeloBAC11为载体,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组人工染色体(BAC)文库和质粒BAC文库.根据已克隆的包含复制子ori165在内的3.6kb片段中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针,通过染色体步移方式,对质粒文库和基因组文库进行筛选,得到13个覆盖YBT-1765菌株中质粒pBMB165不同区域的克隆子.通过Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切分析,建立了质粒pBMB165的物理图谱和线状重叠连锁图,并测算出该质粒的大小为82kb.根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB165上转座因子的存在机率.YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案,成功解决了大质粒难克隆的问题.     

适用于链霉菌大片段基因组DNA 克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用

【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大,用传统的cosmid载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造,成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体,用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达实验。【方法】从复合型载体pCUGIBAC1出发,通过λRED介导的PCR-targeting方法,用链霉素抗性基因替换掉原有的氯霉素抗性基因标记,同时插入链霉菌中常用的安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31整合酶基因int、整合位点attP等元件。【结果】成功构建出可装载链霉菌大片段DNA的BAC载体pMSBBACs。使用pMSBBACs构建出链霉菌U27的基因组BAC文库,平均插入片段大小为100 kb。选取其中一个大小为140 kb的BAC质粒进行功能验证,实验证明通过接合转移和原生质体转化的方法都能够将这个大型BAC质粒导入链霉菌模式菌株,并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。【结论】BAC载体pMSBBACs可成功用于放线菌大片段基因组DNA的克隆和异源表达实验。     

甘蓝型油菜A基因组候选BAC克隆的筛选及其插入片段大小分析

选择甘蓝型油菜A基因组10个连锁群上特有的85个SSR分子标记,合成其引物序列,采用四维PCR法筛选甘蓝型油菜-新疆野生油菜二体异附加系BAC文库,成功筛选到甘蓝型油菜A基因组39个BAC克隆,其插入片段介于50～300 kb之间,平均为120 kb。甘蓝型油菜A基因组10个连锁群BAC克隆的获得,对后续开展甘蓝型油菜A基因组染色体识别、基因染色体定位、遗传距离与物理距离间关系分析等均具有重要价值。     

YAC克隆系统

目前,利用质粒和噬菌体作为载体,已完成了许多基因与基因组DNA片段的克隆及作图.但是,质粒和噬菌体所能携带的外源DNA片段的大小是很有限的.一般来说,入噬菌体能携带的DNA片段不超过25kb;Cosmid质粒所能携带的DNA片段不超过45kb.而现在发现的一些大基因,如人类的Factor VIII基因(180kb)和Dystrophin基因(1800kb)都已远远超过上述载体的克隆容量.这些容量较小的克隆载体,在克隆真核基因组的染色体时,遇到了巨大的困难.为了克服这一难题,80     

O139霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及O抗原基因的筛选

合成O-抗原的基因是串联在一起的一个基因簇,提取O139霍乱弧菌基因组DNA,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,电泳回收4～20kb的DNA片段,构建质粒基因组文库.随机筛选重组克隆,获得一株可与O139霍乱弧菌抗血清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌DH5a(pMG320).经鉴定分析重组克隆所表达的O-抗原具有良好的免疫原性及反应原性.酶切分析质粒pMG320,推知其O-抗原基因大小约4.6kb.这为今后O139霍乱疫苗的研制及O139霍乱弧菌O-抗原基因的结构和功能研究提供了条件.     

Ｏ１３９霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及Ｏ—抗原基因的筛选

合成Ｏ－抗原的基因是串联在一起的一个基因族,提取Ｏ１３９霍乱弧菌基因组ＤＮＡ,限制性内切酶ＥcoＲ２Ⅰ酶切,电泳回收４－２０kb的ＤＮＡ片段,构建质粒基因组文库。随机筛选重组克隆,获得一株可与Ｏ１３９霍乱弧菌抗菌清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌ＤＨ５α（pMG320)。经鉴定分析重组克隆所表达的Ｏ－抗原具有良好的免疫性及反应原性。酶切分析质粒pMG320,推知其Ｏ－抗原基因大 ４．６kb.这为今后Ｏ１３９霍乱疫苗的研制及Ｏ１３９霍乱弧菌Ｏ－抗原基因的结构和功能研究提供了条件。     

O139霍乱弧菌质粒基因组文库的建立及O抗原基因的筛选

合成O抗原的基因是串联在一起的一个基因簇,提取O139霍乱弧菌基因组DNA,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,电泳回收4～20kb的DNA片段,构建质粒基因组文库。随机筛选重组克隆,获得一株可与O.139霍乱弧菌抗血清发生凝集反应的重组克隆,命名为大肠杆菌DH5α(pMG320)。经鉴定分析重组克隆所表达的O抗原具有良好的免疫原性及反应原性。酶切分析质粒pMG320,推知其O抗原基因大小约4.6kb。这为今后O.139霍乱疫苗的研制及O.139霍乱弧菌O抗原基因的结构和功能研究提供了条件。     

细菌人工染色体载体的发展和应用

细茵人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)是在大肠杆菌F质粒的基础上建成的高容量、低拷贝的质粒载体.BAC载体已广泛应用于基因组文库的构建及筛选、基因组测序、新基因的发现、图位克隆、BAC微阵列、转基因和动物品种资源保存等方面.本文综述了BAC载体的发展及其应用.