稻瘟病菌Dam1基因的克隆、原核表达及纯化

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr)是一种植物病原真菌,可引发水稻的毁灭性病害—稻瘟病,在全世界范围内造成了极大的经济损失。寻找有效防治稻瘟病的方法迫在眉睫。本课题组在前期研究中发现了一种新的稻瘟病菌致病相关基因——Mo Dam1。本研究以稻瘟病菌的RNA反转录得到的c DNA为模板克隆Dam1的ORF,并将其和p ET-30a连接,构建原核表达载体p ET-30a-Dam1,之后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达Dam1重组蛋白,最终纯化后得到Dam1蛋白。     

稻瘟病菌MoDUO1基因的克隆、原核表达及纯化

MoDUO1基因是稻瘟病菌的致病基因,主要与稻瘟病菌的营养生长、分生孢子发育及致病性相关。本研究旨在构建稻瘟病菌MoDUO1基因原核表达载体,诱导表达并纯化MoDuo1重组蛋白,为后续研究蛋白互作奠定基础。通过RT-PCR扩增得到MoDUO1基因的ORF,酶切回收后与线性化p ET-30a相连,构建了原核表达载体pET-30a-Duo1,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,扩大培养至OD值为0.6~0.8,加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L,37℃,200 r/min诱导2 h,大量表达得到MoDuo1基因重组蛋白,纯化后得到MoDuo1蛋白。     

稻瘟病菌不同生长期蛋白精氨酸甲基转移酶基因的表达分析

精氨酸甲基化是一种广泛存在于真核生物中的蛋白质翻译后修饰,其主要过程为蛋白质精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferases,PRMTs)催化S-腺苷甲硫胺酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供的甲基基团转移到蛋白质精氨酸侧链胍基基团上。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染水稻引起的稻瘟病,每年均会为水稻生产造成严重损失。近年来稻瘟病菌和水稻已成为研究植物病原真菌与寄主植物互作的理想模式生物。生物信息学分析表明,稻瘟病菌中含有4个PRMT基因(Mo PRMT1-4),经蛋白序列比对分析发现,它们均含有保守的甲基转移酶结构域;构建系统发育树,表明稻瘟病菌PRMTs在丝状真菌中高度保守;通过提取稻瘟病菌在不同生长和侵染时期的m RNA,利用实时荧光定量PCR技术,分析稻瘟病菌PRMTs基因的表达谱,发现Mo PRMT1在侵染后24 h表达量达到最高峰,而其他阶段表达水平基本一致;Mo PRMT2与其他3个基因相比,各阶段表达量均较低,且各时期表达水平也没有明显变化;Mo PRMT3在芽管和附着胞发育阶段表达量较高,Mo PRMT3和Mo PRMT4在成熟附着胞时期表达量均达到最高,Mo PRMT4在侵染后42 h也出现表达峰值。这些数据表明PRMTs基因对于稻瘟病菌的侵染致病可能起重要调控作用。     

稻瘟病菌机械敏感性离子通道的鉴定及功能分析

稻瘟病是水稻上危害最为严重的病害之一,其病原菌为子囊菌门稻瘟病菌。作为模式真菌,研究稻瘟病菌的致病机理不仅能为其病害防治提供理论依据,也给其它病原真菌提供借鉴意义。离子通道是细胞内外物质交换的窗口,具有成为防治靶标的潜力,对病害防控具有重要意义。机械敏感性离子通道是一类通过感受细胞膜张力变化来实现胞内外机械信号转导的离子通道。运用生物信息学鉴定了稻瘟病菌的3条机械敏感性离子通道蛋白Mo Msc1,Mo Mid1和Mo Yvc1,进化分析表明它们在真菌里具有保守性。还对稻瘟病菌的小电导率机械敏感性离子通道蛋白Mo Msc1进行了功能分析,该基因沉默并未影响其生长发育、外界胁迫、细胞壁完整性及致病力。     

稻瘟菌MgORP1基因敲除突变株的构建及其表型分析

[目的]了解稻瘟病菌中氧固醇结合蛋白(oxysterol-binding proteins related proteins,缩写为ORPs)家族成员组成情况,构建MgORP1基因缺失突变株和互补株,对MgORP1基因功能进行初步研究.[方法]以ORPs家族的典型结构域"ORD"为靶标,对稻瘟病菌基因组数据库进行BlastP搜索.通过同源重组的策略,构建MgORP1基因缺失突变体,再通过重新导入该基因全长片段获得互补株.然后对野生型、突变体和互补株进行菌落、分生孢子和附着胞形态或形成情况、以及致病力进行比较分析.[结果]稻瘟病菌基因组中含有6个可能的ORPs族蛋白,其中MgORP1基因的破坏降低了稻瘟菌在完全培养基上的菌落生长速率和产孢量.但对菌丝、分生孢子和附着胞的形态,以及在水稻上的致病力没有明显影响.[结论]MgORP1基因可能与稻瘟病菌的菌落生长和产孢量相关.     

稻曲病菌PMK1类同源基因克隆及在稻瘟病菌遗传互补中的功能验证

[目的]克隆稻曲病菌PMK1类MAPK(Mitogen-activated protein kinase)同源基因.[方法]根据丝状真菌MAPK蛋白保守性设计简并引物扩增稻曲病菌MAPK基因部分片段,进而利用TAIL-PCR进行染色体步移和RT-PCR获得UVMK1基因全长和cDNA全长.构建互补载体,交叉互补稻瘟病菌APMK1突变体菌株nn78进行功能验证,包括附着胞分化和致病性测定.[结果]UVMK1基因全长1435 bp,包含3个内含子,编码355氨基酸的蛋白.UVMK1推导蛋白与丝状真菌Magnaporthe grisea PMK1,Fusarium oxysporum FMK1,Fusarium solani FSMAPK,Colletotrichumlagenarium CMK1,Botrytis cinerea BMK1,Claviceps purpurea CMPK1等编码蛋白高度同源.转化稻瘟病菌菌株nn78,获得5个转化子.其中选取的转化子恢复了稻瘟病菌正常的附着胞分化和对大麦叶片的致病能力.[结论]本研究成功分离了首个稻曲病菌MAPK基因,而且UVMK1基因是稻瘟病菌PMK1的同源基因.     

江西稻瘟病菌稻巨座壳致病性分化年度动态变化

为明确江西水稻种植区稻巨座壳菌（稻瘟病病菌）的年际变化规律,本研究采用7个中国鉴别寄主与30个单基因鉴别品系两套鉴别寄主分别鉴定分析了2006-2018年间从江西37个水稻主要种植县市分离的1 161个稻瘟病单孢菌的生理小种、致病力、致病类型与无毒基因型等。研究结果表明,江西稻瘟病菌可以分成7群49个生理小种,其中ZA、ZB、ZC群为优势种群,ZB13为优势小种,出现频率为18.00%,以毒性较强的强致病力菌株为主;江西稻瘟病菌在生理小种构成、优势小种、致病力年际变化方面均具有3-5年的周期性;江西历年稻瘟病菌的致病类型较为丰富且存在年度差异,菌株致病类型占各年度总菌株数的82.79%-98.21%,优势致病型菌株占当年总菌株的3.57%-5.77%;历年稻瘟病菌的无毒基因个数为24-29个,其中Avr-Pizt、Avr-Piz5、Avr-Pik、Avr-Pik(C)在历年供试菌株中出现频率较高,说明与之相对应的抗瘟基因在江西抗病育种与抗性品种布局中具有较好的应用价值。     

砂藓丙二烯氧化环化酶基因RcAOC1的克隆及生物信息学分析

本研究采用PCR技术从砂藓(Racomitrium canescens)中克隆得到丙二烯氧化环化酶(allene oxide cyclase,AOC)基因,命名为RcAOC1。构建了RcAOC1过表达转基因烟草(Nicotiana tabacum)并对T0代转基因烟草进行了基因型鉴定。对RcAOC1进行了相关生物信息学分析,RcAOC1的cDNA开放阅读框长561 bp,编码含有186个氨基酸的多肽序列。RcAOC1蛋白理论等电点为5.16;不稳定系数为56.25,属于不稳定的蛋白质;脂肪指数为25.13,属于疏水性蛋白质。对蛋白的跨膜结构域进行分析,结果显示RcAOC1基因编码的蛋白不含跨膜区。预测RcAOC1蛋白不含有信号肽,属于非分泌型蛋白。砂藓中AOC1蛋白与其它植物中的AOC蛋白质序列具有较高的相似性,其中与小立碗藓AOC蛋白亲缘关系最近。本研究的结果为进一步研究RcAOC1基因的应用奠定了理论基础。     

阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因原核表达质粒的构建及表达

质粒 pMD-18T-ap65-3 经 Xho I 和 BamH I 双酶切, 1.0% 凝胶电泳后纯化回收阴道毛滴虫黏附蛋白 65-3 基因,定向克隆至原核表达载体 pET-32a( ), 构建原核表达质粒 pET32a-ap65-3. 重组质粒转化大肠埃希菌 JM109 感受态细胞中, 筛选阳性克隆, 进行PCR﹑酶切及测序鉴定正确后, 将重组质粒 pET32a-ap65-3 转化于大肠埃希菌 BL21 中,异丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导重组蛋白表达后利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和免疫印迹 (Western blot) 对重组蛋白进行分析鉴定. 本实验为研究阴道毛滴虫病的致病机制及蛋白生物学功能奠定了基础.     

大丽轮枝菌假定蛋白VDAG＿07165的功能

土传病原真菌大丽轮枝菌寄主范围广,引起的黄萎病危害程度重、防控难度大。对病菌重要致病蛋白的挖掘和功能研究有望为病害防治提供新思路。本研究通过前期蛋白质组测序鉴定到一个未知功能结构域DUF1620家族蛋白VDAG＿07165在大丽轮枝菌对马铃薯根部初侵染阶段高表达。缺失VDAG＿07165基因导致大丽轮枝菌产孢量、分生孢子萌发率和穿透力均显著降低,对马铃薯植株的致病力显著减弱。由此说明,假定蛋白VDAG＿07165可在侵染早期通过调控大丽轮枝菌分生孢子的产生、萌发和穿透能力参与该菌对寄主的致病过程。本研究首次探明了DUF1620家族蛋白在土传病原真菌大丽轮枝菌分生孢子产生和侵染中的作用,为挖掘未知功能的新基因及其在真菌发育和致病过程中的功能研究提供了借鉴和参考。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism