橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因克隆及蛋白表达纯化

由橡胶树白粉菌引起的橡胶树白粉病是橡胶树的重要的叶部病害之一,严重影响橡胶的产量。然而目前对橡胶树白粉菌的致病机理研究匮乏。分支酸变位酶是莽草酸途径的关键酶,能够将分支酸转化为预苯酸,为植物提供氨基酸及大量代谢产物,在植物抗病中起到非常重要的作用。而植物病原物在致病过程当中能够分泌分支酸变位酶影响植物莽草酸途径,从而抑制植物的防卫反应。因此研究橡胶树白粉菌分支酸变位酶在其致病过程中的功能具有一定的意义。试验利用同源比对分析在橡胶树白粉菌基因组中获得一个分支酸变位酶同源蛋白,并用PCR克隆获得橡胶树白粉菌分支酸变位酶基因,命名为OHCmu。后续构建GST-OHCmu融合原核表达载体,筛选最优诱导条件,并利用GST亲和层析柱对蛋白进行纯化。结果表明橡胶树白粉菌OHCmu基因大小843 bp,具有1个内含子,编码263个氨基酸;具有d5csma_结构域,属于Chorismate mutaseⅡ蛋白家族;GST-OHCmu融合蛋白外源诱导表达在供试条件下(IPTG:0.8 mmol/L, 16℃)可以有较好的表达,获得融合蛋白大小约为56 kD。经过GST亲和层析柱纯化、切割GST标签后,顺利获得浓度较高、较纯的橡胶树白粉菌OHCmu蛋白。研究结果为后续OHCmu蛋白的特性及致病机理研究提供参考。     

猪抵抗素(resistin)表达载体的构建、表达及表达产物的纯化鉴定

用PCR方法扩增到抵抗素基因(RSTN)并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-RSTN.将重组质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达.SDS-PAGE检测结果表明,重组resistin蛋白分子量大小约30kDa.对表达条件如温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化并用SDS-PAGE检测.结果表明,30℃、4h、IPTG浓度为1mmol/L时,可溶性重组resistin的含量最高.表达产物经Western blot检测证实是Resistin蛋白,并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白.     

eEF1A1基因克隆、原核分泌表达及融合蛋白纯化

eEF1A1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用.以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性.为了获得eEF1A1原核分泌性可溶性蛋白分子,克隆了人eEF1A1蛋白编码序列(约1 300 bp),并成功构建pET22b-A原核分泌表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L终浓度IPTG诱导,经不同温度下包涵体与胞浆蛋白组分分析,快速明确蛋白表达情况,即诱导4 h后,37℃表达于包涵体组分,在30℃分泌表达至胞浆组分.通过His-Trap亲和层析纯化柱进行线性洗脱,Bradford法测定蛋白浓度高达620 mg/mL,SDS-PAGE分析纯度约为95%,蛋白大小符合50 kD,Western blotting显示目的蛋白能被eEF1A1抗体识别;质谱分析证实重组蛋白为人eEF1A1蛋白分子.为进一步研究其与重要功能性蛋白的相互作用及在细胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基础.     

稻瘟病菌侵入机理

猪瘟病广泛分布于水稻栽培的国家和地区,几乎每年都可以调查到该病发生,给生产造成严重损失。研究稻瘟病菌与水稻之间相互作用,特别是近年来开展猪瘟病菌致病的分于生物学研究成了一个热点。1病害循环（1）病菌分生抱于尖端的粘胶和孢子发芽使得孢子粘着在寄主表面;（2）芽     

水稻生防菌株多粘类芽孢杆菌WY110抗菌蛋白的纯化及其基因克隆

通过DEAE—Sephadex A-50离子交换层析和Sephacryl S-200分子筛层析并采用抑菌活性和SDS-PAGE跟踪检测,从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)WY110菌株中分离纯化到一种对稻瘟病菌具有拮抗活性的抗菌蛋白P2(分子量约26kD)。平板抑菌试验表明,在PDA培养基上1．5μg纯化的P2蛋白即可有效地抑制稻瘟病菌菌丝生长,并对所测试的稻瘟病菌不同菌株均表现出抑菌活性。对P2蛋白的N—端测序结果表明,N—末端24个氨基酸序列为H2N—Ala—Asn—Val—Phe—Trp-Glu—Pro—Leu—Ser—Tyr—Tyr—Asn—Pro—Ser—Thr—Trp—Gln—Lys—Ala—Asp—Gly—Tyr—Ser—Asn—。以此为靶序列在网上用BlastP程序对蛋白质序列数据库进行了类似性检索,发现其与来源于芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶前体具有很高的同源性。进一步用此酶的特异底物地衣多糖进行了定性检测,验证了P2蛋白具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性。在此基础上,根据P2蛋白N-末端氨基酸序列及此酶C-端保守性序列设计合成了两端引物,以WY110基因组DNA为模板,通过PCR高保真扩增获得了P2蛋白编码基因的全序列,并克隆到pMD18-T载体上。核苷酸序列分析表明,其5′端72个核苷酸序列与蛋白N-端已知的24个氨基酸序列完全吻合,序列全长为636bp(GenBank登录号：AF284449),编码212个氨基酸;与已报道的一例来源于Paenibacillus polymyxa的β—1,3-1,4-葡聚糖酶基因(gluB)相比,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84％和88．7％。β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有抗稻瘟病菌活性尚未见报道。P2蛋白编码基因的克隆为水稻抗病基因工程提供了有潜在应用价值的新的目的基因。     

细叶百合LpPEX5基因克隆及蛋白表达纯化

[目的]探究Lp PEX5蛋白表达与纯化的最佳条件。[方法]从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因(Lp PEX5),在详细分析该蛋白质同源氨基酸序列比对、进化树、保守区域,二级结构与三级结构预测等生物信息学后,构建到p QE-30原核表达载体上,转化大肠杆菌M15,通过SDS-PAGE凝胶电泳对不同诱导时间、诱导温度、IPTG浓度影响蛋白的表达量进行研究。利用亲核层析树脂纯化获得融合蛋白。[结果]成功克隆出Lp PEX5基因,构建p QE-Lp PEX5原核表达载体并且诱导和纯化出Lp PEX5蛋白。[结论]Lp PEX5蛋白的最佳诱导条件为30℃,1 mmol/L IPTG诱导5h。该研究为分析Lp PEX5蛋白的活性、验证蛋白间的相互作用等后续试验研究奠定了基础。     

猪抵抗素(resistin)的原核表达及表达产物的纯化鉴定

用PCR方法扩增到抵抗素基因(Resistin, RSTN)并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-RSTN。将重组质粒转化大肠杆菌BL-21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测结果表明,重组resistin蛋白分子量大小约30kDa。对表达条件如温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化并用SDS-PAGE检测。结果表明,30℃、4h、IPTG浓度为1mmol/L时,可溶性重组resistin的含量最高。表达产物经Western blot检测证实是Resistin蛋白,并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白。     

家蚕蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表达纯化与结构分析

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC 3.1.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyx mori蛋白酪氨酸磷酸酶h(BmPTP-h)参与了核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)在家蚕体内的复制过程,但目前对于BmPTP-h结构和性质的了解并不多。本文从家蚕中肠克隆了BmPTP-h基因编码序列,分析了BmPTP-h的基因组结构、mRNA结构、序列特征、二级结构和溶液中的状态。同源氨基酸序列比对分析表明BmPTP-h与多种昆虫NPV的PTP序列具有高相似度,暗示了它们可能具有共同的起源和相似的功能。文中构建了原核表达载体,通过大肠杆菌在25℃下表达获得了可溶性的重组BmPTP-h,利用Ni-NTA亲和层析纯化了BmPTP-h。凝胶过滤分析显示BmPTP-h在溶液中可以形成聚集体和单体。圆二色光谱分析显示重组的BmPTP-h包含α螺旋结构,升高温度导致BmPTP-h的α螺旋结构去折叠,α螺旋结构含量下降。这些研究为深入研究BmPTP-h的结构和调控机理提供了基础。     

鰤鱼诺卡氏菌SOD基因克隆与表达及其酶活性质测定

鱼类的诺卡氏菌病主要由鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)引起。为探讨鰤鱼诺卡氏菌的毒力因子及其感染致病机制,本研究通过对鰤鱼诺卡氏菌全基因组序列的分析,发现了一个编码超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的基因。生物信息学分析显示该基因编码一个分泌蛋白,可能是鰤鱼诺卡氏菌潜在的毒力因子。本研究通过基因克隆获取了鰤鱼诺卡氏菌SOD基因(NsSOD),其长度为624 bp。利用双酶切技术在含有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-1中插入NsOD基因片段,成功构建了其重组表达载体并命名为pGEX-SOD。将pGEX-SOD导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得了原核表达菌株BL21/pGEXSOD并对其诱导表达条件进行了摸索,确定25℃、IPTG(1 mmol/L)诱导14 h,可成功获得具有生物活性的可溶性NsSOD重组蛋白。随后利用GST标签亲和柱纯化NsSOD重组蛋白,并进行酶活性质测定,确定NsSOD重组蛋白的活性为2.76酶活力单位。通过对NsSOD进行基因克隆、原核表达、重组蛋白纯化及体外酶活性质测定,为进一步研究NsSOD的功能和深入了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。     

水稻锌指蛋白OsRZ3基因克隆及融合蛋白的原核表达、纯化

根据NCBI登录的水稻锌指蛋白基因(NO.AK062094,OsRZ3 gene)设计特异引物,通过RT-PCR克隆该基因cDNA全长序列,核苷酸测序并比对氨基酸同源性表明具有C2HC-锌指结构域、分析预测蛋白质分子量为34kD和等电点为9.05;拟南芥原生质体亚细胞定位检测表明其在细胞核。构建pGEX6P-3::OsRZ3融合载体,电转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株经1 mmol·L-1IPTG小量诱导表达,SDS-pAGEX蛋白电泳表明60 kD融合蛋白4 h最大;在LB液体培养中0.5 mmol·L-1IPTG过夜大量诱导表达,通过GST吸附柱层析获得大量包涵体纯化蛋白,1L菌液可诱导纯化到浓度1.58 mg·mL-1包涵体融合蛋白。所构建的融合蛋白原核表达系统能有效表达pGEX6P-3::OsRZ3融合蛋白,0.5 mmol·L-1IPTG大量诱导,通过GST柱吸附获得包涵体纯化蛋白,为作进一步的抗体制备和染色质免疫共沉淀等DNA结合的特性研究准备了基础。     

Cloning,Sequencing, and Expression of the Gene Encoding a Cell-bound Multi-domain Xylanase from Clostridium josui,and Characterization of the Translated Product

The nucleotide sequence of the Clostridium josui FERM P-9684 xyn10A gene, encoding a xylanase Xyn10A, consists of 3,150 bp and encodes 1,050 amino acids with a molecular weight of 115,564. Xyn10A is a multidomain enzyme composed of an N-terminal signal peptide and six domains in the following order: two thermostabilizing domains, a family 10 xylanase domain, a family 9 carbohydrate-binding module (CBM), and two S-layer homologous (SLH) domains. Immunological analysis indicated the presence of Xyn10A in the culture supernatant of C. josui FERM P-9684 and on the cell surface. The full-length Xyn10A expressed in a recombinant Escherichia coli strain bound to ball-milled cellulose (BMC) and the cell wall fragments of C. josui, indicating that both the CBM and the SLH domains are fully functional in the recombinant enzyme. An 85-kDa xylanase species derived from Xyn10A by partial proteolysis at the C-terminal side, most likely at the internal region of the CBM, retained the ability to bind to BMC. This observation suggests that the catalytic domain or the thermostabilizing domains are responsible for binding of the enzyme to BMC. Xyn10A-II, the 100-kDa derivative of Xyn10A, was purified from the recombinant E. coli strain and characterized. The enzyme was highly active toward xylan but not toward p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, or carboxymethylcellulose.     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。     

米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建米曲霉木聚糖酶基因的真核表达载体,并转化巴斯德毕赤酵母,进行分泌表达。方法:以米曲霉总RNA为模板,根据已知的米曲霉木聚糖酶基因序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆木聚糖酶基因cDNA序列,将其与pPIC9K质粒连接构建表达载体后转化毕赤酵母,经MM/MD快慢斑筛选,得到Muts型重组子,进行甲醇诱导表达。结果:克隆得到的cDNA序列全长666 bp,连续编码221个氨基酸;阳性克隆子在诱导培养数天后,将菌液点于RBB-木聚糖平板上,产生了明显的透明圈,表明重组木聚糖酶在毕赤酵母中获得表达。结论:木聚糖酶基因的真核表达载体构建成功,并能够在毕赤酵母中表达。     

Cloning and Characterization of the nagA Gene that Encodes β-N-Acetylglucosaminidase from Aspergillus nidulans and Its Expression in Aspergillus oryzae

We isolated a β-N-acetylglucosaminidase encoding gene and its cDNA from the filamentous fungus Aspergillus nidulans, and designated it nagA. The nagA gene contained no intron and encoded a polypeptide of 603 amino acids with a putative 19-amino acid signal sequence. The deduced amino acid sequence was very similar to the sequence of Candida albicans Hex1 and Trichoderma harzianum Nag1. Yeast cells containing the nagA cDNA under the control of the GAL1 promoter expressed β-N-acetylglucosaminidase activity. The chromosomal nagA gene of A. nidulans was disrupted by replacement with the argB marker gene. The disruptant strains expressed low levels of β-N-acetylglucosaminidase activity and showed poor growth on a medium containing chitobiose as a carbon source. Aspergillus oryzae strain carrying the nagA gene under the control of the improved glaA promoter produced large amounts of β-N-acetylglucosaminidase in a wheat bran solid culture.     

米根霉菌ldhL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以米根霉菌基因组DNA为模板,根据GenBank上已公布的米根霉L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)序列设计特异性引物,PCR扩增得到963 bp的DNA片段,经序列分析后将其亚克隆到原核表达载体pET30a上,构建成重组质粒pET30a-ldhL.将pET30a-ldhL转化到BL21感受态细菌中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,可见约43 kD的与预期大小一致的目的蛋白条带,结果表明ldhL基因在大肠杆菌中进行了表达,经酶活分析产物的酶活力为98 U/mL,证明了表达产物具有预期的酶活性,这为进一步研究利用乳清为发酵原料高产L-乳酸的米根霉基因工程菌株奠定了基础.     

砂梨CONSTANS基因的克隆及原核表达分析

为了探索梨树植物的开花调控机制,本研究以砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)叶片为材料,采用同源序列克隆法,进行了开花调控相关基因CONSTANS的克隆,命名为PyCO,GenBank登录号为KF246572。序列分析表明,该基因包含一个1023 bp的开放阅读框,编码340个氨基酸,推测蛋白质分子量为37.81 kD,等电点为5.95。PyCO蛋白具有典型的植物CO家族的结构特征,含有2个高度保守的B-box及CCT结构域。进化树分析表明,该氨基酸序列与苹果的同源性接近93%,与碧桃、可可树、草莓等其他高等植物的CO类蛋白同源性也在70%以上。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白,分子量约为58.5 kD,为进一步探索梨树开花调控机理奠定了基础。     

米曲霉木糖还原酶基因的克隆及序列分析

木糖还原酶（XR, EC 1.1.1.21）是真菌微生物代谢木糖的关键酶之一。本文以米曲霉基因组DNA为模板,克隆木糖还原酶基因（xr,GenBank登录号：FJ957890.1）,并对XR的序列、系统进化树、理化性质及蛋白结构等进行生物信息学分析。结果表明： xr基因序列长1449 bp,其中开放阅读框长960 bp,编码319个氨基酸,蛋白质分子质量35.9 kDa,等电点为5.78;米曲霉XR与其他菌种XR有较高的同一性,含有醛酮还原酶家族的两个指纹结构和一个参与辅酶结合活性位点指纹结构,以及醛酮还原酶家族典型的（β/α）8 TIM桶结构,说明米曲霉XR属于醛酮还原酶家族。