金鱼Prox1基因cDNA的克隆及其在眼睛发育中的表达分析

脊椎动物的Prox1基因,与果蝇的转录因子prospero同源。为了探讨Prox1基因在金鱼眼睛发生过程中的表达图式,我们从金鱼眼睛SMART库中克隆了Prox1cDNA。它全长共2851bp,编码739个氨基酸。组织分布研究表明,Prox1主要分布于眼、脑、心、肝、脾和肾中。整体原位杂交显示,Prox1mRNA首先是在晶体期的晶体原基中有转录,心跳期则在未成熟晶体的细胞中和视网膜的幼芽区可以检测到。晶体纤维形成后,它主要定位于视纤维层和内网织细胞层。免疫组化显示,心跳期Prox1蛋白的定位与mRNA相同,晶体纤维形成以后,Prox1蛋白主要定位在晶体上皮细胞内侧的晶体纤维上一个环状区域,与Prox1mRNA的定位不同。这说明,Prox1基因在晶体发生过程中有重要作用,且在晶体的不同发育时期起的作用可能有所不同。另外,Prox1在晶体发育过程中有一个从内向外的变化过程。     

用PCR-SSP方法检测中国恒河猴Mamu-DRB*W101和Mamu-DRB*W201基因

利用序列特异引物聚合酶链反应（polymerase chain reactionsequence-specific primers，PCR-SSP）方法扩增中国恒河猴的主要组织相容性复合体II类基因Mamu-DRB*W101、- DRB*W201，初步了解中国恒河猴中Mamu-DRB*W101、- DRB*W201基因的阳性率。采集中国恒河猴静脉血，用DNA提取试剂盒提取全血DNA，分别用Mamu-DRB*W101、- DRB*W201特异引物PCR扩增Mamu-DRB*W101、- DRB*W201基因的第二外显子区域，并对扩增出的阳性条带进行测序，与已知序列对比验证序列是否正确。共检测了来自136只中国恒河猴的样本，PCR检测出Mamu-DRB*W101阳性个体10只，Mamu-DRB*W201阳性个体也是10只，其阳性个体所占比率均为7.35%。测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列与基因库中的序列完全一致。本研究表明中国恒河猴中存在Mamu-DRB*W101、- DRB*W201基因阳性个体，为中国恒河猴在AIDS研究中的应用及进一步分析中国恒河猴MHC II类基因提供了基础。     

Sox1基因在爪蟾早期发育中的时空表达图式

克隆了非洲爪蟾的Sox1基因并研究了它在非洲爪蟾早期发育过程中的时空表达图式，比较了Sox1—3基因在发育的脑和眼中的表达图式。序列比对分析显示Sox1—3蛋白在其HMG框结构域具有高度的保守性。通过RT-PCR方法分析了Sox1基因在爪蟾早期不同发育时段的表达情况，结果显示Sox1基因从未受精卵到尾芽期均有表达，但表达强度有所差异。原位杂交结果显示，在早期卵裂阶段和囊胚期，Sox1基因主要在动物极表达；从神经板期开始，Sox1基因主要在中枢神经系统和眼原基中表达。在蝌蚪期，Sox1与Sox2、Sox3在脑部和眼睛的表达区域有所不同。对于爪蟾Sox1基因时空表达图式的研究将有助于阐明SoxB1基因家族在脊椎动物神经系统发生过程中的作用。     

基因抗虫玉米对玉米蚜种群增长的影响

在人工气候箱条件下研究了玉米蚜（Rhopalosiphum maidis Fitch）取食表达cry1Ab杀虫蛋白Bt抗虫玉米的实验种群生命表.结果表明:两种不同Bt玉米杂交种DK647BTY (MON810转化事件)和NX4777(Bt11转化事件)对玉米蚜的生长、发育、繁殖和存活均无明显的不利影响,玉米蚜在DK647BTY和NX4777两种Bt玉米品种上的内禀增长率r_m、周限增长率λ和种群净增殖率R₀与各自对照之间没有显著差异;玉米蚜有翅蚜比率、各龄若虫的死亡率在Bt玉米和对照以及不同品种之间没有明显差异;Bt玉米对玉米蚜的寿命和繁殖历期也没有明显差异.表明表达cry1Ab杀虫蛋白的Bt玉米对玉米蚜的生长发育和繁殖没有明显影响.     

鸡Z染色体上DMRT1基因的多重跨染色体剪接

性别决定与分化发育是同时涉及生命现象中两种细胞分裂(有丝分裂和减数分裂)形式的惟一的分化发育过程。对该过程中关键基因DMRT1的转录分析，发现位于鸡Z染色体上的DMRT1基因分别同时与4号染色体上的CENP C1基因、5号染色体上CD5R基因和2号染色体上37LRP/p40基因发生跨染色体剪接，由此构成了新的跨染色体剪接本DMRT1-CENP C1、DMRT1-CD5R和DMRT1-37LRP/p40。对其剪接位点的分析，发现两段染色体序列存在的重叠区可能在这种剪接中起着重要作用。DMRT1基因在转录过程中同时与多个染色体上基因发生多次跨染色体剪接的发现，无疑有助于对在转录水平上的多样性基因调控以及性别决定与分化发育等的认识开辟另一新途径。     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

基因3′端PCR-SSCP遗传多态性及其遗传效应

采用PCR-SSCP方法对长白猪、大白猪、杜洛克猪、山西黑猪和马身猪共636头猪的肌细胞生成素（Myogenin,简称MyoG）基因3′端的遗传多态性进行检测,分析MyoG基因对猪的初生体质量、断奶体质量、6月龄体质量和背膘厚的影响。根据已发表的猪MyoG基因3′端侧翼序列设计3对引物,发现F1/R1引物对扩增的片段有多态性。统计结果发现：长白、大白、杜洛克猪种B基因为优势基因,其基因频率分别为0.8807、0.7256和0.8581;山西黑猪种A基因为优势基因,其基因频率为0.9359;马身猪种只检测到A基因。χ²独立性检验表明,基因型分布在外来猪种（长白猪、大白猪、杜洛克猪）与地方猪种（山西黑猪、马身猪）间存在极显著差异(P<0.01)。固定效应模型分析结果表明,初生体质量基因型间差异显著(P<0.05),而断奶体质量、6月龄体质量和背膘厚基因型间差异不显著(P>0.05)。最小二乘分析结果表明,BB基因型与其它2种基因型比较有较大的初生质量,同AA和AB型比较差异极显著(P<0.01)。因此,推测MyoG基因对个体的初生体质量存在一定的影响,选择带有B等位基因的个体有望提高个体的初生体质量。     

基因序列分析

为了解2007 ― 2008 年北京地区流行的肠道病毒71 型( EV71) 是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系, 我们选择2007 年分离的3 株EV71( 其中1 株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本, 其余2 株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本) 和2008 年分离的5 株EV71( 其中3 株分离自重症手足口病患儿的咽拭子或鼻拭子标本, 2 株分离自普通手足口病患儿的疱疹液标本) , 提取基因组RNA, 经反转录-聚合酶链反应( RT-PCR) 扩增得到VP4 基因片段, 并进行核苷酸序列测定, 使用生物信息软件与GenBank 中的EV71 VP4 基因进行序列及病毒型别分析。结果表明, 所测得的8 株EV71 VP4 基因全长均为207 bp, 编码69 个氨基酸, 理论相对分子质量( Mr) 为7 ×10³。8 株EV71 病毒VP4 基因的核苷酸同源性在94% ～100% , 与GenBank 中其他EV71 病毒株VP4 的核苷酸同源性为82% ～100% , 与阜阳、深圳和台湾等地区流行的EV71 VP4 的核苷酸同源性比其他地区高。除了与印度报道的VP4 编码的氨基酸在第7 和54 位不同外( 印度株: 7 位蛋氨酸, 54位苏氨酸; 其余株7 位苏氨酸,54 位丙氨酸) , 这8 株EV71 VP4 编码的氨基酸序列之间以及与其他EV71 VP4编码的氨基酸同源性均为100%。8 株EV71 病毒VP4 与文献报道的3 株重症感染病毒株VP4 ( BrCr、MS 和NCKU9822) 核苷酸有较大差别, 而8 株病毒株中从重症感染( BJ97、BJ110B、BJ110Y 和BJ4243) 与轻症感染( BJ25、BJ47、BJ65 和BJ67) 分离到的毒株之间VP4 基因序列未见明显改变, 只有几个核苷酸存在差别。VP4 核苷酸序列的进化树分析表明, 这8 株EV71 均属于C4 亚型, 显示2007 ― 2008 年北京地区流行的EV71的VP4 基因相当保守, 分离自伴有神经系统感染的重症手足口病和普通手足口病患儿的EV71 的VP4 基因之间在核苷酸水平未出现同样的变异。结果提示, 近2 年来北京地区所流行的EV71 属C4 亚型。     

紫茎泽兰花蕾发育过程中类Beclin1基因的克隆表达分析

以紫茎泽兰不同发育时期花蕾为实验材料,通过光学显微观察、DNA ladder检测表明紫茎泽兰花蕾发育过程中绒毡层有PCD现象发生,自紫茎泽兰花蕾中克隆长为679 bp的Beclin1 cDNA基因部分片段,同烟草叶片的Beclin1基因序列（AY701316）同源性为98%,通过Northern blotting分析,在紫茎泽兰花蕾发育过程中细胞程序性死亡（PCD）相关Beclin1基因表达在花蕾发育第Ⅱ期和Ⅲ期较为旺盛,且在花蕾发育第Ⅱ期最强烈。本研究首次克隆并证实紫茎泽兰花蕾Beclin1基因与PCD有一定的相关性,为分析紫茎泽兰入侵机理提供新的思路和手段。     

C差异与气体交换参数

在苗木生长的不同时期对13个毛白杨(Populus tomentosa)杂种无性系叶片碳同位素δ¹³C和气体交换参数(净光合速率P_n、蒸腾速率T_r、瞬时水分利用效率WUE_i、气孔导度G_s和胞间CO₂浓度C_i)的差异进行研究, 分析不同无性系间δ¹³C与气体交换参数的相互关系, 目的在于探求δ¹³C在筛选高光合及高水分利用效率毛白杨杂种无性系中的应用价值。结果表明: 不同生长时期和不同无性系间δ¹³C、T_r、WUE_i、G_s和C_i的差异均显著, δ¹³C和WUE_i表现为9月＞7月, T_r、G_s和C_i表现为7月＞9月, P_n在不同生长时期差异不显著。季节变化是引起毛白杨杂种无性系叶片δ¹³C差异的主要原因。同一时期, 无性系间δ¹³C和WUE_i表现出较好的一致性, 即WUE_i较高的无性系30、42、46、83、BL2和BL5, 其δ¹³C值也较高, WUE_i较低的无性系B331和TG34, 其δ¹³C值也较低, 且不同时期(7月和9月) δ¹³C和WUE_i呈较强的正相关, 相关系数r分别为0.739 0和0.545 8, 高δ¹³C可以作为筛选高WUE_i毛白杨的有效指标, 且在苗木生长旺盛时期选育能得到更为可靠的结果。对毛白杨而言, 高WUE_i的无性系, 一般具有适中或较低的G_s和C_i, 但不一定具有很高的P_n, 气孔调节使得毛白杨在不影响光合作用的同时保持较高的WUE。     

N的影响

植物和土壤中的¹⁵N自然丰度值(δ¹⁵N)是评价生态系统N循环的一个重要指标, 而放牧是草原生态系统的主要土地利用方式, 对草原生态系统的N循环过程的改变起着重要作用。该研究测定了内蒙古锡林河流域放牧和围封条件下草原群落主要优势植物和土壤的δ¹⁵N值, 探讨放牧对草原N循环的影响。研究中所测定的8种植物叶片δ¹⁵N变化很大(–4.04‰–4.34‰), 但与植物功能型有一定的相关性。放牧显著降低了大针茅(Stipa grandis)、杂类草和小半灌木木地肤(Kochia prostrata)的δ¹⁵N值。具有潜在共生固氮能力的豆科植物δ¹⁵N偏低负值(–4.04‰ – –1.90‰), 但在放牧和围封条件下无显著差异; 而被认为具有联合固氮能力的羊草(Leymus chinensis), 放牧后δ¹⁵N显著增加, 一定程度上表明了豆科植物和羊草生物固氮能力的存在。所有植物中, 除无菌根侵染的木地肤外, 其他有丛枝菌根真菌侵染记录的物种δ¹⁵N值较低, 通常接近0或为负值, 说明在N限制的内蒙古草原, 菌根转运N可能也是一种重要的N源途径。放牧显著降低了0–20 cm土壤δ¹⁵N值, 这也与过去的研究结果不同。δ¹⁵N的测定为生态系统提供了一个整合时空N循环过程的综合指标, 反映出放牧改变了草原生态系统的N循环。     

体外趋化和小鼠定植能力的改变

空肠弯曲菌( Campylobacter jejuni) 是人类细菌性胃肠炎的病原体。趋化是细菌向合适的寄生部位定向运动, 也是空肠弯曲菌在宿主空肠黏膜表面实现定植的关键起始步骤, 该趋化运动由趋化相关二元信号系统( che-TCS) 以MCPs→Ches→Flis/Mots 方式调控。FliG是Fli 蛋白家族成员, 一些病原菌的FliG被证明是鞭毛马达蛋白, 也是细菌鞭毛马达中开关复合体的必需组分, 但空肠弯曲菌FliG在细菌趋化中的作用未明。本研究中, 我们根据同源重组原理, 构建空肠弯曲菌NCTC11168 株fliG基因敲除( fliG^- ) 突变株, 然后对fliG^- 突变株的动力、趋化和定植能力进行测定。动力实验和体外趋化实验结果证实, fliG^- 突变株在半固体琼脂平板上的菌落直径、在硬琼脂平板上对0. 2 mol/L 脱氧胆酸钠( SDC) 的趋化聚集环直径均明显小于野生株( P <0. 05) 。与野生株比较, 黏附于BALB/c-ByJ小鼠空肠黏膜表面以及空肠内容物中的fliG^- 突变株数量也明显减少( P <0. 05) 。实验结果表明, fliG是空肠弯曲菌鞭毛动力以及细菌感染时向空肠黏膜趋化运动的必需基因。     

南海北部海域Synechococcus和Prochlorococcus生长率和被摄食消亡率 ——变化范围及其与环境因子的关系

2004年首次在南海北部海域使用选择性代谢抑制剂技术进行了Synechococcus和Prochlorococcus生长率和被摄食消亡率的研究。研究结果表明,Synechococcus高丰度值出现在次表层 (15　m或20　m),位于温跃层之上,高生长率往往出现在丰度最大值水层上方;Prochlorococcus丰度在夏季出现次表层最大值,与温跃层深度基本一致,表层生长率高于真光层底部。Synechococcus真光层平均生长率为0.11～1.18　d-1,被摄食消亡率为0.11～0.76　d-1,分布格局均为从沿岸向外海方向升高。Prochlorococcus真光层平均生长率为0.23～0.49　d-1,存在较明显的季节变化,夏季近岸略高于外海,而冬季的趋势正好相反;真光层平均被摄食消亡率为0.12～0.33　d-1,冬夏两季均是近岸高于外海。温度、营养盐和光是影响Synechococcus生长率变化的重要因子。Synechococcus和Prochlorococcus丰度与群落生长率之间不存在相关关系,而与被摄食消亡率之间则存在显著的指数相关。根据Synechococcus和Prochlorococcus的生长率估算了它们的生产力及其对Pico-生产力的贡献     

急性T淋巴细胞白血病原癌基因Lmo2的一种全新剪接模式

Lmo2是隶属于LIM蛋白家族的一个T细胞白血病原癌基因,研究显示,它与胚胎卵黄囊期红系发育、成体血细胞分化相关,并且在血管新生过程中发挥着重要的作用.先前的工作显示该基因编码一个158氨基酸的蛋白质,含有2个串联的特征性LIM 结构域,但对于其转录调控方式尚缺乏系统的研究.为进一步了解Lmo2转录水平的表达调控机制,以正常成人肾组织mRNA为材料,结合SMART PCR及5′RACE技术找到了Lmo2基因的一种新的剪接模式.这个新的转录本只含有2个外显子,编码一个151氨基酸的蛋白质.有趣的是,这个蛋白质与LMO2蛋白具有相同的可读框,只是N端7个氨基酸序列不同.将含有转录起始点上游294核苷酸至下游180核苷酸的基因组片段插入报道基因载体并转染COS7细胞系,显示出稳定的启动子活性.对各种不同来源的组织、细胞系进行RT-PCR检测,发现此种剪接模式以不同丰度广泛存在. 关键词     

丹参ACC氧化酶基因(SmACO1)的克隆与序列分析

依据丹参转录组数据库序列信息,采用RT-PCR和染色体步移技术从丹参中首次克隆得到ACC氧化酶基因,命名为SmACO1(GenBank注册号为JQ026111)。该基因gDNA序列长1 347 bp,由3个外显子和2个内含子组成;cDNA全长1 117 bp,包含945 bp的开放阅读框,编码314个氨基酸残基。生物信息学分析显示SmACO1为无信号肽与跨膜结构域,且定位于细胞质的稳定亲水蛋白,含有Fe²⁺依赖的加氧酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,SmACO1基因在丹参不同组织器官中差异表达,花中表达量最高;其表达受到病原菌和茉莉酸甲酯的诱导,表明SmACO1基因可能在植物防御反应中发挥作用。     

miR-34基因家族的分子进化

根据miRNA基因在进化中高度保守的特点，利用生物信息学方法在目前已测序的动物物种中搜寻参与哺乳动物早期发育调控的mir-34基因的同源序列，在33个不同的动物物种中获得了miR-34基因的54条同源序列，其中18条为新发现的序列。表明miR-34是高度保守的，广泛存在于后生动物中。目前发现的mir-34基因80％位于基因间隔区，少数位于蛋白编码基因的内含子区和3′UTR上。不同动物中，mir-34基因成熟序列的同源性为68%，前体序列为38.89%。在无脊椎动物中只有一个mir-34，而在几乎所有的脊椎动物中都有mir-34a，mir-34b，mir-34c, 形成miR-34基因家族。系统进化分析表明,脊椎动物中miR-34基因家族是通过基因的串联和局部重复形成的，这个过程中伴随着个别碱基的变异。     

外源性双链RNA对小鼠卵母细胞basonuclin基因表达的影响

在植物及低等动物线虫中, 引入外源性双链RNA(dsRNA)会导致细胞中同源mRNA降解, 从而干扰其内源基因的表达, 这可能是有机体防范病毒或转座子诱导DNA突变的一种生理机制, 称为RNA干涉(RNA interference, RNAi). 利用RNAi研究basonuclin基因在卵母细胞发生过程中的功能. 将basonuclin特异的dsRNA导入小鼠生发泡期卵母细胞, 可有效降低其mRNA的丰度, 这种降解作用与dsRNA的浓度及作用时间成正比, 但不影响非同源基因的表达, 证明basonuclin dsRNA能特异识别、降解其内源基因的转录产物. 免疫组化实验显示, dsRNA能降低卵母细胞中basonuclin蛋白的水平, 但其效率不如RNAi对tPA及cMos基因活性的抑制, 这可能是由于basonuclin蛋白的半衰期较长, 而生发泡期卵母细胞在体外存活时间较短. 结果表明, dsRNA能阻抑卵母细胞中同源基因的表达, 其作用相当于基因敲除. 质粒表达的发夹环型dsRNA也可以有效降解basonuclin转录产物, 这为研究basonuclin在卵母细胞发育早期的功能提供了新的手段.     

枸杞LbMYB103基因克隆及转化拟南芥的研究

以枸杞品种‘宁杞1号’花药为材料,采用 RT-PCR技术,分离了R2R3类MYB基因LbMYB103包含完整开放阅读框（ORF）的cDNA片段,碱基序列与已知基因HQ415755完全一致。运用Gateway技术构建LbMYB103基因植物过表达载体pMDC83-LbMYB103,利用基因枪法将融合有绿色荧光蛋白（GFP）的过表达载体转入洋葱表皮细胞,将LbMYB103基因定位在细胞核。实时荧光定量PCR分析发现,LbMYB103基因在花药中优势表达,果实中表达量较低,在根、茎和叶中均未检测到其转录本,推测LbMYB103基因可能在花药发育过程中起重要作用。通过根癌农杆菌介导法将pMDC83-LbMYB103转入拟南芥（Col-0）,经筛选获得T₁代抗性再生植株52棵,PCR鉴定有41棵阳性植株,收获T₁代种子,经抗性筛选获得T₂代抗性植株29棵,PCR鉴定有23棵阳性植株。实时荧光定量PCR分析表明,LbMYB103在拟南芥植株的基因组中正常表达。表型观察发现T₁和T₂代拟南芥花药发育异常,花发育迟缓,果荚短小无种子,进一步表明LbMYB103可能与植物的育性有关。该结果为进一步开展枸杞遗传转化,深入研究LbMYB103基因在枸杞花药发育过程中可能发挥的调控功能奠定了基础。     

橡胶树暹罗炭疽菌Zn2Cys6型转录因子CsGcc1的生物学功能

【背景】暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）是一种重要的病原真菌,可以引起炭疽病,给全球橡胶产业带来巨大的经济损失。Zn₂Cys₆型转录因子是真菌特有的锌指类转录因子,通常参与调控真菌的生长发育过程。【目的】在暹罗炭疽菌中鉴定了一个与稻瘟病菌Gcc1同源的Zn₂Cys₆型转录因子CsGcc1,并研究其功能。【方法】根据同源重组原理构建CsGCC1的基因敲除突变体,并通过营养生长、H₂O₂敏感性、分生孢子产生及萌发、玻璃纸试验和致病性分析,明确CsGcc1的功能。【结果】CsGcc1编码一个含有646个氨基酸的蛋白,而且含有一个GAL4结构域。CsGCC1基因在培养36 h的菌丝及分生孢子中具有较高的表达量。CsGCC1基因敲除突变株营养生长速率降低且对H₂O₂更加敏感。相较于野生型菌株,突变株的分生孢子产量、萌发率及附着胞形成率均降低。此外,CsGCC1的敲除可以明显降低分生孢子的穿透能力,突变株对橡胶叶片的致病力减弱。【结论】Zn₂Cys₆型转录因子CsGcc1参与调控暹罗炭疽菌的营养生长、氧化应激、分生孢子发育及致病性等过程。     

C的海拔响应及其机理

以分布于祁连山北麓中段的两种优势乔木祁连圆柏(Sabina przewalskii)和青海云杉(Picea crassifolia)为研究对象, 分析了高山乔木叶片δ¹³C值对海拔(2 600–3 600 m)、土壤含水量和叶片含水量、叶片碳氮含量的响应及其机理。结果表明, 这两种乔木叶片δ¹³C值均随海拔升高呈增重趋势, 与海拔呈显著正相关关系(p < 0.000 1)。海拔2 600–3 600 m阳坡树种祁连圆柏叶片的δ¹³C值显著高于同海拔梯度阴坡树种青海云杉。祁连圆柏和青海云杉叶片的δ¹³C值均与年平均气温呈显著负相关关系(p < 0.000 1), 与年平均降水量呈显著正相关关系(p < 0.000 1)。祁连圆柏叶片δ¹³C值与土壤含水量(p < 0.000 1)、叶片含水量(p = 0.01)和叶片碳氮比(C/N) (p < 0.000 1)呈显著正相关关系, 与叶片全氮呈显著负相关关系(p < 0.000 1)。而青海云杉叶片δ¹³C值与土壤含水量、叶片全氮、叶片碳氮比和叶片含水量不相关。说明海拔变化引起的水热条件的改变, 尤其是温度变化对高山乔木叶片碳同位素分馏起主要作用, 但各个因子综合对高山植物叶片碳同位素分馏的作用机制可能比较复杂, 需进一步深入研究。