扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。     

扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质

通过PCR方法从扣囊复膜孢酵母基因组DNA中克隆获得α-淀粉酶基因成熟肽编码区（SfA）,插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLACl的d因子信号肽下游,构建重组表达载体pKLACl-SfA。重组载体转化乳酸克鲁维酵母GG799,筛选获得表达α-淀粉酶SfA水平较高的重组茵。酶活检测和SDS．PAGE电泳检测均显示,重组茵分泌重组酶SfA到发酵液中。酶学性质研究表明：SfA最适温度为45℃,最适pH5．0,在pH4．5～5．5、50℃条件下保持稳定。Ca2＋等二价金属离子对SfA酶活有激活作用,EDTA强烈的抑制SfA活性。HPLC分析显示SfA水解糊精获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽三糖是主要产物,占水解产物总量的52％。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因（BGL1）,长度为2596 bp,连接到pGEM-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框,构建成重组质粒pSHL9K.通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株.重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4.培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL.     

α淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌-酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示:在酵母MF-α1因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α-淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97％的淀粉,重组质粒能在酵母中较稳定地存在。     

西方许旺酵母α-淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的分泌表达

目的:将带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中,验证西方许旺酵母α-淀粉酶基因能否在大肠杆菌中有效表达。方法:利用PCR扩增带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因,并将其接入Zeocin启动子片段,构建了重组表达载体GapZA,转化大肠杆菌,验证得到的阳性克隆菌株是否表达α-淀粉酶活性。结果:阳性克隆菌株均有α-淀粉酶活性。结论:证明了许旺酵母α-淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞外,并且表现出明显酶活。     

深黄被孢霉M6-22△6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术,从含有深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中,扩增出1.38kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中,在SC-Ura合成培养基中,选择到酵母工程株YMID6.在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体.通过GC-MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析,结果表明,γ-亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的8.69%.     

马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析(英文)

本研究利用RT-PCR从马铃薯(Solanum tuberosum)茎段总RNA中扩增、克隆了一cDNA分子。该cDNA分子含有一长为1224bp的开放读框,可编码一含407个氨基酸残基的多肽、理论分子量为46.40kD、可能为亲水性的胞外酶。因其氨基酸序列同源于α-淀粉酶,故将该基因命名为amyA1(NCBI收录号:GQ406048.1)。采用半定量RT-PCR方法检测了amyA1基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析了amyA1密码子的偏好性,以期为选择适宜的表达系统提供依据;同时对amyA1的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行了预测。基于NCBI数据库中有物种代表性的29种α-淀粉酶基因序列构建了基因进化树。与NCBI收录的马铃薯α-淀粉酶基因(NCBI收录号:M79328.1)的核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20至第348范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13家族及亚家族相似的催化活性域(PF00128、SM00624),第349至第407范围内的氨基酸残基含有α-淀粉酶C-末端β折叠区域(PF07821)。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的(β/α)8桶状结构以及其它几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,2个马铃薯α-淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦和玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

α－淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α－淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌．酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示：在酵母MF—αl因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α－淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97%的淀粉。重组质粒能在酵母中较稳定地存在。     

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

拟康氏木霉eg1基因的克隆及在酿酒酵母中的分泌表达

从拟康氏木霉3.3002基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因,该基因全长1566 bp,由3个外显子2个内含子组成,编码461个氨基酸.编码蛋白EGI的N端为22aa组成的信号肽,其后依次为催化结构域、连接肽和结合结构域.采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1,并将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载...     

拟康氏木霉eg1基因的克隆及在酿酒酵母中的分泌表达

从拟康氏木霉3.3002基因组中克隆了内切葡聚糖酶EGI基因,该基因全长1566 bp,由3个外显子2个内含子组成,编码461个氨基酸.编码蛋白EGI的N端为22aa组成的信号肽,其后依次为催化结构域、连接肽和结合结构域.采用重叠PCR法获得无内含子的内切葡聚糖酶基因eg1,并将其成熟肽编码序列插入酿酒酵母分泌型表达载体pYEα中,构建成pYEα-Peg1重组质粒,转化酿酒酵母.重组转化子经β-半乳糖诱导,检测表达产物的分子大小以及酶活,结果表明,转化子在刚果红平板上可产生明显的水解圈;酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EG I并分泌到胞外;SDS-PAGE电泳显示EGI蛋白分子量比预期目的蛋白稍偏大.     

古菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

用PCR方法从嗜热古菌Pyrocccus furiosus的基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶成熟肽结构基因,插入pUC19中构建成质粒pUC19-amy,将pUC19-amy外源片段接入酿酒酵母表达载体pXY212多克隆位点,构建成载体pYX212-amy,电转化酿酒酵母W303-1A,转化子成功表达出有活性的高嗜热α-淀粉酶,重组酶具有P.furiosus产生的胞外α-淀粉酶相似的酶学性质,最适pH为5.0,最适温度约为90℃,在121℃下热处理30min酶活仍能保持50%以上。     

深黄被孢霉M_(6-22) Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术 ,从含有深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中 ,扩增出 1 38kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择到酵母工程株YMID6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析 ,结果表明 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 8 69%。     

深黄被孢霉苹果酸脱氢酶基因的克隆和表达

目的 通过对深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22中MDH基因的分离鉴定,为深入了解苹果酸脱氢酶（MDH）的生理特性、结构和功能奠定基础,并进一步探讨生物体中MDH的代谢作用。方法 通过基因克隆的方法以深黄被孢霉的cDNA为模板,PCR扩增获得苹果酸脱氢酶基因MIMDH1。结果 测序结果显示该序列长990 bp,分别编码329个氨基酸。序列分析表明该序列与瓜笄霉菌（Choanephora cucurbitarum）MDH的相同性高达77%。将MIMDH1片段连接到表达载体pET32a(+)中构建重组表达质粒pET32aMIMDH1并转化至大肠埃希菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE电泳检测在50 kD左右有一条蛋白表达条带,经镍柱亲和层析纯化和酶活分析结果显示所纯化的重组蛋白酶活高达379.28 U/mg。结论克隆的cDNA序列MIMDH1是一个新的苹果酸脱氢酶基因,所编码的蛋白具有MDH的活性。     

雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌Δ6-脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉(Thamnidium elegans)As3.2806Δ6-脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)向两端延伸得到1504bp的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSc1的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSc1中异源表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸(GLA)的含量占酵母总脂肪酸的7.5%。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(GenBank,AY941161)。     

雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌△^6 -脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉（Thamnidium elegans）As3．2806△^6 -脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术（RACE）向两端延伸得到1504bp的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的△^6 -脂肪酸脱氧酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSel的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSel中异源表达。通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸（GLA）的含量占酵母总脂肪酸的7．5％。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因（GenBank．AY941161）。     

枯草杆菌α－淀粉酶基因的克隆和表达

以自构的质粒pBEl为载体,采用鸟枪法克隆枯草杆菌168突变株GRl0的α－淀粉酶基因,获得了在大肠杆菌中的表达。该基因片段位于7367bp的Bgl Ⅱ酶切片段上。利用质粒pUB110。将此片段亚克隆到枯草杆菌中,同样也获得了表达。本文还测定了该基因克隆子是否有GR10的抗葡萄糖阻遏效应。     

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ,Ｃ１８：３△６,９,１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ,Ｃ１８：２△９,１２）为底物,在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ,全长为１３７４个核苷酸,编码４５７ 个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是, △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

一个新葡萄糖淀粉酶基因的克隆与表达

根据已报道的米根霉葡萄糖淀粉酶基因序列,通过PCR方法,从天然少根根霉的总DNA中克隆到含有四个内含子的葡萄糖淀粉酶基因。通过设计引物并采取重叠PCR方法删除内含子,获得了新的少根根霉葡萄糖淀粉酶(Rhizopus arrhizu glucoamylase,RaGA)cDNA序列(Accession number:DQ903853)。该基因在毕赤酵母中成功表达,表达产物具有较高的葡萄糖淀粉酶活性。     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸(GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。△^6-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3．5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析表明高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16．26％。