苏云金芽孢杆菌Bt-3701与巨大芽孢杆菌Bm-107种间原生质体融合

具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(B. thuringensis subsp kurstaki)Bt-3701与具有解磷活性的巨大芽孢杆菌(B. megaterium var. phosphaticum)Bm-107原生质体进行了融合。Bt-3701原生质体形成率为99.4％,再生率为21.4％;Bm-107原生质体形成率为97.5％,再生率为23.8％。以PEG为助融剂进行原生质体融合,得到22个融合子,融合率达6.03×10~(-3)。融合子在双抗培养基(DR-CNB)上连续传代12次,得到4个稳定的融合于生物测定表明,融合子既具有一定的杀虫活性又具有一定的解磷活性。     

硅酸盐细菌和苏云金芽孢杆菌原生质体融合

具有解钾活性的硅酸盐细菌──胶质芽孢杆菌（R．mucilaginesus）W9－12与具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌（B．thuringensis）Bt179208原生质体质进行了融合。W9－12原生质体形成率为99．7％．再生率为24．9％,Bt179208原生质体形成率为99．9％,再生率为35％。以PEG为助融剂进行原生质体融合．得到56个融合子．融合率为5．92×10－6。融合子在双抗选择培养基上连续传代10次,得到12个稳定的融合子,生物测定表明,融合子既具有一定的杀虫活性又具有一定的解钾活性。     

芽孢杆菌原生质体的形成、再生及种间融合的研究

原生质体融合技术不仅能使遗传基因高频率重组,而且可以集双亲优良遗传性状为一体.自Schaeffer等人成功地进行了微生物原生质体融合以来,这项技术便广为人们所接受.枯草芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白能抑制多种植物病原菌的生长,苏云金芽孢杆菌生成的伴孢晶体蛋白可毒杀植物害虫.利用原生质体融合技术将这两种芽孢杆菌抑菌杀虫的遗传特性融为一体,选育出防治植物病虫害的新一代生防菌株成为可能,有关这方面的研究国内外尚未见报道.本文报道了抗菌蛋白产生菌TG26-10和晶体蛋白产生菌AS1.904-17原生质体的形成,再生及种间融合的影响因素,为进一步筛选目的融合子提供基础.     

芽孢杆菌原生质体的形成,再生及种间融合的研究

原生质体融合技术不仅能使遗传基因高频率重组,而且可以集双亲优良遗传性状为一体.自Schaeffer等人成功地进行了微生物原生质体融合以来,这项技术便广为人们所接受.枯草芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白能抑制多种植物病原菌的生长,苏云金芽孢杆菌生成的伴孢晶体蛋白可毒杀植物害虫.利用原生质体融合技术将这两种芽孢杆菌抑菌杀虫的遗传特性融为一体,选育出防治植物病虫害的新一代生防菌株成为可能,有关这方面的研究国内外尚未见报道.本文报道了抗菌蛋白产生菌TG26-10和晶体蛋白产生菌AS1.904-17原生质体的形成,再生及种间融合的影响因素,为进一步筛选目的融合子提供基础.     

芽孢杆菌原生质体的形成和质粒转化的研究

测定了芽孢杆菌属中21个种、68个菌株的原生质体形成率。在高渗缓冲液(SMMP 或SMN)中,原生质体形成率在90％以上的有37株。降低高渗缓冲液中钠离子浓度,有利于原生质体的形成。用质粒(pUB 110或pC194) DNA对16株芽孢杆菌的原生质体进行了转化试验。转化成功的共8株：纳豆芽孢杆菌AS 1.107、AS 1.921、幼虫芽孢杆菌AS 1．430、球芽孢杆菌AS 1.1362、迟缓芽孢杆菌#50、苏云金芽孢杆菌松蠋亚种AS 1．294、地衣芽孢杆菌# 18和坚强芽孢杆菌#28。原生质体在DM3再生培养基上的再生率分别为0．1％一19．2％,转化效率分别为1．4×102一1．0×105转化子／μgDNA。转化效率低或未转化成功的菌株,其原生质体的再生率一般都很低或不能再生,有的菌株在形成原生质体后发生自溶。     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。     

芽孢杆菌原生质体融合技术

微生物原生质体融合技术是近20年来国内外细胞工程领域的一个研究热点。1972年匈牙利学者Ｆｅｒｅｎｃｚｙ率先进行了微生物原生质体融合的研究[1]。在1976年匈牙利学者Ｆｏｌｄｅｒ和Ａｌｆｏｌｄ则首次报道了用ＰＥＧ或新生态磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ)种内株间原生质体融合[2];同年法国的Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ等也用ＰＥＧ诱导枯草芽孢杆菌(Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ)进行种内株间原生质体融合获得成功[3]。有关芽孢杆菌原生质体融合的研究,在国内直至1981年才见报道[4]。经典改变微生物遗传性状的手段有两…     

芽孢杆菌和欧文氏菌的原生质体融合的研究

采用原生质体融合技术对带有链霉素标记的芽孢杆菌B12 13 2 和带有红霉素标记的欧文氏菌E2 6 2 3 进行原生质体融合。采用选择性及非选择性培养基对融合子进行 10次重复性传代试验后 ,获得稳定的融合子 2 84株 ,经重复性苎麻脱胶试验 ,从中获得 6株脱胶效果较好的融合子。     

地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

目的：提高地衣芽孢杆菌原生质体的产量和形成率,为进一步提高原生质体转化率打下基础。方法：通过酶解法对地衣芽孢杆菌工业生产菌株Bacillus licheniformis303原生质体的制备及再生条件进行了研究。考察了菌体生长状态、溶菌酶浓度、处理时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对地衣芽孢杆菌原生质体的制备及再生的影响。结果：对数生长后期的菌体,以SMMP作渗透压稳定剂,溶菌酶浓度为100mg/mL,37℃下酶解30min,原生质体生成量可达8×109个/mL;再生培养基选用含1mol/L琥珀酸钠的DM3时,再生率最高可达17%。在此条件下,采用PEG法将游离型质粒pHY-P43-secQ转化宿主菌B.lichenifor-mis303,转化率可达10~15 CFU/μg DNA。     

蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)原生质体形成与再生条件研究

研究了溶菌酶浓度、酶解温度及时间、制备液的pH值、渗透压稳定剂对蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）TO-8-24-2原生质体的形成与再生的影响.TO-8-24-2菌株原生质体形成和再生的最佳条件是以SMM pH7.5作酶解缓冲液,溶菌酶浓度为O.15mg/mL,在37℃下,酶解45分钟.原生质体形成率为91.7%,再生率为13.6%.     

蛋白酶产生菌种间原生质体融合的研究

Baci llus属中的一些种是生产蛋白酶的重要菌株。 采用2500u／ml溶菌酶制备的两种芽孢杆菌原生质体在30％聚乙二醇(Mw6000)的作用下,成功地获得了枯草芽孢杆菌(Bacillusfubtilis)和地衣状芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的种间融合重组子。融合频率为7．47 x10—2．28×10-5经过四代的移接验证,融合子的稳定率达到12—20％。结果表明,两种产蛋白酶的芽孢杆菌融台后,营养缺陷和抗药特性方面可以互补;菌落形态发生某些变化;生产性能有较大的改进。     

原生质体融合构建高效产脂肽工程菌

芽孢杆菌因其可产生多种生理活性物质,在环境污染修复、生物防治、微生物采油等领域具有广阔的应用前景。莫哈韦芽孢杆菌Bacillus mojavensis JF-2和解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens BQ-6是从油田筛选出的产脂肽类表面活性剂菌株, 但在微生物采油实际应用中受到氧气浓度、盐度及pH的限制。原生质体融合是改变微生物代谢功能的一种简便有效的方法,以上述两株芽孢杆菌为对象,利用4因素3水平正交试验来探索菌龄、溶菌酶浓度、酶解温度和酶解时间对原生体制备、再生的影响。此外,对两菌株进行了双亲灭活原生质体融合,通过筛选得到了一株工程菌HY-4,并对其进行了初步的评价。结果表明:菌龄、溶菌酶浓度和酶解时间显著影响芽孢杆菌原生质体制备率及再生率(P<0.05),且在溶菌酶处理前用生理盐水多次洗涤菌体细胞,可提高制备率。两种芽孢杆菌原生质体制备及再生的最优条件均为:菌龄7 h、溶菌酶浓度2.5 mg/ml、酶解时间30 min、酶解温度42 ℃。融合子HY-4的最高耐盐度为15%,可耐50 ℃高温,代谢产脂肽的pH范围为4.0~9.5,且在好氧及厌氧条件下均能够代谢产脂肽,在厌氧条件下生长迅猛(细胞干重>1.6 g/L)。综上所述,融合子HY-4具有较大的应用潜力,该研究为芽孢杆菌的遗传育种打下了方法学基础,并对驱油微生物菌种的选育具有指导意义。     

嗜热脂肪芽孢杆菌与北京棒状杆菌细胞融合初探

对两种不同属间的细菌,嘈热脂肪芽孢杆菌与北京棒状杆菌原生质体的形成,再生及融合进行了研究。初步确定了适应此两种出发菌株的破壁、再生及融合的最佳条件。在此条件下,其破壁率均可达98%以上;LT1菌与LT2菌的再生率分别可达52%与51%;融合率可达2.55×10(?)。试验结果表明,此两种不同属间的细菌细胞融合是完全可能的。10(?)以上的融合率应用于工业遗传育种是完全可行的。     

mel基因在苏云金芽孢杆菌中的转移和表达

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringhensis)是研究较深入、使用较广泛的杀虫细菌,野外使用易受阳光中紫外线的影响而失活。黑色素具有很强的抗辐射作用。将构建的含有嗜麦芽假单胞菌mel基因的质粒pWSY通过原生质体转化导入苏云金芽孢杆菌体内,使后获得了稳定产生黑色素的能力。并在转化子细胞内检测到与供体菌相同的质粒。SDS-PAGE显示该转化子体内额外表达了一分子量约为18kD的蛋白,该蛋白很可能就是转化子表达的酪氨酸酶。经测定,转化子抗辐射作用明显增强,有效杀虫时间显延长。     

抗体-适配子混合夹心法检测炭疽芽孢杆菌芽孢的研究

通过SELEX(SystemEvolutionofLigandsbyEXponentialenrichment)体外筛选技术寻获的能与炭疽芽孢杆菌芽孢特异结合的DNA适配子(aptamer)考察其作为检测分子的能力。利用抗体-适配子混合夹心法,根据显色反应强度,评价适配子检测炭疽芽孢杆菌芽孢的能力。结果表明,适配子可以作为检测分子检测靶物质的存在。适配子检测范围在2-16μg,芽孢的检测范围在4×104-4×107,当适配子16μg,芽孢量为4×107显色的指示强度最强。说明适配子作为检测用分子,具有潜在的实用价值。     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kDa杀蚊蛋白基因在枯草芽孢杆菌中的表达

本文将苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis)130kDa杀蚊蛋白基因亚克隆到pNQ1 22载体上,通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原生质体转化,得到Kmt Cm2的正反向克隆子(pFZl和pFZ2)。 Western—blotting免疫杂交证明130kDa杀蚊蛋白基因在枯草芽孢杆菌中表达了具有免疫活性的130kDa杀蚊蛋白。 所表达的杀蚊蛋白在实验中具有杀蚊活性。     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5表达载体的构建

【目的】构建可以在嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5中表达外源基因的表达载体。【方法】以枯草芽孢杆菌表达质粒pHCMC04为基本骨架,删除木糖诱导的启动子和木糖阻遏蛋白基因,分别插入枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和嗜碱芽孢杆菌N16-5的组成型启动子P EF,构建表达载体pABN165P43和pABN165P EF;将绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因连接至表达载体得到pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp,利用原生质体转化法将其转化至Bacillus sp.N16-5,通过荧光显微镜和多功能荧光读板仪检测报告基因的表达情况。【结果】所构建的表达载体pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp可以在Bacillus sp.N16-5中表达报告基因gfp,荧光定量数据显示,在7.5 h左右开始检测到绿色荧光蛋白的表达,从7.5 h到12 h荧光强度随时间增长迅速并在12 h左右达到最大,最大荧光值在7000左右。【结论】成功构建了2个嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5表达载体,实现了外源基因在嗜碱芽孢杆菌中的表达。     

细菌科间原生质体融合的研究

本文将赖氨酸产生菌——北京棒杆菌1134株进行标记,同时将枯草芽孢杆菌BR151菌株进一步标记后,进行科间原生质体融合的探讨,揭示了科间原生质体融合的可能性。经适宜的条件培养和预处理,再在适宜的条件下,酶解制备亲本株的原生质体,用PEG(MW6000)为聚合剂,经低温短时间处理,将1134衍生株与151衍生株的原生质体进行融合;并在改良的DM_3平皿上加入适量的细胞壁碎片(作引物)与适量的人血清白蛋白制剂,使其再生,结果棒杆菌(在酶解后2.5h.)与枯草芽孢杆菌(酶解后20min)的制备率均已达到99.98％以上,再生率分别达21.3％与90.8％以上。经适温培养48h后,从融合平皿上随机挑出若干个菌落。点种于CM母平皿上,再分别影印于10套选择培养基平皿上,进行鉴定,其融合率达到了3.9×10~(-4)。从菌落形态和菌体形态上可大体分为近1134类型,近151类型和中间类型三种。经连续传代五代后,从融合子中筛选山了几株在摇床上以甜菜糖蜜为原料。产酸水平捉高近一倍的稳定高产融合子。其中Q4413株的产酸率平均达6.56％,10立升小罐发酵产酸率6.52％,糖酸转化率为40.25％,经进一步验证,该菌株的产酸能力和遗传性均是稳定的,为远缘工业微生物育种开辟了新的可行途径。     

地衣芽孢杆菌原生质体最佳形成和再生条件的研究

近年来,微生物原生质体融合及诱变受到广泛重视,实验方法日趋完善,实践证明它是一种有效的育种方法。在微生物原生质体制备和再生过程中,各种微生物所需的最佳条件差别很大。我们研究厂地衣芽孢杆菌53-A,菌株原生质体形成和再生的各种因素及最佳条件,并用光学显微镜和电镜观察了原生质体形成、再生和原生质体的聚集现象,现将结果报道如下。