致癌剂唤醒沉睡的基因

按定义癌细胞是多细胞生物体中行为不受正常细胞调控机理控制的异常细胞。最近的研究戏剧性地表明,使细胞发生癌变的方法之一是激活细胞的致癌基因--这种基因在正常细胞中多少是失活的,但在肿瘤细胞中看来已发生改变或被激活。南加利福尼亚大学的两个美国人WiIson和Jones提出证据证明化学致癌剂的作用之一可能是干扰了使致癌基因及其它细胞基因置于正常控制之下的机理。     

基因丢失或失活在肿瘤发生中的作用研究进展

在癌变原理的研究中,分子肿瘤学领域取得了令人瞩目的成就,发现了与肿瘤发生密切相关的两类基因。第一类是所谓的癌基因(原癌基因),它们是细胞的正常基因,在演化中高度保守,在细胞正常生长和分化过程中有着重要的生理功能。但在外界致癌因素的作用下,通过点突变、DNA重排和基因扩增等方式使这些癌基因激活而导致肿瘤发生。在体外的试验中,用已激活的癌基因去转染特定实验动物细胞,可以使     

用pLNCX2携带人MCPH1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌Caski细胞中对MCPH1表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX2中,构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pLNCX2-shRNA—MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株Caski细胞,并用G418筛选产生稳定的细胞克隆,用RT—PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确,逆转录病毒感染Caski细胞后用G418筛选出稳定的细胞克隆,RT—PCR和Western印迹检测人MCPH1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MCPHI基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染Caski细胞后能明显抑制MCPHImRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响.将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1 mRNA和蛋白表达的变化.重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblotting检测人NFBD1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组.携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础.     

实验性癫痫时脑内c—fos基因与阿片肽及兴奋性氨基酸的关系

细胞癌基因也称原癌基因,其命名与被确定时所在的逆转录病毒和细胞的名称有关。c-fos是v-fos的相应细胞对应物,V-fos是FJB鼠骨瘤病毒中分离出来的,c-fos的蛋白产物与v-fos相似,仅在羧端有差异,c-fos基因正常情况下不会引起癌变,它与细胞生长、分化有关。近来一些实验进一步证明c-fos还与调节细胞功能有关,许多细胞外刺激能诱导c-fos转录增加,一些能激活钙通道的条件、药物,或神经递质如细胞外高钾、钙通道激活剂BAYK     

Pmscv-Ubc9逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的：构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法：聚合酶链反应（PCR）扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果：限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论：携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

Pmscv-Ubc9 逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。     

逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因（mdr—1）导入小鼠？…

本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因ｍｄｒ－１导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人ｍｄｒ－１ ｃＤＮＡ的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞ＰＡ３１７,再经秋水仙素筛选。     

稳定干扰核糖体蛋白RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株的建立

目的建立稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株。方法设计并合成靶向人RPS7基因的shRNA寡核苷酸片段,克隆到逆转录病毒载体pSIREN中,构建重组质粒pSIREN-RPS7-shRNA,转染293T细胞,将包装产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌HeLa细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆,用real-timePCR和Western印迹检测细胞中RPS7mRNA和蛋白表达水平。结果获得了经测序鉴定正确的重组逆转录病毒质粒,逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出的稳定细胞中,RPS7mRNA和蛋白水平均显著低于干扰对照细胞。结论成功构建了靶向人RPS7基因的shRNA逆转录病毒载体,建立了稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株．为进一步研究RPS7在宫颈癌中的生物学功能和作用机制提供了可靠的细胞模型。     

基于逆转录病毒载体的外源基因表达系统的评价和应用

逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的表达水平和稳定性为指标,比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1(+) 表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度 (Relative fluorescence intensity,RFI) 均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染HEK293细胞的RFI值约提高2倍。此外,逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C (Recombinant human activated protein C,rhAPC) 基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率,构建了rhAPC表达水平为10~15 mg/(106 cells·d) 的HEK293细胞系。研究结果表明,逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。     

外源性P53基因的表达对NCI—H358细胞的生长的影响

目前已经证实,肺癌细胞有多种癌基因异常,这些异常在肺癌的发生和发展过程中可起着重要的作用,Ｐ５３基因是一种与细胞生长密切相关的基因。探讨逆转录病毒载体介导外源性Ｐ５３基因对肺癌细胞生长的影响,为肺癌的基因治疗提供实验依据。     

人IL-12重组逆转录病毒载体在HeLa细胞中的表达

目的:包装携带人白细胞介素12(IL-12)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究.方法:携带IL-12的逆转录病毒重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装,G418筛选.在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定.然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa.PCR、RT-PCR方法检测IL-12基因在HeLa中的整合和表达情况.结果:重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现IL-12基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录.结论:成功包装了携带IL-12基因的逆转录病毒,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的基因IL-12在细胞中表达,为今后IL-12基因治疗宫颈癌的研究奠定基础.     

重组逆转录病毒载体GTK的构建及HyTK基因转移的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物９（１,３－二羟基－珍氧基－甲基）鸟嘌呤选择性地杀死肿瘤细胞,将ＨｙＴＫ基因替换逆转录病毒载体ＧｌＮａ中的ｎｅｏ基因,构建成重组逆转病毒载体ＧＴＫ,转染混合包装细胞（双噬性ＰＡ３１７细胞和单噬性ＧＰ＋Ｅ－８６细胞）,通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒,用该重组病毒转染不鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞,用ｙｇｒｏｍ     

逆转录病毒载体介导的人多药耐药基因(mdr-1)导入小鼠造血细胞的实验研究

本文利用逆转录病毒介导的基因转移方法,将人多药耐药基因ｍｄｒ－１导入小鼠造血细胞,并对转基因造血细胞的耐药性及移植特性进行了初步研究。含人ｍｄｒ－１ｃＤＮＡ的重组逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导的基因转移方法导入包装细胞ＰＡ３１７,再经秋水仙素筛选。获得产逆转录病毒的包装细胞,其病毒滴度可达１．２×１０５ｃｆｕ／ｍｌ。在含小鼠骨髓贴壁细胞层的长期培养体系中,利用逆转录病毒上清对造血细胞进行转染。通过抗性ＣＦＵ－ＣＭ检测,其基因转移效率可达７．０％。将转基因造血细胞移植经照射预处理的小鼠,可重建受体小鼠造血功能。小鼠造血重建后４个月,其骨髓造血细胞与外周血细胞可检测到人ｍｄｒ－１ｃＤＮＡ,且骨髓造血细胞对秋水仙素仍保留抗性     

人巨细胞病毒即刻早期蛋白1对白血病蛋白致癌基因结构域的作用研究进展

白血病蛋白致癌基因结构域是间期细胞核内的亚核结构域,是DNA病毒入侵、转录及复制的关键部位,其完整性对病毒感染至关重要。早幼粒细胞性白血病蛋白是白血病蛋白致癌基因结构域的主要蛋白,负责维持其他白血病蛋白致癌基因结构域蛋白的正确定位。为DNA肿瘤病毒的人巨细胞病毒即刻早期蛋白可靶向定位白血病蛋白致癌基因结构域,并使早幼粒细胞性白血病蛋白从白血病蛋白致癌基因结构域移出,从而破坏其完整性。研究病毒对白血病蛋白致癌基因结枸域的作用有助干阐明该娄病毒与细胞转化和肿瘤发生的联系。     

外源性P53基因的表达对NCI-H358细胞生长的影响

目前已经证实,肺癌细胞有多种癌基因异常。这些异常在肺癌的发生和发展过程中可起着重要的作用,Ｐ５３基因是一种与细胞生长密切相关的基因〔１〕。探讨逆转录病毒载体介导外源性Ｐ５３基因对肺癌细胞生长的影响,为肺癌的基因治疗提供实验依据。我们以ＮＣＩ Ｈ３５８细胞为模型,观察研究了Ｐ５３基因对ＮＣＩ Ｈ３５８细胞的形态、生长速度、ＤＮＡ合成、细胞克隆及动物体内癌细胞治疗的影响,作如下总结。     

人转化生长因子β型基因在逆转录病毒载体的克隆及其细胞生长抑制作用

将人转化生长因子β型(HTGF-β)基因克隆到逆转录病毒载体pDO R-Neo中,构建一株重组质粒(pDOT)。然后将pDOT转染到逆转录病毒的包装细胞(ψ2和pA317细胞),组装成为一个携带HTGF-β基因的重组病毒。对重组病毒的滴度,所携带的HTGF-β基因的表达,对感染的NIH 3T3细胞生长的抑制作用进行了初步研究。     

重组逆转录病毒载体GTK的构建及HyTK基因转移的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物９－（１,３－二羟基－丙氧基－甲基）鸟嘌呤（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）选择性地杀死肿瘤细胞．将ＨｙＴＫ基因替换逆转录病毒载体ＧｌＮａ中的ｎｅｏ基因,构建成重组逆转录病毒载体ＧＴＫ,转染混合包装细胞（双噬性ＰＡ３１７细胞和单噬性ＧＰ＋Ｅ－８６细胞）,通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒．用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞,用ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ筛选出阳性细胞克隆（ＨｙＴＫ＋）,经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入肿瘤细胞中,且不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＨｙＴＫ－及ＨｙＴＫ＋的Ｂ１６细胞,光镜下观察２４ｈ和４８ｈ后细胞形态及进行活细胞计数．结果表明,ＧＣＶ浓度大于０．１μｍｏｌ／Ｌ时即对Ｂ１６／ＨｙＴＫ＋细胞有显著的杀伤作用     

三种基因转导方法在不同代龄复制性衰老细胞中的比较研究

以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)为报告基因 ,检测腺病毒、逆转录病毒和脂质体对 2 0代和 33代WI 38细胞的转导效率、EGFP的表达强度、对细胞增殖能力和生物学行为影响 ,比较病毒及非病毒方法对不同代龄成纤维细胞 (WI 38)细胞基因转导的特性 .结果显示 :对 2 0代和 33代WI 38细胞,腺病毒转染效率均最高 ,逆转录病毒其次 ;EGFP表达强度腺病毒最高 ,逆转录病毒最低 ;各方法2 0代细胞转导效率及表达强度均高于 33代细胞 (P <0 0 5 ) .逆转录病毒对细胞繁殖和SA β gal染色没有影响 ,腺病毒和脂质体均能导致细胞增殖能力下降 ,SA β gal染色阳性率上升 ,尤以脂质体明显 (P <0 0 5 ) .表明逆转录病毒介导基因对WI 38细胞衰老进程几乎没有影响 ,且转导效率较高 ,适于衰老细胞转基因研究     

大肠埃希菌嘌呤核苷磷酸化酶基因载体的构建及对胰腺癌细胞的作用

目的构建大肠埃希菌（Escherichia coli）嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase,PNP）基因表达载体,研究其生物活性,为肿瘤的基因治疗奠定基础。方法PCR扩增大肠埃希菌K12的PNP基因,T4连接酶将PNP连接人pMSCV逆转录病毒载体,构建重组逆转录病毒载体pMSCV／PNP。pM—SCV／PNP转化感受态大肠埃希菌XLI-Blue,提取pMSCV／PNP,酶切、PCR和测序鉴定。病毒包装细胞293产生重组逆转录病毒pMSCV／PNP,流式细胞仪测病毒滴度。pMSCV／PNP转染胰腺癌细胞BXPC-3,倒置荧光显微镜观察,FACS分离转染阳性细胞（GFP阳性）。RT—PCR检测PNPmRNA在胰腺癌细胞BXPC-3细胞中的表达,MTT法检测PNP基因的生物活性。结果PCR扩增出大肠埃希菌PNP基因（738bp）,酶切和PCR的电泳条带显示pMSCV／PNP,测序结果正常。293包装细胞产生高滴度（3．6×10^7U／m1）重组逆转录病毒pMSCV／PNP。RT—PCR实验结果表明,pMSCV／PNP转染的胰腺癌细胞BXPC-3表达PNPmRNA。前药6-甲基嘌呤-2’-脱氧核苷（MePdR）作用72h浓度达1．00mg／L,BXPC-3／PNP细胞存活率为10．09％,随着MePdR浓度加大,BXPC-3／PNP细胞存活率继续下降直至为0。结论构建了pMSCV／PNP载体,获得了表达大肠埃希菌PNP基因的BXPC-3细胞克隆,PNP／MePdR自杀基因系统对胰腺癌细胞BXPC-3有较强的抑杀作用。