巴西橡胶树HbCMT的克隆与表达分析

通过PCR和RACE技术克隆了巴西橡胶树中一个染色质甲基化酶(Chromomethylase, CMT)基因（HbCMT）。HbCMT长2697 bp,含有2556 bp的阅读框,编码851个氨基酸。推测HbCMT分子量为95.67 KD,等电点为5.38,氨基酸序列与可可、葡萄、黄瓜、鹰嘴豆、番茄、拟南芥CMT家族成员的同源性分别为77％、74％、72%、67%、64%和52%。定量PCR分析表明HbCMT在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低,此外HbCMT在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。     

巴西橡胶树importin和exportin基因的克隆及其乙烯响应规律分析

为了解巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中importin和exportin基因的功能,采用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了他们的c DNA全长,分别命名为Hb IMP和Hb XPO。结果表明,Hb IMP全长4170 bp,编码1115个氨基酸;Hb XPO全长4108 bp,编码1081个氨基酸。Hb IMP和Hb XPO分别与importin5和exportin1A亚家族的同源性最高。Hb IMP包含18个外显子,17个内含子,而Hb XPO包含30个外显子,29个内含子,且在上游调控序列中都存在乙烯响应元件ERELEE4和LECPLEACS2。在无乙烯刺激情况下,Hb IMP和Hb XPO在根、茎、叶、皮中有表达,但在胶乳中几乎检测不到表达;乙烯处理后Hb IMP和Hb XPO在胶乳中被明显诱导表达。因此,推测Hb IMP和Hb XPO参与了乙烯诱导蛋白出入细胞核的转运。     

巴西橡胶树HbγGCS基因克隆及表达分析

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（TGCS）是细胞内谷胱甘肽（GSH）生物合成的限速酶,GSH在植物许多生理过程中发挥重要作用。本研究采用简并PCR和RACE技术获得巴西橡胶树γGCS基因全长cDNA序列,命名为HbTGCS（GenBank登录号：GU997638）。该基因全长2187bp,最长开放阅读框为1572bp,编码523个氨基酸。进化分析结果表明HbγGCS属双子叶植物γGCS亚类,同葡萄γGCS分为一组,与单子叶植物的亲缘关系较远。半定量RT-PCR结果表明HbγGCS基因在胶乳、叶片、树皮、花中均有表达,以花中表达量最大。健康橡胶树胶乳中HbγGCS达量高于死皮树。HbγGCS表达受乙烯、茉莉酸、过氧化氢、机械伤害、干旱、低温和高盐调控。     

巴西橡胶树HbNAC1基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,利用RACE技术从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了1个NAC类转录因子基因HbNAC1,其cDNA全长为1419 bp,含有完整的开放阅读框,编码309个氨基酸。推导的氨基酸序列含有1个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的相应氨基酸序列的同源性分别达79%、80%、57%和60%。聚类分析表明,HbNAC1属于NAC家族Ⅱ亚族。半定量RT-PCR分析表明,该基因在胶乳中的表达较丰富,经乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量明显增加。     

巴西橡胶树 HbERFB4-1 基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,利用RACE技术分离了巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的1个AP2/ERF类基因,命名为HbERFB4-1。该基因cDNA全长732 bp,含有完整的开放阅读框架,编码147个氨基酸,不含内含子。推导的HbERFB4-1氨基酸序列与杨树(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆(Glycine max)中相应蛋白氨基酸序列的一致性分别为78%、71%、62%和55%,具有典型的AP2类蛋白结构特征。聚类分析表明,HbERFB4-1属于ERF家族B4亚族。半定量RT-PCR分析结果表明,该基因在胶乳中的表达量相对较低,但乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量迅速增加,推测该基因可能参与了胶乳中乙烯信号的转导。     

乙烯利诱导胶乳基因HbEtIe的克隆与表达分析

在成功构建巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA消减文库的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个新的乙烯利诱导表达胶乳基因HbEtIe。分析表明,该基因含有1个158 bp的内含子和2个长度分别为92 bp和178 bp的外显子;cDNA全长551 bp,包含1个270 bp的完整阅读框,174 bp的3′-UTR和107 bp的5′-UTR,推导氨基酸序列中含有一个未知功能结构域DUF581。HbEtIe基因在乙烯利刺激条件下的胶乳中特异性表达并受到乙烯利的调控,其表达量随处理时间的延长而增强。HbEtIe基因与拟南芥衰老相关基因SAG102具有较高的同源性暗示,HbEtIe可能参与了乙烯利诱导巴西橡胶树乳管衰老的分子调控。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶抑制剂HbCYS2的克隆与表达分析

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin,CYS)广泛参与植物的生长发育调控、生物与非生物胁迫应答过程。从橡胶树中获得1个CYS基因,ORF长度为687 bp,编码1个由228个氨基酸残基组成的蛋白,生物信息学分析发现该蛋白含有2个CYS结构域,以及1个含有30个氨基酸残基的信号肽,为分泌蛋白,推测属于植物CYS II型,命名为Hb CYS2(Gen Bank:KX161925)。表达分析发现Hb CYS2在胶乳中高表达,并且受割胶和产量调节剂ET调控;在叶片组织中,Hb CYS2对多主棒孢侵染表现出明显应答。由此推测,胶乳中Hb CYS2在橡胶树胶乳再生、以及割胶伤害应答中发挥一定的调控作用,叶片中Hb CYS2参与橡胶树棒孢落叶病的防御或抵抗。     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA(命名为HbC2)。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5'-UTR和232bp的3'-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。     

巴西橡胶树橡胶生物合成关键基因REF,SRPP,HRT1和HRT2的表达分析

橡胶延长因子REF、小橡胶粒子蛋白SRPP、橡胶转移酶HRT1和HRT2是巴西橡胶树胶乳中的主要橡胶粒子蛋白,它们在橡胶生物合成中发挥重要作用,与橡胶树胶乳产量密切相关。为进一步探明REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达与橡胶树胶乳产量之间的关系,以成龄未开割橡胶树无性系热研7-33-97胶乳为材料,通过实时荧光定量PCR的方法,对割胶伤害、外源乙烯利和茉莉酸刺激的处理条件下,橡胶树胶乳中的REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达进行了分析。结果表明,随着割胶刀次的增加,REF基因在第4刀的表达量最高,而SRPP、HRT1和HRT2基因则在第6刀表达量达到最高;而在乙烯利和茉莉酸刺激处理下,REF、SRPP、HRT1和HRT2基因均在刺激8 h后表达量达到最高。因此,割胶(机械伤害)、外源乙烯利和茉莉酸刺激促进橡胶树产胶可能与它们提高橡胶生物合成相关橡胶粒子蛋白REF、SRPP、HRT1和HRT2的基因表达具有密切关系。     

巴西橡胶树HbMKK4基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MKK)基因HbMKK4。该基因全长cDNA序列1 580bp,编码框1 059bp,编码352个氨基酸,含有S_TKc结构域,其编码蛋白的分子量为38.83kD,理论等电点为9.36。实时荧光定量PCR结果显示,HbMKK4在橡胶树的根、树皮、胶乳及叶片中均有表达。割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中HbMKK4基因的表达,基因相对表达量分别在割胶后2h、茉莉酸甲酯处理8h和乙烯利处理4h后达到最高。研究结果推测HbMKK4可能通过MAPK信号途径参与茉莉酸信号途径的响应,可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用。     

巴西橡胶树HbNAC24基因克隆和表达分析

该研究以巴西橡胶树为实验材料,从橡胶树胶乳cDNA中克隆了NAC转录因子基因(HbNAC24)完整开放阅读框(ORF),并通过酵母实验和实时荧光定量PCR技术,进行转录激活活性分析和表达分析。结果显示:(1)HbNAC24基因ORF为1 167bp,编码388个氨基酸,在N端第7~174氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域。(2)酵母实验表明,HbNAC24具有转录激活活性,转录激活区在高度变异C端,具备了NAC转录因子的基本特征。(3)序列比对和系统进化分析表明,HbNAC24蛋白属于NAC转录因子家族中的TIP亚族。(4)实时荧光定量PCR分析结果发现,HbNAC24基因在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶和茉莉酸(JA)处理均能够诱导HbNAC24表达上调。研究认为,HbNAC24基因可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

巴西橡胶树一个AP2／EREBP转录因子的克隆及表达分析

本文采用RACE技术从巴西橡胶树中鉴定出一个AP2／EREBP转录因子。该转录因子全长cDNANl225bp,最长开放阅读框699bp,预测编码蛋白包含232个氨基酸;序列比对分析发现,该转录因子具有一段保守的AP2／EREBP结构域,与拟南芥Soloist（At4g13040）具有较高的相似性,将该基因命名HbSoloist。半定量胙PcR分析结果表明,HbSoloist在巴西橡胶树的胶乳、叶片、树皮和花中均有表达。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳HbSoloist表达量明显下降。研究发HbSoloist表达受乙烯利、茉莉酸和低温处理调控,表明HbSoloist基因可能在巴西橡胶树乙烯、茉莉酸和低温反应中发挥作用。     

巴西橡胶树HbPEPRK1的克隆和表达分析

根据先前获得的EST序列,从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了一个编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶相关激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase-related kinase,PEPRK)的基因HbPEPRK1。HbPEPRK1编码区c DNA长度为1 401 bp,编码466个氨基酸。HbPEPRK1蛋白具有典型的的丝/苏蛋白激酶结构特征的结构特征,和其他植物中的类似蛋白具有很高的同源性。对HbPEPRK1启动子区域进行分析,发现含有众多应答激素和环境胁迫信号元件。实时荧光定量分析结果表明,HbPEPRK1在所检测的组织中均有表达,其中在胶乳的表达量显著高于其他组织;乙烯刺激后HbPEPRK1在胶乳中的表达量明显增加。     

巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析

为了解蔗糖合成酶在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生长和发育过程中的功能,利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了蔗糖合成酶基因,并对基因的表达特征进行了分析。结果表明,从巴西橡胶树中克隆了两个蔗糖合成酶基因(HbSS1和HbSS2),HbSS1全长2864 bp,编码806个氨基酸;HbSS2全长2815 bp,编码811个氨基酸。两个基因编码的蛋白具有典型的植物蔗糖合成酶结构特征,包含1个磷酸化位点和两个保守的功能域。半定量RT-PCR分析表明,HbSS1和HbSS2在各组织器官中均有表达,其中HbSS1在叶中的表达量最高,HbSS2在树皮中的表达量最高,这说明HbSS1和HbSS2可能参与了各组织的生长和代谢过程,且功能有所分化。     

巴西橡胶树HbAIH基因的克隆及表达分析

鲱精胺亚胺水解酶(Agmatine iminohydrolase,AIH)是植物通过精氨酸途径合成多胺过程中的重要酶之一。本研究首次从巴西橡胶树中克隆了AIH基因HbAIH。序列分析结果表明HbAIH全长1 462 bp,开放阅读框长为1 137 bp,编码378个氨基酸。预测 HbAIH 蛋白的分子量是42.28 kD,等电点为5.09,是一个亲水性蛋白。氨基酸相似性比对结果表明HbAIH与大戟科木薯MeAIH、蓖麻RcAIH和麻风树JcAIH等具有很高相似性,且含有植物AIH中高度保守的与酶活性位点形成和参与底物结合的11个氨基酸位点。qRT-PCR 分析表明,HbAIH表达无组织特异性,在雌花中表达量最高,树皮、茎尖、胶乳、叶片和雄花中表达量依次降低。HbAIH在不同发育时期叶片中的表达存在变化,稳定期表达量最低,淡绿期最高,说明HbAIH可能参与橡胶树叶片发育过程。此外,低温、干旱、高盐、过氧化氢、乙烯利、茉莉酸甲酯处理以及橡胶树死皮的发生均能引起HbAIH表达变化。这些结果说明HbAIH可能参与了橡胶树生长发育、产排胶调控及逆境应答过程。     

橡胶树ADC1的克隆、表达及生物信息学分析

精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)是高等植物多胺合成的重要酶。为对橡胶树ADC基因表达模式及生物信息学进行分析,采用PCR和测序技术从橡胶树中克隆了一个ADC基因(HbADC1),获得的HbADC1序列长2 594 bp,开放阅读框为2 175 bp,编码724个氨基酸。生物信息学预测HbADC1理论分子量和等电点分别为77.7 kD和5.14。进化分析表明,HbADC1与大戟科植物木薯、麻风树的ADC聚为一支。qRT-PCR分析表明,HbADC1表达无组织特异性,在雌花中表达量最高,茎尖、雄花、叶片、树皮和胶乳次之。HbADC1在不同发育时期叶片中的表达存在变化,稳定期表达量最低,淡绿期最高,说明HbADC1可能参与橡胶树叶片发育过程。此外,HbADC1表达受伤害、低温、干旱、高盐、过氧化氢及乙烯调控,表明HbADC1可能参与橡胶树逆境胁迫和乙烯应答过程。     

巴西橡胶树胶乳和悬浮细胞中MVA和MEP代谢途径基因的表达分析

MVA和MEP代谢途径是植物类异戊二烯代谢途径的两条重要次生代谢途径。该研究利用荧光定量PCR技术,分析了橡胶树胶乳和橡胶树花药愈伤组织来源的悬浮细胞中MVA代谢途径和MEP代谢途径中关键基因的表达水平,同时分析了茉莉酸的结构类似物冠菌素(coronatine,COR)对悬浮细胞中Hb AACT3,Hb HMGR4,Hb HMGR5,Hb DXS2,Hb DXR和Hb SQS1基因表达的调节作用。结果表明:在MVA代谢途径中,基因Hb AACT1,Hb AACT2,Hb HMGS1,Hb HMGS2,Hb HMGR1,Hb HMGR3,Hb MVK,Hb PMK,Hb MVD1,Hb MVD2和IPP下游代谢基因Hb IPPI1和Hb FDPS1在胶乳中的表达量要相对高于其在悬浮细胞中的表达量,然而橡胶树悬浮细胞中MEP代谢途径基因Hb DXS1,Hb DXS2,Hb DXR,Hb CMS1,Hb CMS2,Hb CMK,Hb MCS1,Hb MCS2,Hb HDS,Hb HDR和鲨烯合酶基因Hb SQS1的表达水平要相对高于胶乳。而且COR能不同程度地上调Hb HMGR5,Hb HMGR4,Hb SQS1,Hb DXS2和Hb DXR基因的表达水平。该研究结果为探索利用橡胶树悬浮细胞体系研究次生代谢合成调控以及生产活性次生代谢产物奠定了基础。     

巴西橡胶树HbCMK基因的克隆及表达

根据植物CMK(4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol Kinase,CMK)的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的CMK基因,命名为HbCMK.序列分析表明HbCMK长1 415 bp,编码388个氨基酸,该氨基酸序列与长春花(Catharanthus roseus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜菊(Stevia rebaudiana)、丹参(Salvia miltiorrhiza)、烟草(Nicotiana benthamiana)和水稻(Oryza sativa)的CMK相似性分别达到72.6%、72.5%、71.9%、70.9%、69.0%和66.9%.半定量RT-PCR结果显示,HbCMK的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达,乙烯诱导胶乳HbCMK的表达,伤害对HbCMK的表达几乎没有影响.本实验结果为进一步了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和天然橡胶生物合成的调控奠定了基础.     

巴西橡胶树赤霉素信号转导途径HbRGA1结构和功能分析

DELLA蛋白是赤霉素激素信号负调控因子,具有抑制植物生长发育的作用。解析其家族成员结构与功能将有助于揭示橡胶树DELLA蛋白家族成员调控橡胶树生长发育的机制。本研究从橡胶树热研73397叶片中克隆HbRGA1的cDNA全长序列。该基因长为2136 bp,含1839 bp的ORF,编码613个氨基酸。HbRGA1蛋白序列包含DELLA和GRAS保守结构域,与杨树、木薯和橡胶树DELLA基因相似性高达82.5%。qRT-PCR分析发现HbRGA1在橡胶树叶片中表达量高,在树皮和胶乳中表达量极低。叶片中HbRGA1表达量受喷施赤霉素和脱落酸等诱导显著上调。本研究表明HbRGA1与橡胶树赤霉素等激素信号密切相关,为深入研究其在橡胶树生长发育中的结构和功能打下良好基础。     

巴西橡胶树鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

鲨烯合酶(SQS )是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。以巴西橡胶树为试验材料,提取胶乳总 RNA,利用 RT-PCR 以及 RACE 的方法克隆橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区片段,并进行序列分析。结果表明：橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区为1239 bp,编码413个氨基酸,命名为 HbSQS 。荧光定量分析表明鲨烯合酶基因在不同组织里表达水平存在明显差异,且受乙烯调控。