地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长, 构建了原核表达载体, 转入大肠杆菌(Escherichia coli)中, 使用IPTG于28°C诱导6小时后, 通过SDS-PAGE检测到目的蛋白, 分子量约为55 kDa, 并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体, 通过农杆菌(Agro- bacterium tumefaciens)介导瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum)下表皮细胞并在荧光显微镜下观察, 发现在烟草下表皮细胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I₂-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色, 显色反应表明在烟草中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性。最后, 采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 筛选到稳定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。     

两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位

使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建p CAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。     

植物microRNA功能瞬时验证体系的建立

目的:建立植物microRNA(miRNA)功能的瞬时活体验证体系,并检验该体系的有效性。方法:选用双元表达载体pCAMBIA1200,并插入烟草花叶病毒双35S启动子,以驱动目标miRNA超表达;选用双元表达载体pFGC5941的绿色荧光蛋白(GFP)改造载体用于潜在的靶基因与GFP融合蛋白的超表达,以转入这2种载体的农杆菌侵染烟草叶片,观察GFP融合蛋白的荧光,作为验证miRNA对其潜在靶基因调控作用的瞬时验证体系。选取拟南芥已知功能的miR393及其靶基因AFB3,分别构建pCAMBIA1200-35S-miR393和pFGC5941-GFP-AFB3载体,利用农杆菌注射烟草叶片进行2个载体共转化,并以pFGC5941-GFP-AFB3单转化作为对照,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达。结果:只将AFB3导入烟草表皮细胞,可观察到绿色荧光;而将miR393与AFB3同时导入烟草表皮细胞后,未能观察到绿色荧光。表明miR393抑制了AFB3的表达。结论:本瞬时表达体系可作为植物miRNA功能的活体瞬时验证体系,为miRNA调控靶基因表达功能提供简单、快速、有效的证据。     

植物microRNA功能瞬时验证体系的建立简

目的：建立植物microRNA（miRNA）功能的瞬时活体验证体系,并检验该体系的有效性。方法：选用双元表达载体pcAMBIA1200,并插入烟草花叶病毒双35s启动子,以驱动目标miRNA超表达;选用双元表达载体pFGC5941的绿色荧光蛋白（GFP）改造载体用于潜在的靶基因与GFP融合蛋白的超表达,以转入这2种载体的农杆菌侵染烟草叶片,观察GFP融合蛋白的荧光,作为验证miRNA对其潜在靶基因调控作用的瞬时验证体系。选取拟南芥已知功能的miR393及其靶基因A船3,分别构建pcAMBIA1200-35s-miR393和pFGc5941-GFP-AFB3载体,利用农杆菌注射烟草叶片进行2个载体共转化,并以pFGC5941-GFP-AFB3单转化作为对照,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：只将A朋3导入烟草表皮细胞,可观察到绿色荧光;而将miR393与A期3同时导入烟草表皮细胞后,未能观察到绿色荧光。表明miR393抑制了A朋3的表达。结论：本瞬时表达体系可作为植物miRNA功能的活体瞬时验证体系,为miRNA调控靶基因表达功能提供简单、快速、有效的证据。     

拟南芥谷氨酸受体基因的亚细胞定位

为明确拟南芥谷氨酸受体1.3基因(AtGLR1.3)的亚细胞定位,该实验以拟南芥(Arabidopsis thalianaCo-lumbia ecotype)为材料,运用PCR方法从其基因组中扩增得到了AtGLR1.3的启动子和基因序列,将其连接到载体pBIsGFP上,构建成AtGLR1.3基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体,通过农杆菌介导的花序浸润法将重组载体转化拟南芥野生型,转基因植株通过激光共聚焦扫描显微镜观察显示,GFP荧光信号存在于细胞质膜上,表明AtGLR1.3为细胞膜蛋白.该结果为进一步研究AtGLR1.3的作用机理奠定了基础.     

绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用(英文)

用合成的cry1Ac基因与绿色荧光蛋白基因 (GFP)构成融合蛋白基因 ,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg ,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下 ,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光 ;经抗虫试验、PCR、Southernblot和Westernblot等检测 ,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因 ,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统 ,简化了抗虫转基因植物筛选程序 ,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

绿色荧光蛋白基因（G卯）在抗虫转基因植物研究中的应用

用合成的crylAc基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)构成融合蛋白基因,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光;经抗虫试验、PCR、Southern blot和Western blot等检测,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统,简化了抗虫转基因植物筛选程序,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

拟南芥血红蛋白1的亚细胞定位

为研究拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)基因的亚细胞定位,该实验构建了拟南芥血红蛋白1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pUCGFP/ AtGLB1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白1在细胞中的定位.荧光显微镜检测结果表明,AtGLB1基因表达产物主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中.     

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.     

基于农杆菌介导瞬时转化法的AtGLR1.4亚细胞定位分析

将拟南芥基因AtGLR1.4启动子驱动的AtGLR1.4基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合后,利用根瘤农杆菌介导瞬时转化法(Fast Agro-mediated Seedling Transfomation,FAST)浸染拟南芥幼苗,对其进行亚细胞定位的研究。转基因植株通过激光共聚焦扫描显微镜的观察,发现GFP绿色荧光在叶片表皮细胞的细胞膜上特异表达,表明At-GLR 1.4蛋白定位于细胞质膜上,为其后续的功能研究提供了线索。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的ｃＤＮＡ序列,设计合成了Ａｐ５和Ａｐ３两个引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了拟南芥的ＡＢＰ基因。将该基因克隆在植物表达载体ｐ３５ＳＳＩＮ的３５Ｓ启动子必Ｎｏｓ３‘端之间,得到植物表达载体ｐ３５ＳＥ。通过农杆菌介导的方法对烟草ＳＲ１进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

转人α-乳清白蛋白基因烟草中半胱氨酸含量的提高

将人α-乳清白蛋白基因构建到植物表达载体上,通过农杆菌介导采用叶盘法将人α-乳清白蛋白基因导入到烟草中,经过PCR和Southern blot分析表明:人α-乳清白蛋白基凶已经整合到烟草基因组中;经过RT-PCR葙GUS组织化学染色证明:人α-乳清白蛋白基因得到了表达.测定了9株转基因烟草叶片半胱氨酸含量,大部分植株有着明显的提高,最高幅度达到了318.02%,半胱氨酸含量平均提高了166.40%.     

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

根据已报道的拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）病程相关蛋白基因（PR-1）序列设计引物,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到水杨酸诱导表达的PR-1基因启动子片段,序列分析表明,该启动子含910bp核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99．7％：将该启动子构建到植物表达载体pB1121上,获得病程相关蛋白基因（PR-1）启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体pBI-prlp,将其转入根癌农杆菌GV3101,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究寄主-病原物相互作用的分子机理奠定基础。     

转拟南芥AtKup1基因高含钾量烟草获得

提取拟南芥幼根总RNA,进行RTPCR逆转录,产物测序,将其构建到含Km(带内含子)筛选标记的植物双元表达载体上,根癌农杆菌介导法将AtKup1基因导入烟草,对转化子进行PCR扩增、GUS染色、Southern杂交和AtKup1基因mRNA荧光定量PCR分析,并进行烟叶内在成分化验分析。PCR获得2100bp左右扩增产物,测序结果证实扩增产物序列与拟南芥AtKup1基因(GenbankNo:AF029876)一致;得到GUS染色阳性的AtKup1基因转化烟草材料29株。经PCR扩增、分子杂交检测证实AtKup1基因已整合到转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析可以在幼根中检测到AtKup1基因的mRNA转录。烟叶含钾量化验结果表明导入的AtKup1基因在转化材料中成功表达,使烟叶含钾量提高约45%。     

拟南芥新型脂转移蛋白AtDHyPRP1的亚细胞定位及其对灰霉菌的抗性

通过遗传转化技术研究了拟南芥脂转移蛋白AtDHyPRP1在细胞中的定位及其对真菌病原体的抗性。采用PCR方法从拟南芥Ws生态型克隆了AtDHyPRP1基因,构建产生pRI101-AN-AtDHyPRP1植物双元表达载体和pCAMBIA1302-AtDHyPRP1-GFP融合表达载体,经农杆菌介导的叶盘和浸花法得到烟草和拟南芥转基因植株。AtDHyPRP1基因能够明显增加烟草对灰霉菌的抗性,转AtDHyPRP1烟草叶片的被侵染部位有大量H2O2积累,激光共聚焦显微观察发现AtDHyPRP1蛋白定位于细胞表面。说明AtDHyPRP1蛋白在合成后被分泌到细胞外执行特殊的功能,与植物抗病防御机制有关。     

拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对灰葡萄孢的抗性

通过农杆菌转化法得到了整合有拟南芥AZII基因的烟草植株,进一步利用转基因烟草分析了AZI1蛋白的亚细胞定位及其对真菌病原体的抗性特征。在上下游引物5’端分别引入NcoI和SpeI酶切位点,采用高保真耐热DNA聚合酶彤Pfu从拟南芥Co1-0生态型基因组DNA扩增AZII基因的编码序列,用NcoI和Spel对扩增片段和pCAMBIA1302质粒载体进行双酶切,通过T4DNA连接酶构建产生AZII-GFP融合表达载体。用包含融合表达载体的农杆菌细胞转化烟草叶片,经潮霉素选择获得了完整的再生植株,并收取了T。代种子。激光共聚焦显微观察发现,AZI1蛋白主要定位于细胞表面。病原体侵染结果显示,AZI1基因能够明显提高烟草对灰葡萄孢的抗性。说明AZI1蛋白通过分泌途径被定位到细胞表面后,能够抑制真菌病原体对植物组织的侵染过程。     

拟南芥CYCD2;1基因植物表达载体的构建及在烟草中的遗传转化分析

细胞分裂是生物的基本特征之一,在植物生长发育的过程中,发挥着极其重要的作用,细胞周期蛋白CYCD2;1基因作为一个调控因子,对调节细胞周期具有重要作用。本文以拟南芥细胞周期蛋白(At CYCD2;1基因)作为研究对象,利用PCR技术从拟南芥花序c DNA扩增出At CYCD2;1基因,构建植物表达载体(pROKIIAt CYCD2;1)并利用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草。转基因植株的PCR检测结果表明,At CYCD2;1基因已经整合到了烟草基因组中。在T2代植株中,通过实时定量荧光PCR检测显示,At CYCD2;1在mRNA水平也均有表达。过量表达CYCD2;1的转基因烟草在花器官中存在明显表型,与野生型相比主要表现为转基因植株花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,上述结果表明At CYCD2;1基因影响花的发育。     

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达

将一个398bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin,LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子-α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪仅乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。     

根癌农杆菌介导的乙肝表面抗原基因对烟草的转化

构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于农杆菌的转化;通过冻融法将重组质粒pBRSAg转入根癌农杆菌LBA4404中,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,经筛选培养获得烟草植株。抗性植株经GUS染色和PCR检测为阳性,初步表明乙肝表面抗原基因在烟草中得到表达。     

嗜水气单胞菌HBNUAh01 外膜蛋白A 基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达

【目的】从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)HBNUAh01中克隆外膜蛋白A(outer membrane proteinA,ompA)基因并在烟草(Nicotiana tabacum)叶片细胞中瞬时表达该蛋白。【方法】以嗜水气单胞菌HBNUAh01为模板进行嗜水气单胞菌外膜蛋白A(AhompA)基因片段的PCR扩增,并将其克隆到pEASY-Blunt Simple载体中以进行测序。测序正确的AhompA基因序列与含有黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein,YFP)基因的表达载体pCAMBIA1300构建重组表达载体。将该重组表达载体转化到农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101感受态细胞中,随后用阳性转化子转染烟草叶片细胞。使用激光扫描共聚焦成像系统(Confocal Laser Scanning Microscope)检测观察融合表达AhompA基因的黄色荧光蛋白并采用RT-PCR检测AhompA基因在烟草叶片中的转录情况。【结果】从嗜水气单胞菌HBNUAh01中克隆出大小为1032 bp的AhompA基因序列,并在烟草叶片中成功表达AhompA和YFP的融合蛋白。【结论】AhompA基因在烟草叶片细胞中的成功表达为进一步研究利用植物疫苗防治嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病奠定了基础。