差速贴壁法体外分离培养小型猪脂肪间质干细胞的实验研究

目的探讨差速贴壁法对小型猪脂肪间质干细胞(ADSC)提取和纯化的可行性。方法从两成软骨10月龄的中国实验用I系小型猪皮下脂肪组织获取ADSC,培养4~6 h倒置显微镜下观察,见少量细胞贴壁,立刻将含有未贴壁细胞的培养基接种到新培养瓶内继续培养,传统培养法不换培养瓶,以后均每3 d换液1次。完全培养基传至第3代MTT法绘制生长曲线,并测定两种培养法获得的细胞不同代数的贴壁时间;诱导培养基向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞诱导并鉴定。贴壁时间、表面抗原阳性率、分化诱导染色阳性率实验数据比较采用单因素方差分析及t检验。结果采用差速贴壁培养法可分离培养出小型猪ADSC,并可除去部分贴壁的成纤维细胞、上皮细胞和脂滴,传代后培养瓶中脂滴明显减少;差速贴壁培养法获得的ADSC在贴壁时间方面较传统方法获得的ADSC短,前者传代后的贴壁时间(3.5±0.2)h较后者(5.8±0.3)h短,差异具有统计学意义(t=12.55,P=0.01);两种方法获得的ADSC中CD34阳性率:差速法为(1.17±0.01)﹪,传统法为(0.99±0.03)﹪;CD44阳性率:差速法为(88.90±0.03)﹪,传统法为(89.23±0.10)﹪;CD106阳性率:差速法为(1.18±0.05)﹪,传统法为(1.56±0.06)﹪;差异均统计学意义(t=0.12,1.23,0.37,P=0.06,0.07,0.06)。油红O、苏丹黑B、Von kossa、茜素红、阿尔新蓝、II型胶原染色结果表明差速贴壁法获得的ADSC可分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞,且阳性染色率分别为(78±2)﹪、(82±6)﹪、(85±1)﹪、(83±3)﹪、(76±9)﹪、(74±1)﹪,较传统法的(68±1)﹪、(69±2)﹪、(73±0)﹪、(75±1)﹪、(69±3)﹪、(65±4)﹪高,差异具有统计学意义(t=5.21,12.56,16.27,10.33,17.01,23.97;P=0.02,0.03,0.01,0.01,0.00,0.00)。结论采用差速贴壁培养法可从小型猪皮下脂肪组织可以分离培养出ADSC,从细胞形态学、生物学特性及多向分化能力等方面都较传统法获得的ADSC具有优势。     

基质交联分子1表达下调对人胰腺癌SW1990细胞周期及细胞凋亡的影响

目的探讨基质交联分子1(STIM1)表达下调对人胰腺癌细胞株SW1990细胞周期和细胞凋亡的影响,并研究其分子作用机制。方法构建携带STIM1基因si RNA的慢病毒载体转染SW1990细胞,分为对照组、空载体组和STIM1组。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot验证STIM1组SW1990细胞STIM1表达下调。通过MTT增殖实验和流式细胞术检测STIM1表达下调对细胞增殖、周期和细胞凋亡的影响,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞周期和细胞凋亡相关分子表达的变化。两组间比较采用t检验。结果STIM1组SW1990细胞中STIM1表达mRNA(0.261±0.029)、蛋白(0.120±0.032)低于空载体组mRNA(1.002±0.091)、蛋白(0.996±0.053),t=20.74、26.89,P均0.01。SW1990细胞24、48、72 h的增殖水平STIM1组分别为(0.122±0.008)、(0.252±0.031)、(0.373±0.028),相比空载体组(0.223±0.035)、(0.618±0.017)、(0.924±0.140),t=6.48、16.90、23.99,P0.01,受到抑制。STIM1组中SW1990细胞G2/M期细胞比例(41.47±0.66)﹪高于空载体组(10.30±2.24)﹪,t=23.14,P0.01。STIM1组中SW1990细胞凋亡率(25.21±1.96)﹪高于空载体组(3.71±1.23)﹪,t=16.03,P0.01。半定量RT-PCR和Western blot提示,STIM1组细胞周期蛋白B1(cyclin B1)表达mRNA(0.344±0.031)、蛋白(0.776±0.042)相比空载体组mRNA(1.011±0.060)、蛋白(1.034±0.036),t=40.06、8.51,P均0.01下调;STIM1组p21表达mRNA(1.970±0.107)、蛋白(1.315±0.093)相比空载体组mRNA(1.025±0.044)、蛋白(0.998±0.036),t=17.10、9.52,P均0.01上调;STIM1组Bcl-2表达mRNA(0.156±0.025)、蛋白(0.381±0.028)相比空载体组mRNA(1.010±0.072)、蛋白(0.980±0.057),t=15.46、14.63,P均0.01下调;STIM1组survivin表达mRNA(0.188±0.022)、蛋白(0.022±0.019)相比空载体组mRNA(1.016±0.090)、蛋白(0.994±0.047)t=58.08、442.58,P均0.01下调;STMI1组procaspase-3表达蛋白(0.389±0.030)相比空载体组蛋白(1.008±0.040)下调,差异有统计学意义(t=19.22,P0.01)。结论在胰腺癌SW1990细胞中,沉默STM1可阻滞细胞于G2/M期,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,有望成为胰腺癌治疗的分子靶点。     

聚赖氨酸修饰丝素蛋白膜对神经干细胞生长和分化的影响

利用聚赖氨酸修饰丝素蛋白膜,观察其对神经干细胞(NSCs)生长及分化的影响,为中枢神经系统损伤修复材料的选择提供实验基础和理论依据。文中首先制备聚赖氨酸修饰的丝素蛋白膜,并通过核磁共振图谱和紫外-可见光谱进行验证。NSCs分别接种在单纯丝蛋白膜(Silk)、聚赖氨酸修饰的丝蛋白膜(Silk-PIL)和多聚赖氨酸(PLL)上进行培养,分别在1、3、5、7 d时用CCK-8检测NSCs增殖活性。在第7天时,用免疫荧光染色检测NSCs分化情况,Western blotting和TUNEL检测细胞凋亡水平,Real-time PCR检测脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA水平。结果表明,核磁共振图谱和紫外-可见光谱证明聚赖氨酸成功地接枝到了丝素蛋白膜上,CCK-8检测显示:从第3天开始一直到第7天,NSCs在Silk-PIL上的增殖活性要显著高于Silk组(P0.05),而与PLL组无显著性差异(P0.05)。免疫荧光观察显示,NSCs在Silk-PIL上分化成神经元的细胞显著多于Silk组(P0.05),而与PLL组无显著性差异,3个组之间分化为星型胶质细胞的数量并无显著性差异。Western blotting和TUNEL检测结果表明Silk-PIL组NSCs凋亡程度显著小于Silk组(P0.05),但与PLL组无显著性差异(P0.05)。RT-PCR结果显示,NSCs在Silk-PIL和PLL组的BDNFmRNA表达水平显著高于Silk组(P0.05)。结果表明,聚赖氨酸修饰的丝素蛋白膜能够促进NSCs的增殖活性并减少NSCs细胞凋亡,同时促进NSCs向神经元方向分化,有望成为新型组织工程支架材料搭载NSCs移植修复中枢神经系统损伤。     

类人胶原蛋白-丝素蛋白血管支架的制备及性能表征

为了提高血管支架的力学性能,将生物相容性良好的新型生物材料类人胶原蛋白(基因工程技术、高密度发酵生产)与丝素蛋白以质量比9:1、7:3、5:5复合,采用真空冷冻方法制备管状血管支架。研究了不同配比血管支架材料的表面结构、表面元素组成、力学性能、降解和生物相容性。结果表明:当类人胶原蛋白与丝素蛋白的质量比为7:3混合时,类人胶原蛋白-丝素蛋白管状支架具有均匀的多孔结构,孔径为(60±5)μm,孔隙率达到85%以上;获得了较理想的力学性能:应变为50%±5%,应力为(332±16)kPa;具有相对慢的降解速率;提高了细胞的黏附与增殖,具有良好的生物相容性。     

骨髓基质细胞与交联明胶-聚羟基丁酸酯膜的生物相容性研究

目的研究生物材料交联明胶-聚羟基丁酸酯膜与骨髓基质细胞的生物相容性,探讨新型材料在骨组织工程中的应用前景。方法体外培养兔骨髓基质细胞,分别接种于G-PHB(交联明胶-聚羟基丁酸酯)、PHB(聚羟基丁酸酯)和G(交联明胶)材料膜片。采用MTT法检测细胞增殖活性,体视学方法检测细胞粘附能力,荧光双染法检测细胞完整性,扫描电镜观察细胞-材料界面。结果MTT检测发现G-PHB组增殖活性最强,而且表现为最佳的细胞粘附特性,与对照组比较差异有显著性意义。各组细胞完整性分析没有发现显著性差异。扫描电镜观察显示,G-PHB组细胞粘附及铺展良好,优于其他各组。结论交联后的生物降解膜材料G-PHB与BMSCs细胞的体外相容性明显优于单纯膜材料PHB和明胶,在骨组织工程学领域具有良好的研究价值和应用潜力。     

抑制营养缺乏自噬因子1表达对肝癌LM3细胞增殖的影响

目的探讨以透明质酸-聚乙烯亚胺/透明质酸-聚乙二醇(HA-PEI/HA-PEG)作为基因载体传递NAF1-siRNA对人肝细胞LM3进行增殖能力抑制的效果。方法将纳米复合物HA-PEI/HA-PEG与NAF1-siRNA复合,转染LM3细胞建立HNS组,等量NAF1-siRNA转染建立NSI组,另设未转染对照对照组,等量HA-PEI/HA-PEG干预细胞建立HAH组。采用荧光实时定量PCR检测细胞NAF1 mRNA的表达水平,采用Western blotting法检测NAF1、cyclin D1蛋白表达。采用MTT实验和平板克隆形成实验检测细胞增殖抑制效果。4组比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。结果以对照组NAF1 mRNA的相对表达量为100﹪进行检测。HNS组NAF1 mRNA的相对表达量为(2.12±0.17)﹪,与对照组相比,差异具有统计学意义(t=14.17,P=0.04)。HNS组LM3细胞的NAF1蛋白和Cyclin D1蛋白的相对表达量分别为0.07±0.01、0.06±0.00,而对应蛋白在对照组LM3细胞中的相对表达量分别为0.37±0.08、0.16±0.03,差异具有统计学意义(t=37.72,20.96,P=0.01,0.03)。HNS组细胞测得的细胞增殖抑制率为(73.20±0.43)﹪,与对照组的(0.49±0.02)﹪相比差异具有统计学意义(t=11.92,P=0.01)。HNS组LM3细胞的平板克隆形成率(8.35±0.33)﹪明显低于对照组的(23.61±0.10)﹪(t=17.75,P=0.00,0.02)。结论纳米复合物HA-PEI/HA-PEG可高效递送NAF1-si RNA,对肝癌LM3细胞进行转染,抑制NAF1表达,进而通过降低Cyclin D1表达水平抑制肝癌细胞LM3的增殖。     

丝素微球的制备方法研究进展

丝素蛋白因其特殊的物理化学性质,为制备不同形态的材料提供了依据;丝素蛋白也因其良好的生物相容性、生物降解性为生物材料应用提供了重要的临床选择。本文综述了国内外学者对丝素微球的制备方法的探究,包括乳化法、喷雾干燥法、层流射流技术以及自组装方法,并比较了各种制备方法的优缺点。此外,本文还介绍了丝素微球在药物缓释领域中的应用进展,并提出了几个针对制备丝素微球亟需解决的问题。     

壳聚糖基角膜细胞载体的制备及其细胞相容性

为探讨羟丙基壳聚糖基共混膜作为组织工程技术中角膜细胞培养载体的可行性, 分别制备了羟丙基壳聚糖/硫酸软骨素、羟丙基壳聚糖/明胶/硫酸软骨素以及羟丙基壳聚糖/氧化透明质酸/硫酸软骨素三种共混膜。测定其透光率、含水量和蛋白吸附性能; 在共混膜上培养兔角膜上皮细胞, 通过观察角膜上皮细胞在不同载体膜上的生长状态、贴附情况, 测定细胞活性以及上清液中乳酸脱氢酶的活性, 研究三种壳聚糖基载体膜片与角膜上皮细胞的相容性。膜片理化性质测定结果表明三种共混膜片具有良好的透明度, 适宜的含水量和较强的蛋白吸附性能; 细胞相容性实验结果表明羟丙基壳聚糖/明胶/硫酸软骨素共混膜对细胞的损伤最小, 有利于细胞在膜上的贴附和生长, 表现出良好的细胞相容性, 有望作为角膜细胞载体体外构建组织工程化角膜。     

重组人MG53蛋白对人脐带间充质干细胞氧化损伤的保护作用

目的建立人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)的H_2O_2氧化损伤模型,探讨重组人MG53蛋白(rh MG53)对h UC-MSCs氧化损伤的保护作用。方法使用组织块培养法从健康人脐带沃顿胶组织中分离培养h UC-MSCs,流式细胞仪检测细胞表型;CCK-8法检测h UC-MSCs的增殖和H_2O_2损伤程度。实验分为正常对照组(NC组)、rh MG53组、H_2O_2组和H_2O_2+rh MG53组。分别采用CCK-8法、Transwell小室、流式细胞术和β-半乳糖苷酶染色检测rh MG53蛋白对h UC-MSCs增殖、迁移、周期凋亡和衰老的影响。各组、各个时间点的吸光值采用析因设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析。结果 h UC-MSCs贴壁呈梭型生长,高表达间充质干细胞标志CD44、CD133、HLA-ABC,低表达CD34、CD45;H_2O_2对h UC-MSCs具有浓度和时间依赖性的损伤作用,确定200μmol/L的H_2O_2处理16 h为h UC-MSCs氧化损伤的最适条件。与NC组相比,H_2O_2组细胞增殖(0.994±0.011 vs 1.331±0.014)、迁移率(8.15﹪±2.47﹪vs 33.34﹪±3.62﹪)和S期细胞比例(29.67﹪±3.69﹪vs 34.33﹪±4.25﹪)显著降低,细胞衰老(44.07﹪±5.26﹪vs 5.7﹪±1.42﹪)和凋亡比例(52.63﹪±5.76﹪vs 4.65﹪±1.23﹪)显著增加,差异具有统计学意义(均P0.05);rh MG53组细胞增殖(1.509±0.086 vs 1.331±0.014)和迁移率(52.13﹪±5.46﹪vs 33.34﹪±3.62﹪)显著提高,S期比例(35.27﹪±4.79﹪vs 34.33﹪±4.25﹪)变化差异无统计学意义(P0.05),细胞衰老(3.92﹪±1.31﹪vs 5.7﹪±1.42﹪)和凋亡比例(3.96﹪±1.06﹪vs 4.65﹪±1.23﹪)显著降低,差异具有统计学意义(均P0.05)。与H_2O_2组相比,H_2O_2+rhMG53组细胞增殖(1.252±0.056 vs 0.994±0.011)、迁移率(18.93﹪±3.12﹪vs8.15﹪±2.47﹪)和S期比例(34.84﹪±3.45﹪vs 29.67﹪±3.69﹪)显著提高,细胞衰老(17.89﹪±2.64﹪vs 44.07﹪±5.26﹪)和凋亡比例(4.65﹪±1.23﹪vs 17.63﹪±2.56﹪)显著降低,差异具有统计学意义(均P0.05)。结论 rhMG53对H_2O_2造成的h UC-MSCs氧化损伤有保护作用。     

蛙凝素修饰聚谷氨酸纳米粒的制备、表征及Calu-3细胞摄取研究

目的:考察蛙凝素(Odorranalectin,OL)修饰对聚谷氨酸苄酯-聚乙二醇纳米粒(PBLG-PEG-NPs)材料的Calu-3细胞(人肺腺癌细胞)毒性和细胞摄取作用的影响。方法:碘氧化法制备蛙凝素修饰聚合物材料;以姜黄素(curcumin,Cur)为模型药物,采用乳化溶媒蒸发法制备聚谷氨酸苄酯-聚乙二醇纳米粒(PBLG-PEG-NPs)和蛙凝素修饰聚谷氨酸苄酯-聚乙二醇纳米粒(OL-PBLG-PEG-NPs);MTT法考察三种纳米粒对Calu-3的细胞毒性;采用激光共聚焦显微镜对两种纳米粒的Calu-3细胞摄取作用进行定性观察。结果:给予高浓度(2 mg·mL-1)纳米粒培养Calu-3细胞时,细胞存活率大于75%。蛙凝素修饰纳米粒后其被细胞摄取的量从62.7%增加到了81.2%。结论:OL可用于黏膜给药载体的修饰,OL-PBLG-PEG-NPs细胞毒性低、生物相容性好,有望成为一种鼻腔粘膜给药优良载体。     

一种可止血的富血小板血浆壳聚糖/丝素蛋白多孔伤口敷料的制备及性能表征

为了进一步提高伤口敷料的止血性能,文中在生物相容性良好的壳聚糖溶液中引入含有多种生长因子的人源性富血小板血浆(Humanplatelet-richplasma,hPRP),并加入不同体积比例(1∶1、1∶3、3∶1、1∶0)的丝素蛋白溶液以提高材料的多孔性与止血性,通过冷冻干燥法制备不同配比的hPRP-壳聚糖/丝素蛋白敷料,并将纯壳聚糖敷料作为对照组,研究hPRP和丝素蛋白对敷料的止血性能的影响以及丝素蛋白对PRP中生长因子控制释放的影响。结果表明,在壳聚糖敷料中引入hPRP对敷料的止血性有所提高,但对敷料的多孔结构及吸水率无明显改善,若在hPRP-壳聚糖溶液中按照体积比为1∶1的比例加入丝素蛋白溶液,会得到具有较为均匀的多孔结构的敷料,敷料的孔隙率与吸水率分别可达到86.83%±3.84%与1 474%±114%,且该比例的敷料在快速止血性能上表现优异。此外,加入丝素蛋白与壳聚糖比例为1∶1的PRP敷料能有效减少PRP中生长因子在初始阶段的爆裂释放。因此,含hPRP的壳聚糖/丝素蛋白复合敷料有望成为一种能快速止血且能促进伤口愈合的新型伤口敷料。     

染料木素抑制人胰腺癌细胞株PANC-1细胞增殖机制的研究

目的探讨不同浓度染料木素对胰腺癌细胞作用及其抑癌基因表达的研究。方法本实验共分实验组(80,120,160,200μmol/L)的染料木素、空白对照组(PBS)和标准对照(吉西他滨)。各组培养基处理细胞12,24,36,48,60 h后,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测人胰腺癌细胞株PANC-1在染料木素作用下的增殖活性;流式细胞术检测人胰腺癌细胞株PANC-1在染料木素木素作用下的凋亡细胞百分率;用逆转录-聚合酶连反应(RTPCR)方法测定P53及P21抑癌基因的表达;Western-blot法检测抑癌基因P53和P21的蛋白表达水平。细胞凋亡与细胞基因mRNA采用的是LSD法,细胞增殖数据采用的是配对t检验。结果流式细胞术显示,人胰腺癌细胞株PANC-1处理后60 h时在不同浓度(80,120,160,200μmol/L)的染料木素作用下细胞凋亡率分别为(3.72±1.58)﹪、(35.98±3.76)﹪、(51.36±4.32)﹪和(64.10±2.09)﹪。吉西他滨(gemcitabine,GEM)组为(43.45±5.28)﹪,不同浓度染料木素组与标准对照组间比较差异有统计学意义(均P<0.01);细胞增殖效果:160μmol/L与200μmol/L、120μmol/L与200μmol/L、200μmol/L与吉西他滨组之间比较,均有统计学意义(P<0.01),而160μmol/L与吉西他滨组比较无统计学意义(P>0.05);Western-blot检测蛋白水平显示160μmol/L和200μmol/L染料木素相对于空白对照能够明显的增强抑癌基因P21和P53的蛋白水平的表达,相对于标准组没有明显的差异。结论染料木素可以抑制人胰腺癌细胞株PANC-1增殖,并且初步探索了这种抑制作用表现出浓度及时间依赖性。     

PGDE交联纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料

由纳米羟基磷灰石(HA)与丝素蛋白(SF)复合而成的新型生物复合材料,具有优良的生物相容性,已被研究用作骨移植及填充材料,但其由丝素蛋白分子内交联导致的较差的力学性能,限制了该复合材料的应用。本研究中,采用一种名为聚乙二醇二缩水甘油醚(PGDE)的交联剂对复合材料中的丝素蛋白进行改性。该改性的复合材料经过一系列的检测,结果显示交联剂PGDE可以提高丝素蛋白的结晶性,复合材料HA/SF的抗压强度提高了100%,且该交联剂并没有影响复合材料的生物相容性。     

纳米丝素蛋白微球的制备及性能研究

以家蚕丝素蛋白为原料,基于丝素自组装理论,通过酶解-干燥-溶解法制备不同尺寸的丝素蛋白微球,制备出的微球具有良好的水不溶性和稳定的分散性。对微球的形貌和结构表征结果表明,用该方法制备的丝素蛋白微球为纳米微球,当酶的添加量为2%且蛋白自组装时间为4 h时,丝素蛋白微球的平均粒径最小,仅为(32±11)nm。红外光谱(FT-IR)和X射线衍射(XRD)结果显示,微球中β-折叠结构的多少决定了微球晶体的大小,β-折叠越多,微球中晶体的体积越大。通过调控丝素蛋白自组装过程,可以制备平均粒径在30～140 nm之间的纳米丝素蛋白微球,且不引入任何有机溶剂和无机溶剂,制备过程绿色环保,制备出的丝素蛋白微球安全无毒。     

竹红菌甲素引起红细胞膜蛋白的光敏交联

为了探讨竹红菌甲素对红细胞膜蛋白的光敏交联机理,我们使用了一些专一性及非专一性的基团修饰剂来修饰膜蛋白,试图说明膜蛋白的光敏交联究竟是由膜蛋白的巯基光氧化所引起的,还是膜蛋白的氨基酸与其侧链氨基之间的交联所引起的。我们分别采用N-乙基顺丁烯二酰抱亚胺(NEM)修饰膜蛋白的巯基,用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)来修饰色氨酸残基,用乙氧甲酸酐(DEP)修饰组氨酸残基,及用琥珀酸酐(SA)修饰氨基。测定了红细胞膜修饰前后及有竹红菌甲素存在时,光照前后的膜蛋白巯基及膜氨基的变化,膜蛋白内源性荧光的变化,以及对膜蛋白形成交联的影响。结果表明:NEM、DEP和NBS修饰的膜, 在有甲素存在时,光照对巯基影响很小,而对SA修饰的膜有明显的光敏作用。甲素对膜蛋白氨基的影响小于巯基,仅降低含量20%。甲素光照能引起NEM和SA修饰的膜内源荧光下降。甲素对NEM处理的膜仍能引起交联,但SA处理过的膜能抗交联,说明氨基在膜蛋白光敏交联中起着重要的作用。     

阿加曲班对急性脑梗死大鼠脑组织细胞凋亡的影响

目的探讨阿加曲班对急性脑梗死大鼠脑组织细胞凋亡数量、caspase-3、Bcl-2和Bax表达的影响。方法建立SD大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型,将大鼠分为假手术组(Sham组,不插入MCAO拴线)、脑中动脉缺血模型组(MCAO组)和阿加曲班处理组(Argatroban组)。分别选取0、6和12 h共3个时间窗的样本进行检测,TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒检测大鼠脑部神经细胞凋亡,Western blot和ELISA法检测大鼠脑部caspase-3、Bax和Bcl-2水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果TUNEL法结果显示,与MCAO组比较,Sham组和Argatroban组在0、6、12 h的细胞凋亡指数均降低[0 h(14.91±4.11)﹪比(2.13±0.58)﹪、(4.22±1.01)﹪;6 h(24.75±3.88)﹪比(3.19±0.28)﹪、(12.14±1.90)﹪;12 h(48.22±2.69)﹪比(5.75±1.21)﹪、(28.45±7.84)﹪,P均<0.05]。ELISA结果显示:与Sham组比较,MCAO组0、6、12 h的大鼠脑组织细胞caspase-3、Bax表达均升高,而Bcl-2表达在6、12 h时升高(P均<0.05);与MCAO组比较,Argatroban组的脑组织细胞caspase-3、Bax表达均降低,而Bcl-2表达在6、12 h时升高[caspase-3表达:0 h(2.32±0.12)比(1.25±0.06)、6 h(5.91±0.60)比(3.26±0.22)、12 h(7.31±0.27)比(6.42±0.18)ng/ml;Bax表达:0 h(0.82±0.08)比(0.45±0.03)、6 h(1.00±0.05)比(0.66±0.04)、12 h(1.56±0.11)比(1.09±0.07)ng/ml;Bcl-2表达:6 h(1.07±0.08)比(1.56±0.05)ng/ml,12 h(0.67±0.08)比(1.45±0.06)ng/ml,P均<0.01]。Western blot结果显示,大鼠脑组织细胞caspase-3、Bax蛋白表达趋势与ELISA结果一致;而Bcl-2蛋白表达在Argatroban组高于Sham组和MCAO组,差异有统计学意义(P均<0.01)。结论阿加曲班可通过减少急性脑梗死诱导的大鼠脑组织细胞凋亡、抑制caspase-3和Bax表达,并上调Bcl-2水平而产生神经保护作用。     

卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞相互作用对VEGF和bFGF表达的影响

目的探讨卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞(HPMC)相互作用对血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响。方法用Millicell将卵巢癌细胞SKOV3与HPMC进行非接触性共培养,用RT-PCR检测细胞VEGF及bFGF mRNA表达,ELISA检测细胞条件培养液中VEGF及bFGF蛋白水平。结果共培养后,SK-OV3 VEGF及bFGF mRNA表达分别为3.62±0.23及3.41±0.25,条件培养液中VEGF及bFGF蛋白水平分别为(523.5±24.9)pg/ml及(156.4±17.3)pg/ml,与SKOV3单独培养时相比,差别均有显著性(P<0.01)。HPMC共培养后VEGF及bFGF mRNA表达分别为3.96±0.09及3.54±0.21,条件培养液中VEGF及bFGF蛋白水平分别为(1567.62±45.42)pg/ml及(682.9±33.7)pg/ml,均明显高于HPMC单独培养时的水平(P<0.01)。结论卵巢癌细胞与HPMC均可合成VEGF及bFGF;二者共培养时,相互刺激表达更高的VEGF及bFGF。     

慢病毒介导的c-Myc启动子结合蛋白1过表达对结肠癌HCT116细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

目的探讨慢病毒介导的c-Myc启动子结合蛋白1(MBP-1)过表达对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法将体外培养的HCT116细胞分为以下3组:空白对照组,细胞未做任何处理;空载感染组,空载体对照慢病毒(LV-GFP)感染HCT116细胞;MBP-1过表达慢病毒组(MBP-1组),MBP-1过表达的重组慢病毒(LV-MBP-1-GFP)感染HCT116细胞。RT-PCR检测各组细胞中MBP-1 mRNA的表达,CCK-8实验检测细胞的增殖能力,流式细胞仪检测细胞的周期变化,Western blot检测细胞中MBP-1、NF-κB p65、c-Myc、CyclinD1及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达。三组间比较采用单因素方差分析,方差齐性采用F检验,若方差齐则组间比较采用LSD检验,若方差不齐则组间比较采用Dunnett检验。结果与空载感染组比较,MBP-1组在MBP-1 mRNA(1.02±0.15比4.56±1.03)、蛋白表达水平(0.18±0.01比0.72±0.10)、S期百分比[(39.12±2.18)﹪比(45.64±3.21)﹪]、G2/M期的百分比[(14.81±1.02)﹪比(23.16±2.12)﹪]、细胞中Bax蛋白(0.55±0.10比0.76±0.11)、cleaved caspase-3蛋白(0.45±0.08比0.81±0.11)表达水平均升高,差异具有统计学意义(P均<0.001),而细胞48 h OD值(0.58±0.08比0.43±0.03)、72 h OD值(1.10±0.13比0.52±0.09)、细胞G0/G1期的百分比[(46.06±1.89)﹪比(31.36±2.02)﹪]、细胞中Bcl-2蛋白(0.52±0.10比0.23±0.02)、NF-κB p65蛋白(0.61±0.13比0.16±0.03)、c-Myc蛋白(0.79±0.15比0.43±0.05)、CyclinD1蛋白(0.62±0.09比0.32±0.01)的表达水平均降低,差异具有统计学意义(P均<0.001);空白对照组和空载感染组之间各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论MBP-1过表达可抑制HCT116细胞增殖及诱导细胞周期阻滞于S期,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路活化有关。     

碱性成纤维生长因子转染骨髓间充质干细胞移植对心肌病心力衰竭大鼠心功能的影响

目的探讨碱性成纤维生长因子(bFGF)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对心肌病心力衰竭大鼠心功能的影响。方法通过腹腔注射阿霉素建立心肌病心力衰竭SD大鼠模型,存活33只大鼠随机分成3组:模型组、BMSCs组和BMSCs+bFGF组,每组11只。另设正常对照组(n=8)。取体外培养的第三代SD大鼠BMSCs,质粒-bFGF转染BMSCs,BrdU标记后,分别将BMSCs(3×10~6个)、bFGF转染的BMSCs(3×10~6个)或等体积培养基通过尾静脉注射的方法进行移植。用生物信号采集系统检测大鼠心功能,大鼠心脏切片行免疫组化了解移植细胞在受体心脏的存活情况,实时荧光定量PCR和Western Blotting检测心室组织bFGF的表达水平。多组间比较采用单因素方差分析或精确概率法。结果 BMSCs移植4周后,正常对照组大鼠的心功能指标LVSP(121.13±12.28)mmHg,LVDEP(3.86±1.25)mmHg,LV+d P/dt(3671.25±172.50)mmHg/s和LV-d P/dt(3221.63±259.57)mmHg/s;模型组心功能指标LVSP(81.29±12.39)mmHg,LVDEP(16.43±4.12)mmHg,LV+d P/dt(2344.29±98.63)mmHg/s和LV-d P/dt(2244.29±103.10)mmHg/s;BMSCs组心功能指标LVSP(97.00±6.39)mmHg,LVDEP(12.00±2.73)mmHg,LV+d P/dt(2876.25±118.31)mmHg/s和LV-d P/dt(2726.25±303.23)mmHg/s;BMSCs+bFGF组心功能指标LVSP(109.38±12.78)mmHg,LVDEP(9.25±1.67)mmHg,LV+d P/dt(3037.50±161.22)mmHg/s和LV-d P/dt(3000.13±149.77)mmHg/s,移植组各指标均有改善,比较差异有统计学意义(F=17.29、36.61、111.11、26.54,P均0.01)。免疫组织化学检查示细胞移植组大鼠的心室组织切片上可见Brd U阳性细胞存在。模型组大鼠心室心肌组织bFGF mRNA表达水平高于正常对照组(1.28±0.06 vs 1.00±0.00,t=10.46,P0.01),BMSCs组高于模型组(1.37±0.05 vs 1.28±0.06,t=3.39,P0.01),而BMSCs+bFGF组高于BMSCs组(1.44±0.03 vs 1.37±0.05,t=2.86,P=0.01)。Western Blotting示,正常对照组大鼠心室组织bFGF蛋白表达最低,模型组高于正常对照组(1.31±0.09 vs 1.00±0.00,t=5.48,P=0.01),BMSCs组高于模型组(1.46±0.05 vs 1.31±0.09,t=2.68,P=0.03),而BMSCs+bFGF组高于BMSCs组(1.84±0.09 vs 1.46±0.05,t=6.79,P0.01)。结论转染bFGF基因的BMSCs移植可提高阿霉素所致心肌病心力衰竭大鼠心脏的bFGF水平,改善大鼠心功能,其效果优于单纯BMSCs移植。     

RNA干扰技术下调营养缺乏自噬因子1表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响

目的采用RNA干扰手段抑制营养缺乏自噬因子1(NAF1)在肝细胞癌MHCC-97H细胞中的表达,观察其对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。方法采用NAF1-si RNA和空白对照NC-si RNA转染肝细胞癌MHCC-97H细胞,设为NAF组和NC组,同时设立未转染空白对照组(Blank组)。荧光实时定量PCR法检测MHCC-97H细胞NAF1m RNA表达。Western blotting法检测MHCC-97H细胞NAF蛋白和基质金属蛋白酶9(MMP9)蛋白表达。细胞划痕实验检测MHCC-97H细胞迁移能力。Transwell实验检测MHCC-97H细胞侵袭能力。荧光素酶报告基因实验检测MHCC-97H细胞核因子κB(NF-κB)信号通路的相对活性。多组间数据的比较用单因素方差分析,两组之间数据的比较采用t检验。结果 NAF组MHCC-97H细胞NAF1-m RNA的相对表达量为(6.50±0.23)﹪,低于Blank组的(100.80±0.60)﹪,且差异具有统计学意义(t=14.17,P=0.02)。NAF组MHCC-97H细胞NAF1蛋白和MMP9蛋白的相对表达量分别为0.12±0.01、0.07±0.01,均低于Blank组的0.79±0.05、0.81±0.02,且差异均有统计学意义(t=5.21、7.45,P=0.00、0.02)。NAF组MHCC-97H细胞的迁移距离明显小于Blank组。NAF组穿膜细胞的数量为(11.28±1.56)个/视野,少于Blank组的(197.87±3.18)个/视野,且差异有统计学意义(t=7.97,P=0.00),NAF组NF-κB信号通路的相对活性值3.25±0.53明显低于Blank组的26.69±7.41,差异具有统计学意义(t=13.33,P=0.01)。结论采用RNA干扰手段抑制NAF1的表达可能成为抑制肝细胞癌侵袭转移的有效手段。