脱硫创新霉素对E.coli BT色氨酸途径酶合成的阻遏作用

<正> 将E.coli BT(Trp~-)从阻遏条件转入去阻遏条件培养时,加入脱硫创新霉素,测定药物对色氨酸途径酶(ASase和TSase)合成的阻遏作用。实验结果证明:脱硫创新霉素的抗菌作用机制和创新霉素一样是阻遏色氨酸途径酶的生物合成。其50%的阻遏浓度为4—5μm,和创新霉素相似。实验结果也说明,创新霉素结构中的噻喃环对阻遏作用不是必要的,     

脱硫创新霉素对邻氨基苯甲酸合成酶活性的影响

<正> 用两种实验方法观察了脱硫创新霉素对ASase活性的影响。1.药物对E.coli BT36(Trp~- phe~- tyr~-)积累邻氨基苯甲酸的影响。发现脱硫创新霉素虽然部分抑制邻氨基苯甲酸的积累,却不出现分支酸的积累,而色氨酸在抑制邻氨基苯甲酸积累的同时出现分支酸积累。2.药物对ASase的作用。发现税硫创新霉素和创新霉素均不能抑制ASase活性,而色氨酸能显著抑制ASase活性,从而证明了脱硫创新霉素和创新霉素的抗菌作用不是通过反馈抑制色氨酸途径第一酶ASase的活性而实现的。     

E.coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E.coli中的分泌…

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片中克隆出碱性磷酸酯酶的启动子和信号肽序列,在ＰｈｏＡ启动子５端设计了ＥｃｏＲⅠ酶位点,在信号肽编码序列３端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点,将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ倍点,组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－,之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体,使之有Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分     

E.coli ZB43生成Microcin B17的发酵研究

Microcin B17(简称MccB17)是核糖体合成的肽类DNA螺旋酶抑制剂,其独特的分子结构是抗菌剂未来发展的重要的新颖结构,MccB17产生菌的杂环形成机理对于制药工业的药物设计具有重要意义。MccB17产生菌E.coliZB43适宜在M63合成培养基中积累胞内MccB17,低溶氧水平利于MccB17的积累。当葡萄糖浓度超过1g/L时,MccB17的合成受到阻遏。采用均匀设计表U11(1110)进行发酵培养基配比调整,确定了最佳的含葡萄糖合成培养基配比:葡萄糖1g/L,KH2PO43g/L,K2HPO47g/L,(NH4)2SO41g/L,MgSO4.7H2O 1.8mmol/L,盐酸硫胺1.8μg/ml。丁二酸钠能解除葡萄糖对E.coliZB43生成MccB17的代谢阻遏。以10g/L丁二酸钠替代葡萄糖为唯一碳源,在上述最佳发酵培养基配比条件下,37℃24h,MccB17的产量可达559.6μg/ml。     

E.coli外切核酸酶Ⅲ的提取和纯化

E.coli外切核酸酶Ⅲ(EXOⅢ)有四种功能。第一,从双链DNA 3’端向5’端逐个水解磷酸二酯键,释放出5’-单核苷酸,因此是3’→5’的外切核酸酶。第二,水解DNA的3’末端磷酸单酯键,释放出无机磷酸。第三,它可以在DNA无嘌呤区段上水解磷酸二酯键,因而又是无嘌呤或无嘧啶内切核酸酶。最后,对     

天冬氨酸酶E.coli融合表达研究

以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。     

E.coli Rho因子的结构与功能

Ｅ．ｃｏｌｉＲｈｏ因子的结构与功能赖兵张海（北京大学生命科学学院生物化学与分子生物学系,北京１００８７１）关键词Ｒｈｏ因子ＡＴＰａｓｅ转录过程中起决定作用的序列,蛋白质因子及它们之间的相互作用,一直是生物化学家和分子生物学家关注的焦点之一。由于真核生...     

E.coli tRNA~(Leu)的提纯

本文报道一种E.coli tRNA~(Leu)简便而稳定的纯化方法。粗tRNA经过BD-Cellulose柱层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳两个步骤即可得到亮氨酸接受能力为1400pmol/A_(260)单位的tRNA~(Leu)。     

产肠毒素原性E.coli菌苗的研究进展

<正> 产肠毒素原性大肠杆菌(ETEC)是当前世界上的一个重要病原,虽然确切的调查资料尚难以得到,但据近来的研究估计,全世界每年大约有4亿腹泻病例,五岁以下儿童因之死亡的有70万。ETEC也是旅游者腹泻的一个重要病因。由于人们对这种病原的认识相当晚,因而近十年来才注意其菌苗的研制。 关于ETEC腹泻的致病机理常有评述,但简要说来,ETEC引起腹泻需要有两类毒力因子,即定居因子和肠毒素。病原体必须首先粘附到小肠的近测,这一过程是由称为定居因子抗原(CFA)的纤毛蛋白粘附素(adhesins)介导的。已经识别出许多这样的因子如CFA/I,CS1,CS2,CS3,CS4,CS5,CS6以及PCFO159:H4。早期的报     

抑制E.coli的SOS应答对恩诺沙星抗药性的影响

通过敲除SOS应答启动蛋白基因rec A,探讨SOS应答对E.coli恩诺沙星抗药性的影响,并体外评价Rec A抑制剂和恩诺沙星联用对细菌协同抑制作用的影响.利用Red重组系统,构建E.coli ATCC 25922的rec A缺失菌株E.coli ATCC 25922/?rec A;在恩诺沙星压力下,利用荧光定量PCR测定SOS应答系统相关基因rec A和umu C表达量的变化.用微量肉汤稀释法测定恩诺沙星等常用抗生素对两个菌株的MIC变化;利用梯度平板法测定恩诺沙星对两个菌株抗药性变异的影响;合成Rec A抑制剂,并评估其与恩诺沙星联合抑制E.coli生长及其抗药性的作用.结果表明,E.coli ATCC 25922/?rec A菌株对恩诺沙星的最低抑菌浓度值降低至原始菌株的1/8;经药物处理后,在梯度平板上,rec A缺失菌株较野生型不易产生抗药性;荧光定量PCR表明,rec A缺失菌株或在Rec A抑制剂作用下,SOS应答系统受到一定的抑制.敲除rec A,使菌株对恩诺沙星的抗药性和抗药率均明显降低;Rec A抑制剂在一定程度上能抑制SOS应答,起到协同抑菌作用.     

工程菌E.coli MM2的固定化细胞制备

固定化细胞技术是七十年代兴起的一门应用技术。固定化细胞具有细胞密度高、易进行连续生产且稀释率高、不易被污染、产物易分离、可降低设备规模等优点,已成为生物合成、生物转化的有效工具,得到广泛应用。近十年来,人们把固定化细胞技术应用到工程菌的培养中取得了一些有价值的结果。用工程菌制得的固定化细胞裂解青霉素生产6-APA,已达工业化生产水平。据文献报道,工程菌固定化后可大大提高重组质粒的稳定性,并且外源基因能稳定地表达。本所马清钧研究员等构建的工程菌     

Roasting coffee beans produces compounds that induce prophage λ in E. coli and are mutagenic in E. coli and S. typhimurium

Freshly brewed blended coffee, instant coffee and instant caffeine-free coffee induced prophage λ in lysogenic E. coli K12, strain GY5027. Because coffee prepared from green beans by the same extraction method as used for freshly brewed blended coffee had no prophage-inducing activity, this activity may be attributed to compounds produced in the roasting process. Roasting also produced compounds that were mutagenic in S. typhimurium TA100 and E. coli WP2 uvrA/pKM101.     

E.coli脱羧酶的一种简便制备方法

在谷氨酸生产中,常用E.coli脱羧酶测定其含量,大肠杆菌产生的谷氨酸脱羧酶是一种专一性较高的胞内酶,在一定的温度(37℃)和pH值(pH4.2)下,使谷氨酸的羧基脱掉放出二氧化碳。因     

E.coli DNA抗肿瘤免疫的动态实验研究

５５只Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,５只作为正常对照组,其余５０只荷瘤后随机分为１０组, ５组为 ＴＥＳ对照组, ５组为Ｅ． ｃｏｌｉＤＮＡ治疗组。荷瘤第４ｄ起,分别于治疗组和对照组小鼠皮下注射 ＤＮＡ（１００ｍｇ／Ｌ）或 ＴＥＳ（０． １ｍｏｌ／Ｌ）,０．３ｍｌ／只,隔日１次,共５次。于荷瘤第５,９,１３,１７,２１ｄ处置对照组和治疗组各一组小鼠,进行Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ抗肿瘤免疫的动态研究。结果表明, Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡ体内抑瘤作用出现早、强且持久,主要是通过诱导肿瘤组织坏死所致,它可迅速持久地激活免疫系统,防止出现免疫低下或紊乱;对照组小鼠荷瘤早期可出现暂时的免疫功能增强,随荷瘤时间延长,逐渐降低至较低水平,并出现免疫紊乱。     

调控因子SlyA和RfaH在E.coli K4合成果糖软骨素中的生理作用

利用基因工程手段过量表达E.coli K4荚膜多糖(K4CPS)合成途径中相关代谢调控因子Sly A和Rfa H,以构建高效合成K4CPS的菌株。结果发现:sly A和rfa H基因的单独过量表达和共表达重组菌的K4CPS的产量较对照菌分别提高了81.8%、46.5%和153.8%;甘油比消耗速率较对照菌降低了12.5%、18.8%和31.3%,而乙酸含量则较对照菌降低了98.6%、39.7%和91.6%。因此,调控蛋白Sly A和Rfa H的过量表达能够大幅度提高E.coli K4的K4CPS合成,并增强菌体对甘油的利用率,而乙酸合成明显降低。而与单独表达策略相比,共表达策略能够更加有效地增强菌体合成K4CPS的能力。     

Predicting the strength of UP-elements and full-length E. coli σE promoters

Predicting the location and strength of promoters from genomic sequence requires accurate sequenced-based promoter models. We present the first model of a full-length bacterial promoter, encompassing both upstream sequences (UP-elements) and core promoter modules, based on a set of 60 promoters dependent on σ(E), an alternative ECF-type σ factor. UP-element contribution, best described by the length and frequency of A- and T-tracts, in combination with a PWM-based core promoter model, accurately predicted promoter strength both in vivo and in vitro. This model also distinguished active from weak/inactive promoters. Systematic examination of promoter strength as a function of RNA polymerase (RNAP) concentration revealed that UP-element contribution varied with RNAP availability and that the σ(E) regulon is comprised of two promoter types, one of which is active only at high concentrations of RNAP. Distinct promoter types may be a general mechanism for increasing the regulatory capacity of the ECF group of alternative σ's. Our findings provide important insights into the sequence requirements for the strength and function of full-length promoters and establish guidelines for promoter prediction and for forward engineering promoters of specific strengths.     

限制性蛋白酶解提高E.coli Hfq蛋白晶体结构分辨率

Hfq蛋白是一种促进sRNA结合互补RNA的细菌伴侣蛋白.Hfq蛋白可以抑制或上调目的蛋白的表达及促进mRNA的降解,从而调控细菌的生理功能使其适应周围胁迫环境.Hfq是同源六聚体蛋白质,在其中心部位有1个内环,每个单体上有1个极其保守的组氨酸分布在这个内环表面.根据Hfq这个特点,应用镍离子亲和柱直接从大肠杆菌中纯化Hfq,接着用凝胶过滤层析柱纯化,最终获得了纯度70%的Hfq蛋白.对该蛋白质进行结晶条件初筛前,应用胰凝乳蛋白酶对其进行限制性蛋白酶解,切除其C端无规则卷曲,便于Hfq结晶及提高晶体衍射率.初期得到的Hfq晶体是极小的针状晶体,通过优化结晶条件获得了较大的晶体.最终解析出了2个分辨率较高的Hfq晶体结构,其中1个晶体结构分辨率达到了1.63.     

HCV C基因在E.coli中的高效表达

本文在基因克隆和序列分析基础上,设计并构建了五种不同的HCV C基因表达工程菌株,研究了影响HCVC基因在E.coli中高效表达的因素。结果表明疏水区编码序列的存在与否对基因表达水平影响较大;翻译通读现象可直接影响目的表达产物的累积水平;不同宿主细胞对外源基因表达水平的影响也同样具有重要意义。通过试验研究,获得了高表达工程菌株,其表达水平达38.5％,为制备高质量重组HCV C抗原并研究其在疾病防治中的作用奠定了基础。