大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素

探讨了大肠杆菌菌株、细菌生长状态、转化溶液、抗冻剂及保存时间、质粒长度和纯度对感受态细胞转化能力的影响。结果表明,以100 mmol/L CaCl2为缓冲液,采用经活化培养的A600为0.55的TG1制备的感受态细胞,在冰上放置6h后转化,所得转化率最高,可达2×106-4×107cfu/μg DNA(pUC19)。随着质粒长度增加和纯度降低,转化率有所下降。若感受态细胞要保存备用,以15％甘油为抗冻剂优于7％DMSO,但添加抗冻剂对转化率有抑制作用。贮于甘油的感受态细胞在-70℃冻存两个月后仍有较理想的转化率。     

制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究

旨在建立一种高效大肠杆菌电转化感受态细胞的制备方法,研究了摇瓶装液量,菌体生长阶段,转化电场强度,转化后复苏时间以及感受态细胞存放时间等对转化效率的影响.结果表明,基液量为400 mL/2L,菌体在OD600值为0.452时收集所制备的感受态细胞,在电场强度12.5 kV/cm条件下电击5 ms,转化后复苏时间2h,转化效率可达到1010CFU/μg DNA.此条件下制备的感受态细胞转化效率高,质量稳定,重复性好.     

保存时间及温度对大肠杆菌感受态转化效率的影响

通过不同保存时间和温度对大肠杆菌感受态转化效率影响的研究,更明确阐明了不同保存温度下感受态细胞随保存时间的延长其转化率的变化趋势,为以后的研究提供了量化的指标。     

大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨

本文对４种大肠杆菌菌株在不同生长时期的转化效率分别进行了测定．结果表明,在细菌的生长繁殖过程中,其转化效率是有很大变化的．对于不同的菌株,它们获得高转化率时的活菌数不同．同时,得到了这４种大肠杆菌菌株制备最佳感受态细胞的条件．     

少量制备大肠杆菌感受态细胞条件探索

目的:为了获得重复性好、转化率高的少量制备感受态细胞的方法,利用不同生长时期的大肠杆菌感受态细胞,进行转化比较。方法:根据普通实验室的实验条件,常规方法提取质粒,氯化钙法转化不同生长时期的大肠杆菌感受态细胞,比较转化率。结果:大肠杆菌感受态细胞的转化率与OD值显著相关,在OD600nm为0.39和0.55时转化率最高,在OD600nm为0.28~0.55之间均可得到理想的转化效果。结论:少量制备感受态细胞方法操作中无需添加任何保护试剂和细胞复苏培养,操作简便、重复性好,实验成本低廉。     

大肠杆菌感受态细胞培养与冻存条件的研究

测定大肠杆菌JM107在37℃培养条件下的生长曲线,制备其对数生长期不同阶段感受态冻存细胞,并对冻存细胞的转化率进行研究。结果显示：分离良好的单个新鲜菌落接种于50mlSOB培养基,经37℃,170～180r/min振荡培养210min左右,所得冻存细胞转化率最高,－7O℃保存时可达5．2×10⁷转化子／μgDNA且感受态保持时间长,即使存放两个月仍能保持相当高的转化率。－20℃保存时也能在三周内保持较高转化率。     

双歧杆菌感受态细胞的制备和电转化条件的研究

介绍目前常用的双歧杆菌感受态细胞制备方法,并系统研究影响双歧杆菌电转化效率的关键因素。通过研究,菌体在4oo为0.3-0. 5时收集以制备感受态细胞,制备好的感受态细胞应尽早用于电转化;最佳电场强度为12.5 kV/cm;转化后的细胞复苏培养2 h为佳。感受态细胞的转化效率可达103 CFU/μg DNA。     

感受态细胞制备与保存方法的比较研究

目的 :确立一个能制备高转化率感受态细胞并长期维持其感受性的实验方案。方法 :比较CaCl2 法、TSS法、超高效法制备感受态细胞的效果 ,选用三者中较好的方法进一步探讨不同生长期 (OD值 0 .2～ 1.1)的细菌对制备感受态细胞的影响 ,并分别比较了不同冷冻保护剂 (7%DMSO ,10 %甘油 )于 - 2 0℃、- 80℃冰箱保存感受态细胞的效果。结果 :三种方法获得的感受态细胞转化率差异极显著 (P <0 .0 1)。采用超高效法 ,OD值为 0 .36 (或 0 .5 8)时收集菌体可获得 1.1× 10 8的高转化率的感受态细胞 ,以 7%的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持 10 7以上的转化率 4 0d以上     

人Leptin基因在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV220-OB转化E.coliJM109,经热诱导获得了目的蛋白的表达。经SDS-PAGE鉴定分析,表达产物以包涵体形式存在,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上。通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/mg的高纯度的重组人Leptin。Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异性结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致。纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键。体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性。     

大肠杆菌DH5α菌株感受态制备及转化率变化研究

通过氯化钙法制备大肠杆菌DH5α菌株感受态,讨论了不同保存温度和保存时间对感受态转化率的影响。结果表明,在4℃下保存,8h达到最高转化率;在-20℃和-70℃下保存,均为48h达到最高转化率。通过氯化钙法制备的DH5α菌株感受态细胞,在-20℃条件下简单保存,20d内完全可以满足一般转化研究的要求,不需要复杂的甘油、液氮处理及超低温要求。     

基因工程菌大肠杆菌JM109富集废水中镍离子的研究

利用通过基因工程技术所构建的在细胞内同时表达出高特异性镍转运蛋白和金属硫蛋白的基因工程菌富集水体中的镍离子。菌体细胞对Ni²⁺的富集速率很快,富集过程满足Langmuir等温线模型。与原始宿主菌相比,经基因改造的基因工程菌不仅最大镍富集容量增加了5倍多,而且对pH值、离子强度的变化及其它共存重金属离子的影响都呈现出更强的适应性。相比而言,Na⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺的影响较小,但Mg²⁺、Hg²⁺和Cu²⁺所引起的负面效应较大。进一步的实验表明基因工程菌对Ni2+的富集行为不需要外加营养物质。     

一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA转化大肠杆菌的操作方法.采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞.以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth和植物双元表达栽体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1.质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后,直接涂布含有筛选抗生素的LB平板,于37℃培养12～16h.结果表明,用不同大小的质粒DNA转化不同的大肠杆菌菌株,都可以获得满足实验要求,转化效率可高达103～4阳性克隆/μg.该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用.     

arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性

【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以P.putida JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入E.coli JM109(DE3)中,验证该基因提高E.coli JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到E.coli JM109(DE3)基因组中。【结果】E.coli JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到E.coli JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受E.coli JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。     

Physiological effects of TGF(alpha)-PE40 expression in recombinant Escherichia coli JM109

Physiological effects of isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) induction were examined in Escherichia coli strain JM109 expressing a fusion protein composed of transforming growth factor alpha and a 40-kD portion of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (TGF(alpha)-PE40) under control of the tac promoter. Fermentations at the 15-L scale in complex medium compared growth and metabolite profiles of the untransformed JM109 host strain, the strain transformed with the vector lacking the TGF(alpha)-PE40 open reading frame (JM109[pKK2.7]), and the strain with the complete plasmid for TGF(alpha)-PE40 expression (JM109[pTAC-TGF57-PE40]). Metabolite and growth profiles of JM109 (pTAC-TGF57-PE40) cultures changed significantly in IPTG-induced versus uninduced cultures. Prior to induction, glucose was metabolized to acetate or completely oxidized to CO(2). Following induction, pyruvate was also excreted in addition to acetate. In the absence of inducer, pyruvate was excreted by JM109 (pTAC-TGF57-PE40) only when dissolved oxygen levels fell to less than 10% of saturation (microaerobic rather than anaerobic conditions). The untransformed JM109 host strain or JM109 (pKK2.7) did not excrete pyruvate in the presence or absence of inducer, although JM109 (pKK2.7) exhibited a pattern of growth following addition of IPTG that closely resembled JM109 (pTAC-TFG57-PE40). Fermentations of JM109 (pTAC-TFG57-PE40) in a synthetic medium supported lower expression levels, but resulted in similar alterations in metabolite profiles. Induction in synthetic medium resulted in pyruvate excretion without further acetate accumulation. Taken together, these data suggest that one consequence of TGF(alpha)-PE40 expression in JM109 is altered patterns of pyruvate oxidation. (c) 1992 John Wiley & Sons, Inc.