血浆激肽释放酶新底物PK—120的研究

血浆激肽释放酶新底物ＰＫ┐１２０的研究蒲小平（军事医学科学院基础医学研究所,北京１００８５０）关键词血浆激肽释放酶底物１．发现补体系统由２０余种血浆蛋白组成,在机体防御和炎症应答反应中起重要作用。１９８９年Ｈａｍｍｅｒ等在用Ｃ４ｂ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ...     

人组织激肽释放酶基因在哺乳动物细胞中的表达

克隆人胰腺组织激肽释放酶基因 (hKK) ,构建融合荧光蛋白基因的真核表达载体 ,在CHO细胞中表达 ,为开发激肽释放酶基因工程产品以及开展基因治疗高血压研究奠定了基础。提取人胰腺组织总RNA后 ,RT PCR扩增KK ,构建中间载体KSKK。从KSKK中切出激肽释放酶基因 ,插入真核表达载体pEGFP C2 ,构建出激肽释放酶带有荧光蛋白报告基因的表达载体pEGC KK ,测序分析后转染CHO细胞 ,荧光显微镜观察激肽释放酶基因表达。并进行SDS PAGE及Westernblot分析。成功克隆激肽释放酶基因 ,并在CHO细胞获得表达 ,克隆的人组织激肽释放酶基因可用于激肽释放酶基因工程产品开发以及基因治疗研究。     

组织型激肽释放酶及相关肽酶在中枢神经系统中的作用

组织型激肽释放酶1(kallikrein1,KLK1)和激肽释放酶相关肽酶(kallikrein-related peptidase 2～15,KLK2～15)是一类丝氨酸蛋白酶,具有广泛的生物学活性。在中枢神经系统中,它们不但在脑的生长、发育和学习记忆等方面起重要作用,同时也在多种脑部疾病中起重要作用,如帕金森病、痴呆、多发性硬化、肿瘤等,并在这些疾病的诊断、治疗和预后方面显示出潜在的应用价值。     

人体激肽释放酶2与前列腺癌

人体激肽释放酶2(human kallikrein 2,hK2)是一种主要在前列腺中表达的丝氨酸蛋白酶,近年作为前列腺癌的血清标记物受到广泛关注.随着对hK2结构特征、组织表达、生物学活性和调节,及其与前列腺癌病理过程的关系的研究更一步深入,hK2在前列腺癌诊断、病理分期及治疗中的潜在应用价值将越加瞩目.     

人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达

将编码人组织激肽释放酶成熟蛋白的基因片段扩增并分别克隆到原核表达载体pET2 8(b)及分泌型表达载体pET2 0 (b)中 ,使其C端融合 6×HisTag序列 .转化不同受体菌 ,IPTG诱导表达后利用SDS PAGE、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析 .在 6株基因工程菌株中 ,均表达出分子量约30kD的激肽释放酶融合蛋白 ,其中激肽释放酶在pET2 8载体中的表达水平高于pET2 0载体 .pET2 8和pET2 0载体表达的重组激肽释放酶蛋白分别占菌体总蛋白约 2 6 %和 10 % .Western印迹分析表明 ,目的蛋白可与抗人血清KK单克隆抗体发生特异性反应 .未经纯化的激肽释放酶融合蛋白具有一定的水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力 .在大肠杆菌中获得了人组织激肽释放酶的高效表达 ,表达产物具有免疫原性和生物活力 ,这为研究其生物功能和开发基因工程药物奠定基础     

人β-分泌酶 (BACE1) 在毕赤酵母中分泌表达及纯化

为了获得活性良好的重组人β-分泌酶 (β-secreatase, BACE1),用于研究其与抑制剂的作用模式,构建了携带β-分泌酶proBACE1和BACE1编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46,通过电击法转入毕赤酵母GS115中,分别得到重组子9k-B22和9k-B46。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达,结果显示9k-B22的上清活性明显高于9k-B46的上清活性。9k-B22表达上清浓缩后经HisTrap亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的BACE1活性, SDS-PAGE/高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白,并且其糖基侧链可以被Endo Hf完全切除,得到50 kDa左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现,这两个蛋白分别与proBACE1和BACE1匹配。活性检测发现糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK-293细胞表达的商品BACE1,这说明糖基化及其类型对BACE1的活性非常重要。然而已知的BACE1抑制剂对三者的抑制率无显著差异,这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化BACE1纯化产量提高到1 mg/L,这为发现并优化BACE1新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。     

人源性激肽释放酶结合蛋白与内皮细胞功能

人源性激肽释放酶结合蛋白（Kallistatin,Kal）是一种负性急性期内源性蛋白,与多种内皮相关性生理和病理过程密切相关,如血管生成及损伤修复、炎症、心功能不全、肾损伤、糖尿病等。炎症和氧化应激可引起内皮功能障碍,而Kal可抑制肿瘤坏死因子α引起的内皮细胞活化,通过KLF4-eNOS、PI3K-AKT-eNOS和AKT-FOXO1等信号通路,增加内皮细胞NO合酶的表达和NO生成,抑制内皮细胞损伤和凋亡。动物实验显示,Kal表达增加可减弱氧化应激诱导的细胞凋亡和器官损伤。基于内皮细胞所处的状态或来源,如健康或损伤情况,成熟内皮细胞或内皮祖细胞,Kal的作用可能有所区别。内皮细胞是参与肿瘤生长与转移的关键因素已达成共识,但肿瘤新生血管形成的机制尚待确认。Kal可诱导肿瘤内皮细胞凋亡,抑制肿瘤新生血管生成和肿瘤生长的能力已被证实。临床前研究结果表明,Kal具有多种药理作用,对氧化应激相关性疾病,特别是肿瘤治疗具有应用前景,但其药理作用的分子机制仍需深入探讨。     

TPO模拟肽与人IgG1Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

构建TPO模拟肽与人IgG1Fc融合蛋白的酵母表达体系。利用PCR技术,从重组质粒pET28a-TMPFc中,扩增TPO模拟肽与人IgG1Fc 的DNA片段,连入pPICZαA酵母表达载体,电激法转化毕赤酵母。用MDH和MMH筛选具有正确表型的重组转化子,PCR、蛋白质印迹鉴定融合基因。MTT法鉴定TMPFc对Ba/F3mpl细胞生长的促进作用。构建的重组毕赤酵母实现了TMPFc的分泌表达,表达量占外分泌蛋白质的65%。表达蛋白质的相对分子量约64kD,对Ba/F3mpl生长具有促进作用。TMPFc酵母表达体系表达出可观的二价模拟肽,为二价TMP活性的定量研究奠定基础。     

重组线虫抗凝肽在毕赤酵母中的表达

目的：获得具有抗凝活性的重组线虫抗凝肽（NAP）蛋白, 为新型抗凝药物的开发奠定基础。方法：将pPIC3.5K-rNAP质粒转化毕赤酵母菌株GS115,筛选出阳性菌株后,用甲醇诱导表达。收集酵母培养上清,用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,通过测定PT(血浆凝血酶原时间)、INR（血浆凝血酶原国际标准化比率）和APTT（活化部分凝血活酶时间）来验证其生物学活性。结果：获得了稳定表达NAP的重组酵母菌株。重组NAP被分泌表达,其分子量比预计分子量（8.7KD）稍大,约为10KD左右,可能与糖基化有关。体外活性检测证实其有较强的抗凝活性。结论：在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的重组线虫抗凝肽,可用于新型抗凝药物的开发。     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

人源性抗bFGF单链抗体表达载体的构建与酵母表达

为了提高人源性抗bFGF抗体的表达量,从噬菌体抗体库筛选出的人源性抗bFGF抗体基因中亚克隆单链抗体(single chain fragment variable,ScFv)基因,并将其构建到酵母表达载体pPICZαA中。表达载体质粒经线性化后,电转化法转化至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析和阴离子交换层析纯化,并检测其生物学活性。酶切鉴定结果显示人源性的酵母表达载体构建成功。SDS-PAGE和Western blot结果显示,抗bFGF单链抗体获得了高效表达,表达量可达124mg/L,目的蛋白大小为36 kDa左右。通过两步纯化方案,目的蛋白的纯度可达95%以上。ELISA结果显示纯化的目的蛋白可与bFGF特异性结合。CCK8检测结果显示,纯化的抗bFGF单链抗体可剂量依赖性地抑制人肺腺癌细胞株A549的增殖。研究结果表明在毕赤酵母中可获得人源性抗bFGF单链抗体高效表达,表达产物具有很好的生物学活性。     

毕赤酵母表达重组人白细胞介素11的纯化与鉴定

报道了毕赤酵母表达人白细胞介素11的下游工艺研究,并对其产物进行了分析鉴定。所用工艺流程为离心收集上清、超滤浓缩脱盐、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤。所得产物经SDSPAGE电泳、RPHPLC分析、N端和C端序列分析、质谱、等电点分析和生物学活性分析,结果表明：产品纯度大于97%,结构和性质与E.coli融合表达的Neumega完全一致。     

重组人血清白蛋白在Pichia pastoris中的表达与纯化

为实现重组人血清白蛋白（ｒＨＳＡ）的开发,对构建的酵母工程菌Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５／ＨＳＡ进行了表达条件的优化,摇瓶中将表达ｒＨＳＡ的量提高到１５０ｍｇ／Ｌ。经中空纤维柱浓缩、Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分离和抗ＨＳＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析纯化获得电泳纯的重组人血清白蛋白。     

人内皮细胞抑制生长素在毕赤酵母中的高效表达

根据人胶原蛋白ⅩⅧNC结构域C末端编码内皮细胞抑制生长素 (Endostatin)的成熟多肽序列 ,人工合成了由毕赤酵母 (Pichiapastoris)中偏爱密码子组成的内皮细胞抑制生长素基因序列。该基因以N端融合的方式正确插入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA中。通过电激将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母SMD1 1 68细胞中 ,筛选获得表达具有生物活性的内皮细胞生长抑制素的高产菌株。在摇瓶发酵水平上 ,产量达到 80mg L。而利用生物反应器进行高密度发酵 ,Endostatin的产量可达 1 2 5mg L。纯化后的Endostatin具有抑制小鼠血管内皮细胞增殖的活性     

人血管内皮抑制素在毕赤酵母中的表达纯化及活性测定

血管内皮抑制素是胶原ⅩⅧ C-末端的一个片段,是一个有效的血管生成抑制因子。本文克隆了人血管内皮抑制素的基因,并用毕赤酵母进行表达,表达量为50.5 mg/L。发酵液上清经SP Sepharose Fast Flow凝胶一步层析,产物纯度达到98%以上,纯化收率达到95%以上。毕赤酵母分泌表达的人血管内皮抑制素具有免疫活性;能明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生长;并且能特异性地抑制bFGF刺激的人微血管内皮细的迁移,达到抑制效果为50%时所需的蛋白浓度（IC50）为0.4μg/ml。本研究为应用人血管内皮抑制素治疗肿瘤奠定了初步实验基础。     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

重组小鼠血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和纯化

目的：建立毕赤酵母重组小鼠血管内皮生长因子（mVEGF）的制备方法,为研究mVEGF的生物活性、抗原性等提供基础。方法：通过全基因合成方法获得编码mVEGF的基因片段,将其克隆至表达载体pPICZaA上,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,用甲醇诱导表达目的蛋白,表达上清经硫酸铵沉淀、SephadexG25柱脱盐、阳离子交换层析三步纯化获得目的蛋白;用还原型和非还原型SDS-PAGE检测目的蛋白的聚体状态,用Westelqq印迹验证纯化蛋白;通过PNGaseF酶切分析目的蛋白的N-糖基化修饰;通过人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖实验检测目的蛋白的生物活性。结果：获得mVEGF的重组毕赤酵母表达菌株,SDS-PAGE分析可见GSll5表达的重组mVEGF在还原状态下表观相对分子质量约为20×10^3,在非还原状态下约为40×10^3;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,能被兔抗mVEGF抗体特异性结合,PNGase F酶切后相对分子质量降至18×10^3左右,证明目的蛋白发生了Ⅳ-糖基化修饰;细胞测活实验表明,mVEGF具有刺激HUVEC增殖的生物活性。结论：利用毕赤酵母菌制备了具有生物活性的重组mVEGF。     

ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定

为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K ,获得融合基因表达质粒pZWY ATF PAI2CD .该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,然后用甲醇诱导表达 .工程菌用摇瓶发酵 ,表达产物ATF PAI2CD占培养液中总蛋白 5 0 %以上 .经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达 95 % .Western印迹检测具有PAI 2与uPA的免疫原性 ,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 .经流式细胞仪 (FCM )检测 ,能与肿瘤细胞特异性结合 .结果表明 ,ATF PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达 ,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能 .提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景 .     

Purification of the M flax-rust resistance protein expressed in Pichia pastoris

The M flax-rust resistance (R) gene is predicted to encode a 150-kDa protein of the Toll-interleukin-like receptor-nucleotide binding site-leucine rich repeat (TIR-NBS-LRR) class of plant disease resistance proteins and provides resistance against the Melampsora lini (flax rust) fungus carrying the AvrM avirulence gene. The extremely low level of this class of R proteins found in plant tissue has precluded their biochemical and structural analysis, and the study of these proteins has been largely restricted to genetic analyses and in vivo investigations. Here we report the production and purification of the M protein in the methalotrophic yeast, Pichia pastoris. Expression trials with five different constructs reveals optimum levels of soluble native M protein can be obtained as an N-terminally 9x His-tagged protein, in which the first 21 amino acids of the predicted wild-type protein are deleted. Expression was achieved using a high cell density fed-batch bioreactor culture at low temperature. M protein was purified to near homogeneity from whole-cell lysates using cation exchange, immobilised metal ion affinity chromatography and gel filtration with a final yield of approximately 3 mg of protein/1000 g wet weight of yeast cells lysed. The successful expression and purification of soluble M protein opens the way for biochemical and structural analysis of this class of important plant proteins.     

脂肪酶1在毕赤酵母中的高效表达

根据褶皱假丝酵母脂肪酶CRL中LIP1的成熟多肽序列 ,人工合成了由毕赤酵母 (Pichiapastoris)中偏爱密码子组成的lip1基因序列。该基因以N端融合的方式分别正确插入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA与组成型表达载体pGAPZαA中。通过电激将线性化的上述两种重组质粒分别转化毕赤酵母SMD116 8H细胞 ,筛选获得两株分别具有诱导型表达和组成型表达生物活性LIP1能力的高产菌株。其中 ,组成型表达菌株CHT II换液后 4 8h上清液中含脂肪酶活力为 2 .0 0× 10 5u/L ,表达产物在pH 4～ 8与温度 30～ 5 0℃范围内具有较高的脂肪酶活性 ;高密度发酵条件下 ,发酵 72h ,上清液中含脂肪酶活力可达 1.395× 10 6u/L ,表明构建的重组菌株具有更大的工业化生产优势。