人绒毛膜促性腺激素β—亚基在中国仓鼠卵巢细胞中…

本文以哺乳动物细胞表达载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ为运载体,构建了受控于ＳＶ４０早期启动子β－ｈＣＧ基因的表达载体,转染ＣＨＯ－ｈｆｒ＾－细胞后,挑选ＣＨＯ（ｄｈｆｒ＾＋）细胞,结果表明β－ｈＣＧ不仅在细胞中表达,不分泌到培养液中,通过氨甲喋（ＭＴＸ）加压后,表达量逐渐提高,０．１μｍｏｌ／ＬＭＴＸ条件下培养液中β－ｈＣＧ最高表达量可达到１．５μｇ／１０＾６细胞．２４小时。经亲和层析获得纯的重组β－ｈＣ     

乙型肝炎病毒表面抗原S和前S1融合基因转基因细胞系的建立与细胞性质的研究

构建了ｐＣＨＢＳＳＩＧ质料,其特点是ＣＭＶ立即早期启动子调控乙型肝炎（乙肝）表面抗原Ｓ＋前Ｓ１融合基因在前,ＳＶ４０早期启动子调控ＧＳ扩增基因在后,此质粒转化到ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中,经克隆加ＭＳＸ及ＭＴＸ筛选、扩增,建立了７个高效表达乙肝表达抗原Ｓ及前Ｓ１融合蛋白细胞系ＧｄＳＳ１,并检测了其中ＧｄＳＳ１－１８细胞系的生物学特性,结果表明：未发现微生物污染,无致瘤性、遗传稳定,电镜下可观察到２     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）组合突变体FrGGl在CHO细胞中的…

为了得到ｔ－ＰＡ组合突体ＦｒＧＧｌ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧｌ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０＾－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGl在CHO细胞中的高效表达

为了得到ｔＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧＩ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线性化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯｄｈｆｒ－）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１０６细胞·２４ｈ的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间约为３６ｈ,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株     

人转化生长因子β1 cDNA在COS－7细胞中的表达

在测定了ＴＧＦβ１全长序列的基础上,构建了两个ＴＧＦβ１的表达载体ｐＣＭＶβ和ｐＳＶＬβ;分别从转录水平和翻译水平检测了这两个载体在ＣＯＳ－７细胞中的表达。同时利用ＣＯＳ－７短暂表达系统,建立了ＴＧＦβ１的生物测活法;并分别研究了上清收获时间、表达载体、转染方法对ＴＧＦβ１表达的影响     

利用谷氨酰胺合成酶基因（GS）作扩增标记在CHO细胞中高效表达乙型…

利用谷氨酰胺合成酶基因（ＧＳ）作扩增选择标记,结合ＣＭＶ－ＩＥ启动子,在ＣＨＯ细胞中高效表达乙型肝炎的基因。初筛克卫表达水平ＲＰＨＡ检测为１：６４,经过谷氨酰胺合成酶基因的抑制剂ＭＳＸ的两轮基因扩增。ＨＢｓＡｇ的表达水平ＲＰＨＡ在１：２５６以上。方静置培养收液,ＲＩＡ检测ＨＢｓＡｇ最高产量为９．５μｇ／毫升。表达水平较以前利用ｄｈｆｒ基因扩增选择系统所得到的高表达细胞系Ｂ４３高一倍以上。利用ＧＳ基     

促红细胞生成素基因表达载体的构建及其在CHO细胞中表达的研究

用从基因文库中所克隆的促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因,构建了３种由不同启动子调控的表达载体——ｐＯＰ１３／ＥＰＯ,ｐＲＳＶ／ＥＰＯ,ｐＣＭＶ／ＥＰＯ,在这３个表达载体的构建过程中对基因的转录起始效率、内含子的剪接、５′非翻译区和３′非翻译区对基因表达的影响等因素都加以考虑．用脂质体转染法分别将上述３个载体导入ＣＨＯ细胞,经瞬时表达,用ＥＬＩＳＡ方法检测,表达量分别为１９０ｍＩＵ／ｍｌ、１６０ｍＩＵ／ｍｌ、４４７ｍＩＵ／ｍｌ．用表达载体ｐＯＰ１３／ＥＰＯ转染ＣＨＯ－Ｋ１２细胞,在４００μｇ／ｍｌ的Ｇ４１８浓度下筛选稳定表达细胞克隆,获得了表达量约为１６０ＩＵ／１０６细胞（４８ｈ）的Ｃ１０细胞株．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测发现了ＥＰＯ阳性条带．用ＴＦ－１细胞对ＥＰＯ进行了生物活性检测,初步证实所表达的ＥＰＯ有生物活性．     

利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)作扩增标记在CHO细胞中高效表达乙型肝炎表面抗原基因

利用谷氨酰胺合成酶基因（ＧＳ）［１］作扩增选择标记,结合ＣＭＶ－ＩＥ启动子,在ＣＨＯ细胞中高效表达乙型肝炎表面抗原基因。初筛克隆表达水平ＲＰＨＡ检测为１：６４,经过谷氨酰胺合成酶基因的抑制剂ＭＳＸ的两轮基因扩增,ＨＢｓＡｇ的表达水平ＲＰＨＡ在１：２５６以上。方瓶静置培养收液,ＲＩＡ检测ＨＢｓＡｇ最高产量为９．５μｇ／毫升。表达水平较以前利用ｄｈｆｒ基因扩增选择系统所得到的高表达细胞系Ｂ４３高一倍以上。利用ＧＳ基因扩增选择系统可以在哺乳动物细胞中高水平表达外源基因。     

人转化生长因子β1cDNA在COS—7细胞中的表达

在测定了ＴＧＦβ１全长序列的基础上,构建了两个ＴＧＦβ１的表达载达ｐＣＭＶβ和ｐＳＶＬβ;分别从转录水平和翻译水平检测了这两个载本在ＣＯＳ－７细胞中的表达。同时利用ＣＯＳ－７短暂表达系统,建立了ＴＧＦβ１的生物测活法;并分别研究了上清收获时间、表达载体、转染方法对ＴＧＦβ１表达的影响。     

人主动脉硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养的人血管壁细胞生长的作用

通过培养的人主动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ）及脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）,应用３Ｈ－ＴｄＲ参入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析、逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对ｈＡＳＭＣ和ｈＵＶＥＣＤＮＡ合成的作用及对血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ受体、转化生长因子β（ＴＧＦ－β）、内皮素－１（ＥＴ－１）或碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）基因表达和肾素－血管紧张系统（ＲＡＳ）的影响,结果显示,ＨＳＰＧ明显抑制培养的ｈＡＳＭＣ基础的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：１０３８５±３２６３ｖｓ,２５５４１±６４２１,Ｐ＜０．０１）及外源性ＰＤＧＦ诱导的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：９８７８±１９４７ｖｓ．１３４８１±４４ｌ０,Ｐ＜０．０５）;抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－Ｂｐ和ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,提高ＰＤＧＦａ和β受体ｍＲＮＡ的表达;显著降低ｈＡＳＭＣ培养液中血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）的浓度和血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）的活性,推测ＨＳＰＧ抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－β及ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,降低ＡＣＥ活性及ＡｎｇⅡ浓度是其抑制ｈＡＳＭＣ增殖的重要机     

Epstein─Barr病毒膜抗原在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达

将切去３’端穿膜序列的ＥＢ病毒膜抗原（ＭＡ）基因,插入ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ质粒的ＳＶ４０早期启动子下游,构建了真核表达载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒＧＰＴＲ,使两个ＳＶ４０早期启动子分别调控ＭＡ和二氢叶酸还原酶（ｄｈｆｒ）基因。将该重组质粒转化ＣＨＯ－ｄｈｆｒ细胞,在选择培养基中筛选阳性克隆,用氨甲喋呤加压扩增,建立了表达ＥＢＶ－ＭＡ的克隆细胞系。ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明,所表达的蛋白的分子量大约为３４０ｋｄ和２２０ｋｄ。经过细Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂ琼脂糖凝胶层析初步纯化的抗原与福氏佐剂混合免疫小鼠,２周后小鼠血清中出现明显的ｇｐ３４０／２２０特异性抗体,表明切去嵌膜区结构的ＥＢＶ－ＭＡ基因在ＣＨＯ细胞中的表达产物具有同天然膜抗原相似的分子量大小、糖基化程度、免疫特异性和免疫原性,可望成为ＥＢ病毒人用基因工程亚单位疫苗。     

利用HSV—TK基因治疗肝癌的离体研究

利用ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ－ＴＫ基因克隆至逆转录病毒载体（ＸＭ－６／ＴＫ）。经ＰＡ３１７细胞包装后，转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２。结果显示，ＸＭ－６／ＴＫ转染ＨｅｐＧ２细胞与野生型相比，其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物－环氧鸟苷（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）后，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。细胞学检查证实，ＧＣＶ处理后，转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示，应用ＨＳＶ－ＴＫ基因治疗肝癌可能为一种治疗肿瘤新的方法     

Epstein—Barr病毒膜抗原在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达

将切去３＇端穿膜序列的ＥＢ病毒膜抗原（ＭＡ）基因,插入ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ质粒的ＳＶ４０早期启动子下游,构建了真核表达载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒＧＰＴＲ,使两个ＳＶ４０早期启动子分别调控ＭＡ和二氢叶酸还原酶（ｄｈｆｒ）基因。将该重组质粒转化ＣＨＯ－ｄｈｆｒ细胞。在选择培养基中筛选阳性克隆,用氨甲喋呤加压扩增,建立了表达ＥＢＶ－ＭＡ的克隆细胞系。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ分析证明,所表达的蛋白的分子量大约为     

大鼠卵巢绒毛膜促性腺激素受体在CHO中的表达和扩增

本文报道了利用二氢叶酸还原酶放大系统将大鼠ＬＨ／ｈＣＧ受体（记为Ｆ－ｈＣＧＲ）及其胞外肽段（记为Ｔ－ｈＣＧＲ）在中国苍鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中的表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,Ｆ－ｈＣＧＲ为一条蛋白质带,其表观分子量为９２ｋｄ,而Ｔ－ｈＣＧＲ为３５ｋｄ和３７ｋｄ两条带。表达受体对其配基ｈＣＧ表现出高的亲合力,Ｆ－ｈＣＧＲ的解离常数为７×１０－９ｍｏｌ／Ｌ,Ｔ－ｈＣＧＲ为６．４×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞可结合１２５Ｉ－ｈＣＧ,而表达Ｔ－ｈＣＧＢ者不结合１２５Ｉ－ｈＣＧ。这提示Ｆ－ｈＣＧＲ主要存在于细胞质膜表面上。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞能刺激。ｃＡＭＰ的形成,而表达Ｔ－ｈＣＧＲ者不能刺激ｃＡＭＰ形成。免疫荧光定位结果表明,Ｔ－ｈＣＧＲ主要分布于质膜的细胞质侧以及胞内其他一些细胞器膜上。用免疫亲和层析可以得到纯化的Ｔ－ｈＣＧＲ。     

促性腺激素对猪卵丘细胞—卵母细胞复合体体外减数分裂？…

本实验利用猪卵母细胞体外无血清培养技术,选用猪卵泡液中自然存在的次黄嘌呤（ＨＸ）作为卵母细胞自发成熟的抑制剂,研究附了中性腺激素对猪卵丘细胞－卵母细胞复体（Ｃ ＥＯ）减数分裂恢复的具体作用。ＣＥＯ在含有不同浓度的促性腺激素（ＦＳＨ,ｈＣＧ,ＦＳＨ＋ｈＣＧ）的培养液中培养２４ｈ,观察卵母细胞减数分裂恢复（ＧＶＢＤ）情况。实验结果如下：１．ＦＳＨ（１－５００ＩＵ／Ｌ）能够明显刺激ＣＥＯ克服ＨＸ的抑制作     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

人主动脉硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养的人血管壁细胞生长的作用

通过培养的人主动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ）及脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）,应用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析、逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对ｈＡＳＭＣ和ｈＵＶＥＣ ＤＮＡ合成的作用及对血小板源生长因子（ＰＧＤＦ）、ＰＧＤＦ受体、转化生长因子β（ＴＧＦ－β）、内皮素－１（ＥＴ－１）或     

氧化修饰高密度脂蛋白对培养人动脉平滑肌细胞细胞周期蛋白D_1基因表达的影响

动脉平滑肌细胞（ｓｍ ｏｏｔｈ ｍ ｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ,ＳＭＣ）是动脉粥样硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ,ＡＳ）斑块中的主要细胞,它的增殖在ＡＳ形成过程中极其重要．利用体外培养的人主动脉ＳＭＣ,观察了天然高密度脂蛋白（ｎａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ,Ｎ－ＨＤＬ）及氧化修饰ＨＤＬ（ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＨＤＬ,ＯＸ－ＨＤＬ）对培养人主动脉ＳＭＣ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（细胞周期蛋白Ｄ１）基因转录表达的影响．结果表明：（１）Ｎ－ＨＤＬ对ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达无影响（Ｐ＞ ０．０５）;（２）ＯＸ－ＨＤＬ使ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达显著增强（Ｐ＜０．０１）,其表达量随时间（２、１２、２４ ｈ）延长而增加．上述结果表明,ＯＸ－ＨＤＬ的致ＡＳ作用可能与其刺激ＳＭＣｃｙｃｌｉｎ Ｄ１基因表达增加有关．     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素（ｐＧＨ）基因的ｃＤＮＡ进行测序,得到ｐＧＨｃＤＮＡ的全序列,并与Ｓｅｅｂｕｒｇ等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白ＸＩＶ启动子的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４构建出含ｐＧＨ基因的重组质粒ｐＸ３／４－ｐＧＨ。将ｐＸ３／４－ｐＧＨ与致死缺失型线性化ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,构建出既能形成多角体又能表达ｐＧＨ基因的苜蓿丫纹夜蛾     

大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活怀表达及在体外酰胺化？…

将大鼠脑ＣＤＮＡ库来源的ＰＡＭ基因片段,经克隆重组,成真核表达质粒ＰＳＶ－ＰＡＭ〈并转染ＣＨＯ细胞,获得在ＣＨＯ中稳定表达活性型α－酰胺化酶的细胞株ＤＧＡＥ。 物为双功能酶,分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。体外酰胺化加工研究表明。以α－Ｎ＿ａｃｅｔｙｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ为底物,该酶催化反应的Ｋｍ为１２．５μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１８０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈ,而且催化反应中表现中有最适铜离子浓度