基于Hog-MAPK信号通路探讨白念珠菌氟康唑耐药机制的实验研究

目的探讨Hog-MAPK信号通路在白念珠菌氟康唑耐药机制中的作用。方法通过Real-Time PCR、Western blot等方法比较白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株Hog-MAPK信号通路相关的HOG1等基因的mRNA表达,以及磷酸化p38 MAPK蛋白表达的差异,并应用微量液基稀释法检测白念珠菌HOG1基因缺陷株及其原始亲代菌株/标准株对氟康唑MIC值的差异。结果白念珠菌氟康唑敏感株与耐药株之间Hog-MAPK信号通路相关基因mRNA表达和蛋白表达存在一定差异性,敏感株的表达在一定程度上低于耐药株,HOG1基因缺陷株对氟康唑更为敏感。结论白念珠菌氟康唑耐药性可能与Hog-MAPK信号通路中部分基因和蛋白表达有关,这些基因和蛋白表达的降低可能使耐药性发生改变。     

植物LTR反转录转座子的研究进展

反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的遗传因子,它们以RNA为媒介,在基因组中不断自我复制。在高等植物中,反转录转座子是基因组的重要成分之一。反转录转座子可以分为5大类型,其中以长末端重复（LTR）类型报道较多。LTR类型由于其首尾具有长末端重复序列,内部含有PBS、PPT、GAG和POL开放阅读框、TSD等结构,可以采用生物信息学软件进行预测。LTR反转录转座子的活性受到自身甲基化和环境因素的影响,DNA甲基化抑制反转录转座子转座,而外界环境的刺激能够激活转座子,从而影响插入位点周边基因的表达。同时由于LTR反转录转座子在植物中普遍存在,丰富的拷贝数以及多态性为新型分子标记（RBIP、SSAP、IRAP、REMAP）的开发提供了良好的素材。该文对近年来国内外有关植物反转录转座子的类型、结构特征、 LTR反转录转座子的活性及其影响因素、 LTR反转录转座子的预测以及标记开发等方面的研究进展进行综述。     

低能离子束促进小麦copia-反转录转座子的转录与转座

LTR-反转录转座子是真核基因组重要的组成部分,能通过RNA中间体完成在基因组上的转座。小麦种子受低能氮离子束注入后能促进其反转录转座子的转录,经不同剂量的氮离子束注入的种子发芽24h和48h后,其中的copia-反转录转座子的转录都有不同程度的提高,最高可达到对照的40倍。用基于反转录转座子扩增多态性和反转录转座子微卫星扩增多态性2种分子标记技术扩增经低能氮离子注入后的小麦DNA,指纹图谱显示出了一定的多态性,这说明低能氮离子束激活了小麦中反转录转座子的转座活性。转座子转录活性的增强可调节其邻近基因的表达和mRNA的拼接,反转录转座子插入到基因组上新的位点后,使基因组上的基因发生了重排,这种重排可能表现为植物表型的改变。因此,推测反转录转座子的转录活性提高和转座激活是产生低能离子束注入生物效应的重要原因之一。     

白念珠菌氟康唑耐药株与敏感株SRB1、CDR1、ERG11表达比较分析

目的了解SRB1在白念珠菌氟康唑耐药株和敏感株表达差异,探讨与白念珠菌耐药性的关系。方法使用同一亲本来源的白念珠菌氟康唑耐药株CA-16和敏感株CA-3为研究对象,采用实时荧光定量RT-PCR的方法扩增各菌株的目的基因SRB1、CDR1、ERG11,观察各菌株目的基因表达情况。结果与白念珠菌氟康唑敏感株CA-3相比,在mRNA水平氟康唑耐药株CA-16的SRB1和耐药基因CDR1、ERG11表达升高,SRB1、CDR1、ERG11表达水平差异具有统计学意义(P0.05)。结论白念珠菌SRB1的表达增高和白念珠菌对氟康唑耐药密切相关,SRB1可能是一个新的耐药候选基因。     

328株念珠菌菌种分布及耐药性分析

目的调查医院念珠菌病原分布及对常用抗真菌药物的耐药性,为临床抗真菌治疗提供参考依据。方法回顾性调查我院2008年6月～2009年6月从住院患者分离到的328株念珠菌的种类、分布及耐药性。结果念珠菌种类主要为白念珠菌（68.6%）、热带念珠菌（13.4%）和光滑念珠菌（7.9%）;念珠菌来源以下呼吸道为主（82.3%）,其次为泌尿道（5.2%）、血液（4.0%）和肠道（3.4%）等;白念珠菌对氟康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶及两性霉素B耐药性较低（0.0%～7.1%）。结论医院念珠菌感染以白念珠菌为主,感染部位以下呼吸道多见,氟康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶及两性霉素B对白念珠菌具有较好的抗菌活性。对于念珠菌属开展耐药性监测有重要的临床意义。     

白念珠菌对特比萘芬耐药性的体外梯级诱导和回复研究

目的以浓度梯级倍增的特比萘芬在体外诱导白念珠菌标准株获得耐药子代菌株,并观察其耐药稳定性,从细胞水平研究白念珠菌对特比萘芬耐药前后生物学特性的变化,为进一步采用基因芯片在基因表达水平上研究特比萘芬对白念珠菌的药理作用及其诱导耐药机制提供理想的实验模型。方法将白念珠菌ATCC90028株在特比萘芬浓度逐渐梯级倍增的YPD液体培养基中分别转种传代,直到最后转种至含1024μg／ml特比萘芬的YPD液体培养基中培养,分别测定诱导后形成的各子代菌株的MIC值;选用以1024μg／ml特比萘芬诱导形成的耐药菌株,在不含特比萘芬的YPD液体培养基中连续传代10次后,测定其MIC值,观察其耐药表型的稳定性;并分别用肉眼、光镜和电镜观察白念珠菌耐药性产生前后的形态学特征。结果特比萘芬MIC值为8μg／ml的白念珠菌母本菌株（白念珠菌ATCC90028）成功地被诱导成特比萘芬MIC值为≥512μg/ml的子代菌株,进一步的耐药稳定性实验说明诱导后形成的子代菌株的表型是相对稳定的,诱导后的子代耐药菌株与其母本相比,生长繁殖速度减慢,细胞形态不规则,部分细胞胞膜不完整。结论通过在药物浓度梯级倍增的培养基中连续传代培养的方法可成功建立相同基因型的对特比萘芬敏感的白念珠菌母本和对特比萘芬耐药的子代模型,为获取有亲本的耐药白念珠菌菌株提供了一个有效的实验方法,是在基因水平研究白念珠菌对特比萘芬耐药机制的理想实验模型。     

植物反转录转座子及其在功能基因组学中的应用

高等植物中的反转录转座子是构成植物基因组的重要成分之一.它分病毒家族和非病毒家族两类,病毒家族包括反转录病毒和类似于反转录病毒的非病毒转座子,病毒家族中的反转录转座子可再细分为Ty3-gypsy类和Ty1-copia类;非病毒家族可细分为LINE类和SINE类.正常情况下大部分反转录转座子不具有活性,某些生物或非生物因素胁迫可激活部分反转录转座子转座.反转录转座子自身编码反转录酶进行转录,以"拷贝-粘贴"的转座模式导致基因组扩增和进化.具有活性的反转录转座子通过插入产生新的突变,可作为一种基因标签技术,应用于功能基因组学研究,并成为研究植物基因功能和表达的重要技术平台.本文综述了近几年来在植物反转录转座子方面的研究进展,主要包括植物反转录转座子的结构、特征、活性及其对基因组的影响和它们在功能基因组学中的应用.     

黄芩素与氟康唑协同抗白念珠菌生物被膜作用研究

目的：研究黄芩素与氟康唑合用对白念珠菌生物被膜形成的影响。方法采用激光共聚焦显微镜观察黄芩素与氟康唑合用对白念珠菌生物被膜生长形态的影响;采用 XTT 法考察黄芩素与氟康唑合用对白念珠菌生物被膜形成能力的影响;应用水-烃两相测定实验考察黄芩素与氟康唑合用对白念珠菌生物被膜细胞表面疏水性（ Cell surface hydrophobicity, CSH）的影响;应用实时定量 RT-PCR（Real Time RT-PCR）实验考察黄芩素与氟康唑合用对白念珠菌 CSH1、EFG1、HWP1、ALS1基因表达的影响。结果黄芩素与氟康唑合用能够协同抑制白念珠菌生物被膜的形成,经黄芩素与氟康唑处理的白念珠菌不能形成正常的生物被膜,其生长动力学及细胞表面疏水性下降,细胞疏水性相关基 CSH1、菌丝形成调控基因EFG1、黏附相关基因 HWP1基因的表达水平降低。结论黄芩素与氟康唑合用可协同抑制白念珠菌生物被膜的形成。     

不同唑类药物体外诱导热带念珠菌耐药特征及其耐药机制研究

目的比较体外不同唑类药物诱导热带念珠菌耐药性产生的特点以及耐药机制的不同。方法选取1株临床分离的唑类敏感菌,分别在含16μg/mL氟康唑,2μg/mL伏立康唑,1μg/mL泊沙康唑的液体培养基中进行传代培养。显色微量肉汤稀释法检测每一代菌的抗真菌药物敏感性。对第50代传代菌的唑类作用靶位点基因ERG11进行扩增测序,并对ERG11基因、泵蛋白基因MDR1、CDR1以及线粒体细胞色素b基因CYTb进行荧光定量检测。结果体外氟康唑、伏立康唑暴露的情况下,菌株很快出现耐药性;相比,泊沙康唑并未诱导出耐药菌;氟康唑、伏立康唑诱导耐药性产生的方式呈现不同特征。氟康唑诱导下菌株MIC值逐渐上升,但伏立康唑诱导菌出现了明显的跳跃式升高。耐药机制研究发现,伏立康唑诱导菌ERG11基因出现了与耐药密切相关的G/G1390G/A碱基杂合突变。荧光定量PCR结果显示,仅伏立康唑诱导耐药菌CDR1基因的相对表达量显著升高。结论热带念珠菌在体外氟康唑、伏立康唑暴露情况下会很快出现耐药性,但其出现的特征以及耐药机制有所差别。     

毛竹LTR反转录转座子PHRE6的克隆与转录活性分析

长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的DNA序列,因两端具有长末端重复序列而得名。大多数LTR反转录转座子能够感受外界环境的变化,具有转录激活特性和转座激活特性。该研究从毛竹(Phyllostachys edulis,Ph.edulis)基因组中克隆出一条完整的LTR反转录转座子,命名为PHRE6(Phyllostachys edulisretrotransposons 6),该转座子全长为5 620 bp,具有GAG和POL保守结构域。通过荧光定量PCR检测了PHRE6在DNA甲基化抑制剂和不同胁迫处理(包括辐照、高温、低温、高盐)的毛竹实生苗中转录水平的变化,结果表明,在DNA甲基化抑制剂处理后和高温(42°C)、低温(16°C、4°C)、高盐(100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl溶液)胁迫处理下PHRE6表达水平均有显著提高。以上结果说明,PHRE6是一个具有转录活性的反转录转座子,可能参与毛竹逆境响应过程。     

重症监护病房白念珠菌耐药性8年变化趋势

目的调查上海长征医院重症监护室(ICU)近8 a中临床分离白念珠菌的耐药性变化,为临床治疗提供参考。方法上海长征医院ICU 2002～2009年从414例患者中首次分离出414株白念珠菌,对其中277株进行药敏试验。采用Cox-Stuart趋势检验回顾性分析临床分离真菌中白念珠菌所占比例变化趋势和白念珠菌对常用抗真菌药物耐药率的变化趋势。结果 2002～2009年间,上海长征医院ICU白念珠菌分离株数从2002年的34株增加至2009年的92株,但白念珠菌占总真菌分离株数的百分比维持在34.6%～55.7%,P=0.03。白念珠菌对于5-氟胞嘧啶和两性霉素B平均耐药率分别为4.0%和0.7%,对其他常用抗真菌药的耐药率依次为咪康唑47.0%、酮康唑10.8%、伊曲康唑19.9%、特比萘芬42.6%、氟康唑14.6%及伏立康唑13.0%。白念珠菌对5-氟胞嘧啶和两性霉素B和伊曲康唑耐药率的8年变化无统计学差异。结论上海长征医院ICU近8 a来白念珠菌仍然为临床较为常见的真菌分离株,但白念珠菌占总分离株数的百分比有逐渐减少的趋势。白念珠菌对常用抗真菌药物耐药性均无明显变化趋势。     

复发性外阴阴道念珠菌病的致病菌种鉴定及药敏分析

目的：探究复发性外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种分布及耐药情况,指导临床治疗。方法：收集210例念珠菌性外阴阴道炎患者阴道分泌物标本,其中复发性外阴阴道念珠菌病（RVVC）组76例,外阴阴道念珠菌病（VVC）组134例。运用科玛嘉显色培养基法进行菌种鉴定和药物敏感试验。结果：在210例病例中,RVVC组中白色念珠菌54株（71.05%）,光滑念珠菌15株（19.74%）,热带念珠菌4株（5.26%）,克柔念珠菌2株（2.63%）,近平滑念珠菌1株（1.32%）。非白色念珠菌中以光滑念珠菌为主,在RVVC组中的比例明显高于VVC组,有显著性差异（P〈0.05）。药敏试验显示,RVVC的念珠菌株中仅8株对7种药物全部敏感,23株敏感药物〈5种,其中1株仅对制霉菌素敏感;对药物的敏感率为制霉菌素（97.37%）〉克霉唑（60.52%）〉酮康唑（51.32%）〉伊曲康唑（36.84%）〉咪康唑（35.53%）〉氟康唑（23.68%）〉特比奈芬（10.53%）。结论：白色念珠菌仍是RVVC的主要致病菌,非白色念珠菌比例在RVVC组中显著高于VVC组,其中以光滑念珠菌为主。念珠菌对制霉菌素敏感率最高,对唑类药物耐药性有增加趋势。     

白假丝酵母菌耐药与抗氰呼吸的相关性研究

目的探讨白假丝酵母菌的耐药情况及其与抗氰呼吸的相关性。方法用真菌药敏测定试剂盒测定从临床分离出来的37株白假丝酵母菌的耐药性,并从中选出5株耐药菌和5株敏感菌进行抗氰呼吸的研究。结果白假丝酵母菌对益康唑的耐药率最高,达54.1%,耐药白假丝酵母菌的抗氰呼吸速率均值为(17.56±6.75)nmol/(min.A620),敏感白假丝酵母菌的抗氰呼吸速率均值为(7.99±5.80)nmol/(min.A620),耐药白假丝酵母菌的抗氰呼吸速率明显升高,且耐药菌株抗氰呼吸速率占总呼吸的比例明显高于敏感菌株(P0.05),差异具有显著性。结论兰州市区白假丝酵母菌对益康唑耐药性较高,且白假丝酵母菌的耐药与抗氰呼吸途径相关。     

致念珠菌性包皮龟头炎白假丝酵母菌对9种抗真菌药物最低抑菌浓度测定

目的检测引起念珠菌性包皮龟头炎的白假丝酵母菌对9种抗真菌药物MIC,为临床治疗念珠菌性包皮龟头炎提供参考依据。方法常规培养分真菌,并鉴定到种,采用最低抑菌浓度法对白假丝酵母菌进行体外药物敏感试验。结果培养分离的12株菌中,白假丝酵母菌占75.00%,白假丝酵母菌生物变种占16.67%,近平滑假丝酵母菌占8.33%;11株白假丝酵母菌耐药率由高到低依次是氟康唑,伊曲康唑,咪康唑,酮康唑,克霉唑,益康唑,5-氟胞嘧啶啶,两性霉素B,制霉菌素,其中6种药物耐药率大于50%。结论白假丝酵母菌仍是造成念珠菌性包皮龟头炎最常见的致病菌,耐多药现象较为普遍,应根据临床实验室的体外药敏试验结果,指导临床合理用药。     

白念珠菌临床分离调查及基因分型研究

目的 了解白念珠菌临床分离情况,并探讨其药敏结果与基因分型的相关性.方法 回顾性分析本院2011年3～11月间临床分离白念珠菌分布及耐药性;随机选取232株,采用PCR方法扩增白念珠菌25S rDNA基因内含子区进行基因分型研究;采用ATB真菌药敏试剂条进行药敏分析;统计分析药敏结果与基因分型的相关性.结果 期间共检出酵母样真菌973例,占病原菌阳性样本数比率为15.7％ (973/6196);其中分离白念珠菌562株,占58％ (562/973),主要分布科室为呼吸科(39.1％)、老年科(13.2％)、ICU(7.7％)、神经内科(7.5％)、免疫科(6.0％)以及其他科室(26.5％);标本类型以下呼吸道为主(81.7％),其次为尿路(9.4％)、血液(1.8％)等.对氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑及伏立康唑的耐药率分别为0.9％、0％、1.4％、1.6％和1.1％.随机选取的232株白念珠菌经PCR方法可分为3型:A型125株,B型96株,C型11株.各型在5种药物的耐药性上并无差异.结论 临床分离酵母样真菌以白念珠菌为主,感染部位以下呼吸道为主;临床分离株对5种抗真菌药物敏感度较高,主要基因型为A和B型,不同基因分型间药敏结果并无统计学差异.     

118株口腔致病念珠菌病原学特征及药敏结果分析

目的调查分析临床致病口腔念珠菌菌种分布及对氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素、5-氟胞嘧啶和酮康唑的药物敏感性,以提供临床用药依据。方法收集口腔真菌感染患者标本,常规涂片镜检、培养,对酵母样生长菌落用生物梅里埃公司API20AUX进行菌种鉴定。对其中的念珠菌进行药敏分析。结果共收集141例临床口腔真菌病标本,其中118株念珠菌中,白念珠菌87株（73.7%）,热带念珠菌15株（12.7%）,高里念珠菌6株（5.1%）,光滑念珠菌4株,其他念珠菌6株。口腔念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素、5-氟胞嘧啶和酮康唑的耐药率分别为5.1%、1.7%、0%、3.4%、5.1%。结论解放军324医院口腔真菌感染主要为长期应用抗生素的老年患者。口腔念珠菌病仍以白念珠菌为主,对常用抗真菌药物呈不同程度的耐药,应进行真菌常规菌种鉴定及药敏试验。     

ATB FUNGUS2法在念珠菌属和新生隐球菌抗真菌药敏试验中应用的评价

目的评价ATBFUNGUS2半固体培养基法在测定念珠菌属和新生隐球菌对4种常用抗真菌药物敏感性中的应用价值。方法利用CLSIM27．A2微量液基稀释法和ATBFUNGUS2法同时测定131株念珠菌和20株新生隐球菌对两性霉素B（AmB）、氟康唑（FLC）、氟胞嘧啶（5-Fc）和伊曲康唑（ITC）的敏感性。结果①两种方法对于AmB、5-FC、FLC和ITC的一致性分别为98％、89．4％、78．8％和78．1％;②所有受试菌株中两种方法的一致性为80％,但ATBFUNGUS2法将2／5株M27-A2法检查为FLC耐药的白念珠菌判断为敏感或剂量依赖,将8／10株M27-A2法检查为FLC剂量依赖的白念珠菌判断为敏感或耐药。③ATBFUNGUS2法中AmB的MIC值判读范围偏高,以致于实际工作中不能读出准确的值。结论ATBFUNGUS2半固体培养基法在测定念珠菌属和新生隐球菌对4种常用抗真菌药物的敏感性时不失为简单、快速而且重复性好的方法。     

Candida albicans strain differentiation in complete denture wearers

Strain differentiation of 66 clinical isolates of Candida albicans obtained from healthy dentate and complete denture wearers was performed. Resistogram method based on differences in the resistance of C. albicans isolates to sodium selenite, boric acid, cetrimide, sodium periodate and silver nitrate was used for strain differentiation. Of the 32 potential strains that can be distinguished, 14 different resistogram strains of C. albicans were found among the 66 isolates tested. Strain-C--was the most predominant (24.3% of total isolates), while strain A-CDE was the least predominant (1.5%). The results showed no particular association of certain strains with Candida infections in complete denture wearers. Sensitivity to antifungal agents showed that isolates from different strains were most sensitive to amphotericin B and nystatin and least sensitive to miconazole.     

阴道白色念珠菌致病株与携带株两相性与毒力关系研究

目的探讨阴道白色念珠菌致病株和携带株菌丝相和酵母相分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶活性以及与其毒力的关系。方法分别采用牛奶平板和卵黄培养基法检测白色念珠菌致病株和携带株200株分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶的活力,分别将致病产酶株的菌丝相和孢子相菌悬液（5×10^6CFU／ral）注射小鼠尾静脉,1个月内观察小鼠死亡率及平均存活时间,以平均存活时间评价菌株毒力。结果白色念珠菌致病株和携带株分泌型酸性蛋白酶检出率分别为83．3％和35．7％（P〈0．01）;细胞外磷脂酶阳性率分别为87．5％和39．3％（P〈0．01）。动物实验结果表明,白色念珠菌致病株菌丝相分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶的活力均显著高于孢子相（P〈0．01,P〈0．005）;注射菌丝相白色念珠菌的小鼠死亡率高于注射孢子相的小鼠（P〈0．01）,且平均存活期短于注射孢子相的小鼠（P〈0．01）。结论分泌型酸性蛋白酶和细胞外磷脂酶是白色念珠菌重要毒力因子,致病株毒力高于携带株,菌丝相毒力高于酵母相。     

吸毒人群口腔念珠菌的药物敏感性分析

目的了解吸毒人群口腔念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性,为临床治疗念珠菌病提供参考资料。方法采用美国CLSI推荐的微量稀释法测定75株念珠菌对4种常用抗真菌药物两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑和酮康唑的药物敏感性。结果 75株吸毒人群口腔念珠菌对两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑和酮康唑的耐药率分别为0%、4%、8%和13.3%(P0.01),对氟康唑和酮康唑的交叉耐药率为8%;非白念珠菌对氟康唑和酮康唑的耐药率高于白念珠菌(P0.05)。结论吸毒人群口腔念珠菌对两性霉素B和5-氟胞嘧啶的敏感性高于对氟康唑和酮康唑的敏感性。吸毒人群口腔念珠菌存在着对氟康唑、酮康唑和5-氟胞嘧啶的天然耐药株和对唑类药物的天然交叉耐药株,且非白念珠菌对氟康唑和酮康唑的耐药率及交叉耐药率高于白念珠菌。