葡萄WRKY18基因的克隆及表达特性分析

以抗性品种‘左优红’组培苗为材料,克隆得到WRKY18基因,测序结果显示:VvWRKY18基因片段大小为954 bp,编码317个氨基酸序列。生物信息学分析结果显示VvWRKY18蛋白分子量约为35.2416 k Da,等电点为8.22,不稳定系数为48.61,推测为不稳定蛋白;与已知的粳稻、高粱、毛果杨及拟南芥WRKY家族蛋白高度同源;亚细胞定位预测结果显示主要存在于细胞核中,属于第二类WRKY转录因子家族成员。实时荧光定量PCR分析显示,VvWRKY18在葡萄不同组织中均有表达,在花中表达量最高;多种逆境胁迫因子如盐、干旱和低温等诱导VvWRKY18上调表达,且在低温胁迫6 h时诱导表达量最高。另外,VvWRKY18受胁迫信号分子水杨酸、脱落酸、一氧化氮和过氧化氢诱导上调表达,且VvWRKY18在一氧化氮处理下的表达模式与低温诱导的类似,推测VvWRKY18可能通过调控一氧化氮信号分子代谢途径来调节葡萄对低温胁迫应答。     

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。     

毛果杨CNGC家族全基因组鉴定及胁迫响应分析

植物环核苷酸门控离子通道（cyclic nucleotide-gated channels,CNGC）家族具有多种生物学功能,尤其是在植物的生长发育及逆境胁迫响应中发挥着重要的作用。本研究通过生物信息学方法及qRT-PCR对PtrCNGC家族成员蛋白的基本理化性质与结构特征、系统发育、基因结构和保守基序、启动子顺式作用元件,以及基因表达模式进行分析。结果表明：在毛果杨（Populus trichocarpa）全基因组中共鉴定出19个PtrCNGC基因,PtrCNGC家族成员可分为4个亚群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ亚群）,其中第Ⅳ亚群分为2个亚组（Ⅳa组和Ⅳb组）。PtrCNGC基因编码的蛋白均为碱性蛋白,此外,该家族仅有1个成员为疏水性蛋白,其余成员全部为亲水性蛋白。19个PtrCNGC不均匀地分布于毛果杨的11条染色体上,剩余8条染色体上没有成员分布。PtrCNGC家族包含7对同源基因且它们之间的K_a/K_s值均远小于1。PtrCNGC家族各亚群成员之间的基因结构、蛋白保守基序分布差异较小。启动子顺式作用元件预测分析发现,PtrCNGC基因序列启动子区域存在响应多种激素以及逆境胁迫相关的作用元件。qRT-PCR结果表明,PtrCNGC家族在不同组织中的表达具有特异性,在茎中的表达量较高,在根和叶中的表达量较低;在盐胁迫和干旱胁迫下,PtrCNGC家族同一分支上的多数成员表现出相似的表达模式。本研究结果为进一步研究毛果杨CNGC家族在非生物胁迫中的功能提供参考。     

毛果杨HDA901基因的克隆和表达分析

该实验克隆了毛果杨组蛋白去乙酰化酶基因HDA901的编码序列,并进行生物信息学、亚细胞定位和盐胁迫表达分析。序列分析表明,HDA901开放阅读框为1 245bp,编码1个由414个氨基酸残基组成的蛋白质,等电点为5.77;毛果杨HDA901与其他植物同源蛋白具有一段保守序列,在进化上与拟南芥AtHDA14亲缘关系较近。启动子分析表明,毛果杨HDA901基因启动子序列包含ACE、ABRE、HSE和TC-rich repeats等多个与逆境相关的顺式作用元件。亚细胞定位分析表明,毛果杨HDA901蛋白在细胞核和细胞质中无分布,可能位于线粒体或穿梭于线粒体和叶绿体之间。实时荧光定量PCR结果显示,毛果杨HDA901基因表达受盐胁迫调节,在盐胁迫下,根和茎中HDA901基因表达受抑制;叶中HDA901基因表达受诱导。研究表明,毛果杨HDA901基因参与盐胁迫应答反应。     

苦荞麦FtWRKY28基因克隆及其在低磷与激素诱导下的表达分析

【目的】WRKY转录因子参与植物对低磷胁迫反应的调控。文章基于前期苦荞在低磷胁迫下的转录组数据,克隆FtWRKY28 基因,预测基因及其编码蛋白的序列结构特征,分析基因在各器官中以及在低磷和激素处理下的表达模式,分析蛋白的亚细胞定位与转录激活活性,为阐明基因的生物学功能奠定基础。【方法】基于苦荞基因组数据库注释设计特异引物,用逆转录PCR从低磷处理的苦荞根RNA样中克隆FtWRKY28的完整编码序列,采用生物信息学方法分析基因与蛋白的结构以及同源蛋白的进化关系,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因的表达模式,采用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析蛋白的亚细胞定位,采用酵母单杂交分析蛋白的转录激活活性。【结果】FtWRKY28的完整编码序列长876 bp,编码1个含291个氨基酸、有1个WRKY结构域、锌指结构域为C2H2型的蛋白,归属WRKY家族Ⅱ组。FtWRKY28定位于细胞核,具有转录激活活性。FtWRKY28在根中表达水平最高,受低磷、吲哚乙酸、赤霉素3和6-苄氨基嘌呤显著诱导。【结论】FtWRKY28具有转录因子的基本结构与生物化学特征,可能通过生长素、赤霉素、细胞分裂素信号网络的交互作用,调控苦荞在低磷胁迫下的响应过程。     

毛果杨GATA基因家族全基因组水平鉴定及表达分析

GATA转录因子基因家族在植物生长发育、细胞分化以及响应环境变化中具有重要作用。然而,目前在木本植物中尚无该基因家族全基因组水平的分析报导。本项研究从基因组水平对毛果杨GATA家族成员的数量、基因结构、染色体定位、系统进化、编码蛋白的理化特征和保守基序等信息进行了系统分析,结果表明,毛果杨GATA家族包含39个基因,共分布于15条染色体上,其中5号染色体上含有6个基因,9号、13号和19号染色体含有基因数量为1,其余染色上无基因分布。该家族各基因的结构与编码蛋白的基本特性均存在一定异性,可分成4个亚族。qRT-PCR研究表明,GATA家族各基因在不同发育阶段的茎部表达量存在明显差异,且盐胁迫对各基因的表达特性影响显著。以上结果表明,毛果杨GATA家族基因在复制后,基因的结构与功能产生了明显分化,其中部分基因在毛果杨次生生长与盐胁迫响应中可能具有重要作用。本项研究为全面解析毛果杨GATA家族各成员在其生长发育与盐胁迫响应中的生物学功能奠定了基础。     

毛果杨固有无序蛋白质基因克隆及胁迫响应分析

为了解毛果杨中固有无序蛋白PtrIDP1（Potri.010G161200.1）基因的相关信息，探究该基因在毛果杨的不同组织、不同逆境胁迫下的表达特性，本研究根据Phytozome数据库中得到的基因全长序列设计引物，克隆得到该基因的目的片段。该基因完整的CDs区序列长度为423 bp，共编码140个氨基酸。构建亚细胞定位表达载体，瞬时转化洋葱表皮细胞，在激光共聚焦显微镜下观察显示，PtrIDP1定位在细胞核内。利用实时定量RT-PCR技术分析了PtrIDP1基因在毛果杨不同组织中的表达特异性和应对非生物胁迫的表达特性。结果表明：PtrIDP1基因在毛果杨的根、茎、叶中均有表达，其中在根部表达量最低，在茎和叶中相对表达量较高。PtrIDP1基因在高盐和干旱胁迫诱导时其表达量的变化模式不同，初步分析认为PtrIDP1基因参与了毛果杨非生物逆境胁迫的响应过程。     

毛果杨LBD基因家族的全基因组分析

LBD(lateral organ boundaries domain)蛋白是一类植物所特有的转录因子,在调控植物生长发育、营养代谢以及逆境胁迫的响应等方面发挥重要作用。然而,在基因组水平上对毛果杨LBD基因家族的研究还未曾有过报道。本研究利用生物信息学方法,从毛果杨基因组中鉴定出57个LBD基因并预测其分子量和等电点,这些基因分布于毛果杨18条染色体和Scaffold_65、Scaffold_86上。该家族成员基因结构简单,内含子数目不超过2个。进化关系分析显示毛果杨LBD基因可分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类,细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅰe、Ⅱa和Ⅱb等7个亚类。分析基因表达模式发现,该家族成员的表达具有一定时空特异性,并响应氮素胁迫处理。本研究为深入研究毛果杨LBD基因的功能奠定了基础。     

蒺藜苜蓿MtbHLH25基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】bHLH转录因子数量众多,能够广泛参与植物的生长发育和逆境胁迫等过程。本试验以蒺藜苜蓿R108为材料,初步探讨MtbHLH25基因的功能。【方法】通过PCR扩增技术从蒺藜苜蓿中克隆MtbHLH25基因和启动子,构建酵母表达载体并用LiAc转化法转移到Y2H Gold酵母菌株中进行酵母自激活检测,构建亚细胞定位载体并通过冻融法转入农杆菌EHA105,菌液注射到烟草下表皮细胞后利用SP8激光共聚焦显微镜观察,通过实时荧光定量PCR技术研究MtbHLH25基因的时空表达水平。【结果】（1）从蒺藜苜蓿中成功克隆出MtbHLH25基因和启动子,该基因总长882 bp,共编码293个氨基酸。启动子序列分析发现其包含了ABA、MeJA、GA和SA等响应元件。（2）进化树结果表明MtbHLH25蛋白与蚕豆和长柔毛野豌豆中bHLH蛋白高度同源。（3）亚细胞定位结果显示MtbHLH25蛋白定位于细胞核。（4）酵母自激活检测结果显示MtbHLH25蛋白具有自激活活性。（5）表达分析结果显示,MtbHLH25在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花和果实中均有表达,其中在根中表达水平最高;外源SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫使MtbHLH25基因表达量都呈下降趋势,推测SA、MeJA、ABA、GA以及盐胁迫对MtbHLH25基因的表达起到负调控作用。干旱胁迫能够显著诱导MtbHLH25基因表达量的上升,说明该转录因子可能在干旱胁迫中起到正调控作用。【结论】MtbHLH25基因可能对盐胁迫敏感,在干旱胁迫中可能发挥正调控作用。此外,MtbHLH25蛋白具有自激活活性,对下游启动子调控的报告基因可能具有激活作用。     

发菜PspA基因克隆及其转基因植物的抗旱性分析

为探讨发菜噬菌体休克蛋白A(PspA)的分子信息和基因功能,本研究通过设计特异引物克隆发菜PspA基因,采用qRT-PCR技术,分析发菜PspA基因在干旱胁迫下的表达模式;构建PspA真核表达载体pCAM35 s-GFP-PspA,对PspA进行亚细胞定位和PspA基因拟南芥遗传转化,并对阳性转化拟南芥分别进行Sout...     

镉胁迫下水稻OsPT1的表达及功能分析

OsPT1编码的水稻磷酸盐（Pi）转运蛋白在水稻生长发育、非生物胁迫应答等方面发挥重要的调控作用。前期研究表明OsPT1为镉（Cd）响应基因,但其在Cd胁迫下的功能及作用机制仍然未知。阐明OsPT1在Cd胁迫下的作用,并为低Cd水稻品种的选育奠定基础。通过生物信息学方法对该基因的序列特征、结构和功能进行分析和预测,利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测Cd胁迫下水稻不同组织、不同时间点OsPT1的相对表达量。此外,利用PCR的方法克隆OsPT1的编码序列,构建pGADT7-OsPT1重组质粒载体,并将其转入Δycf1 BY4741酵母菌株（Cd敏感酵母菌株）用以验证OsPT1对酵母Cd耐受性的影响。结果表明,OsPT1编码序列全长为1 584 bp,编码分子量为57.46 kD,由527个氨基酸构成的蛋白。在水稻基因组中该基因上游启动子区含有与光、厌氧、茉莉酸甲酯等环境和激素响应相关的调控元件。系统进化分析表明,水稻OsPT1与高粱SbPT1亲缘关系最近。基因的镉响应表达分析结果表明,与对照相比,经100 μmol/L Cd处理的水稻在1、6和12 h后,地上部分OsPT1的转录水平分别上调1.31、1.34和2.46倍;水稻根部OsPT1在处理1和6 h后分别上调1.28和1.14倍,但在Cd处理12 h后,其表达水平下调至处理前的0.62倍。转基因酵母Cd耐受性结果表明,与对照（0 μmol/L Cd）相比,经25 μmol/L Cd处理后,转OsPT1的酵母对Cd的耐受性有一定的下降。OsPT1可能在水稻应对Cd胁迫过程中发挥一定的作用。     

小黑杨转录因子PsnbZIP1应答盐胁迫功能分析

为揭示小黑杨(Populus simonii×P. nigra)在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbZIP1在植物体内发挥的功能,以小黑杨为试验材料,克隆得到PsnbZIP1的ORF区序列长为432 bp,并初步分析PsnbZIP1盐胁迫下的分子机制。采用q-PCR分析PsnbZIP1在150 mmol·L^-1 NaCl处理小黑杨组培苗时的表达模式,发现该基因的表达量快速上升;通过生物信息学分析预测PsnbZIP1转录因子为无跨膜结构且具有信号肽的亲水性不稳定蛋白;用农杆菌(Agrobacterium)介导的烟草(Nicotiana)瞬时表达观察该基因的亚细胞定位情况,结果表明该基因为核定位蛋白;用酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内不具有转录激活功能。对PsnbZIP1基因的启动子序列进行分析,结果表明该启动子包含了生长素应答、脱落酸应答元件、光应答元件以及种子特异性调控的顺式作用调控元件,该基因可能在植物的生长发育与响应胁迫过程中发挥了重要作用;启动子还包括参与干旱诱导的MYB结合位点和MYBHv1结合位点,表明该基因有可能与一些干旱诱导相关MYB基因...     

84K杨4CL3/4CL5基因克隆及生物信息学分析

木质素是木材的重要组成成分,主要起机械支持、水分运输及防御病虫害等作用。4CL酶是控制木质素合成途径中的关键酶之一。利用PCR技术从84K杨幼叶cDNA中克隆得到Pag4CL3/4CL5基因,GenBank 登录号分别为MK183033（Pag4CL3）及MK183034（Pag4CL5）。利用生物信息学软件,对这两个基因的功能和特征进行分析。结果发现84K杨中4CL3/4CL5蛋白与毛果杨中4CL3/4CL5蛋白相似度高达97%;此外,均含有SSGTTGLPKGV和GEICIRG两个保守基序;亚细胞定位预测显示Pag4CL3/4CL5蛋白主要定位在内质网中,推测可能是一种膜蛋白;蛋白的亲水性预测Pag4CL3/4CL5均为亲水性蛋白。通过qRT-PCR分析Pag4CL3/4CL5在不同组织部位中的表达差异,结果发现Pag4CL3在叶及茎中表达量较高,在根和顶芽中表达量较低;Pag4CL5在叶及根中表达量较高,在茎和顶芽中表达量较低,两个同源基因表达具有组织部位的差异性。Pag4CL3和Pag4CL5可能在叶中共同行使功能,Pag4CL5主要在根中行使功能,Pag4CL3主要在茎中行使功能。     

毛果杨nsLTP基因家族全基因组水平鉴定及其表达特性分析

植物非特异性脂质转移蛋白（non-specific lipid transfer proteins,nsLTP）是一类多基因家族编码碱性蛋白,负责脂肪酸体外结和与膜之间的磷脂转移,在植物生长发育和逆境胁迫响应中扮演着重要角色。目前为止,尚无模式植物毛果杨（Populus trichocarpa）nsLTP家族的研究报导。本研究从全基因组水平对PtrnsLTP家族成员的基因数量、亲缘关系、基因结构、编码蛋白保守基序等特性进行了分析,结果表明：PtrnsLTP家族共由39个基因组成,进化成5个亚家族,其中A亚族含有6个基因、B亚族含有2个、C亚族含有13个、D亚族含有3个、E亚族含有15个。PtrnsLTP家族包含7对旁系同源基因,其中1对大于1,6对Ka/Ks均远小于1,且这6对基因均处于同一个大的进化分支上,进化压力的不同导致基因间的功能出现了分化,编码蛋白均含有Motif 1和 Motif 2保守基序。利用qRT-PCR技术并结合杨树转录组数据对PtrnsLTP的组织表达与盐胁迫响应特性研究发现：各家族成员在毛果杨根、茎和叶中均有表达且经qRT-PCR技术验证后与网站预测结果基本吻合,有11、15和13个成员分别在根、茎和叶中有较高的表达,表明该基因家族参与了杨树不同组织的生长发育;NaCl胁迫下,该家族39个基因中分别有26个成员在根部、14个成员在叶部表达量随着胁迫时间的增加而升高,而32个基因在茎部表现为先升高后降低的趋势。本研究结果对于PtrnsLTP家族基因生物学功能的鉴定与盐胁迫响应基因资源的工作有着积极的推动作用。     

刚毛柽柳ThGRF2基因的克隆和渗透胁迫应答分析

14-3-3蛋白通常也称为通用调节因子（general regulatory factors,GRF）,是一类丝氨酸和苏氨酸磷酸化结合蛋白,通过与其他转录因子或信号蛋白相互作用参与调节细胞内基础代谢、信号传导、参与植物生长发育以及环境胁迫应答等一系列生理过程。本研究从刚毛柽柳干旱转录组中克隆获得一条干旱胁迫差异表达的ThGRF2基因。ThGRF2基因CDS片段全长为786 bp,编码261个氨基酸。相对分子质量为29.40 kDa,理论等电点（pI）为4.76。将ThGRF2基因构建到pROK2过表达载体上,瞬时转化刚毛柽柳,渗透胁迫前后生理指标结果显示,渗透胁迫后ThGRF2过表达提高了转基因柽柳的叶绿素含量、SOD和POD活性,降低了丙二醛（MDA）含量、电导率（EL）和失水率,表明ThGRF2基因在刚毛柽柳渗透胁迫应答中起重要作用。为进一步探究刚毛柽柳ThGRF2基因的非生物胁迫耐受性功能奠定基础。     

马铃薯StNPR4基因的克隆与功能分析

为探究StNPR4基因在马铃薯（Solanum tuberosum）中应对生物胁迫和非生物胁迫的功能,本研究通过克隆StNPR4的CDS序列和启动子序列,进行生物信息学分析;利用qRT-PCR进行组织表达特异性分析;同时构建了由其自身启动子驱动的StNPR4双元表达载体,转化马铃薯获得了转基因马铃薯,研究转基因马铃薯对水杨酸、致病疫霉和高盐胁迫的响应。结果显示：StNPR4具有典型的NPR1家族的功能结构域,启动子上具有响应于生物胁迫和非生物胁迫的顺式作用元件。StNPR4在叶中的表达量最高;StNPR4受SA诱导表达,且在转基因植株中的诱导表达程度高于对照;转基因马铃薯增强了对致病疫霉的抗性,在高盐胁迫下生根率更高。说明StNPR4不仅在马铃薯生物胁迫中发挥重要作用,而且在非生物胁迫中也扮演着重要角色。     

深海白色侧齿霉遗传转化体系建立及渗透压调控相关的EaSHO1基因功能

海洋中具有丰富的动植物及微生物资源,海洋真菌是其重要组成之一。我们前期的研究发现一株深海真菌白色侧齿霉Engyodontium album能产生具有抑菌活性的次级代谢产物engyodontiumin A,该化合物能抑制黑曲霉、金黄色葡萄球菌及创伤弧菌等病原菌的生长,是一种潜在的海洋源抗菌药物。目前,该菌遗传转化体系尚未建立,不利于开展次级代谢产物合成调控机制及其他功能基因研究。本研究成功制备了深海白色侧齿霉菌的原生质体,建立了借助聚乙二醇3350介导的原生质体转化体系,并将pCT74-sGFP载体成功导入白色侧齿霉的原生质体中,结果显示外源GFP能稳定表达。此外,为了明确白色侧齿霉菌是否能够开展基因敲除研究,通过氨基酸序列同源比对,我们选取酵母高渗甘油信号途径中的同源基因EaSHO1进行初步探究。利用同源重组的方法成功将目的基因EaSHO1的开放阅读框(ORF)替换成潮霉素磷酸转移酶基因(HPH),由此获得EaSHO1基因敲除突变体,并对突变体进行Southern杂交验证及初步的表型分析。结果表明,EaSHO1缺失不影响白色侧齿霉菌的营养生长及对高盐胁迫的响应,亚细胞定位结果显示EaS...     

甘蓝型油菜BnTTG1-1基因的功能分析

拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtTTG1作为WD40重复转录因子存在于细胞核中,对表皮毛形成、花青素合成和储藏物质积累等具有重要调节作用。该研究从甘蓝型油菜(Brassica napus)品种秦优7号中克隆获得了BnTTG1-1基因的全长CDS序列,对其进行了烟草(Nicotiana benthamiana)叶片细胞的亚细胞定位研究,检测了BnTTG1-1在油菜(B.campestris)中的时空表达模式,并比较分析了BnTTG1-1对多个生物学过程的影响作用。结果表明,BnTTG1-1定位于烟草叶片细胞的细胞核中,推测其作为转录因子发挥调节作用。BnTTG1-1广泛存在于油菜营养组织和发育的种子中。在突变体ttg1-13背景下,异源表达BnTTG1-1基因能够完全恢复该突变体的多个表型,如无表皮毛形成和花青素合成、种皮呈黄色、种子脂肪酸和储藏蛋白含量高以及在种子萌发和幼苗形态建成过程中对高葡萄糖和高盐胁迫耐受力差等。由此可知,甘蓝型油菜BnTTG1-1与拟南芥AtTTG1在植物生长发育的多个生物学过程中具有类似的功能。