嗜吡啶红球菌R04的联苯降解途径的研究

通过GC-MS测定出嗜吡啶红球菌R04菌降解联苯的中间代谢物2,3-二氢二羟基联苯、2,3-二羟基联苯和苯甲酸,并测定了该菌的2,3-二羟基联苯双加氧酶、2-羟基-6-酮基-6-苯基-2,3-己二烯酸(HOPDA)水解酶和苯甲酸双加氧酶活性。最终确定了R04菌降解联苯的途径为2,3-二羟基联苯双加氧酶途径。     

恶臭假单胞菌ND6菌株catA基因的克隆和表达及其儿茶酚裂解途径探讨

恶臭假单胞菌ND6菌株的萘降解质粒pND6-1中编码儿茶酚1,2-双加氧酶的catA基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达,并研究表达产物的酶学性质。结果表明:酶的Km为0.019μmol/L,Vmax为1.434μmol/(min.mg);具有很好的耐热性,在50℃保温45min后仍能够保留酶活力的93.7%;Fe2 对酶活性有显著的促进作用,其比活力是对照反应的292%;酶对4-氯儿茶酚的催化活性非常低,属于Ⅰ型儿茶酚1,2-双加氧酶。以萘为底物生长时,ND6菌株的细胞提取液中既存在催化邻位裂解途径的儿茶酚1,2-双加氧酶活性,也存在催化间位裂解途径的儿茶酚2,3-双加氧酶活性。以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为唯一碳源生长时,ND6菌株细胞提取液的儿茶酚1,2-双加氧酶活性远远大于儿茶酚2,3-双加氧酶活性。表明ND6菌株既能通过儿茶酚间位裂解途径降解萘,也能通过儿茶酚邻位裂解途径降解萘,而以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为诱导物时只利用儿茶酚邻位裂解途径。     

恶臭假单胞菌ND6菌株catA基因的克隆和表达及其儿茶酚裂解途径探讨

恶臭假单胞菌ND6菌株的萘降解质粒pND6-1中编码儿茶酚1,2-双加氧酶的catA基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达,并研究表达产物的酶学性质。结果表明:酶的K_m为0.019μmol/L,V_max为1.434μmol/(min.mg);具有很好的耐热性,在50℃保温45min后仍能够保留酶活力的93.7%;Fe²⁺对酶活性有显著的促进作用,其比活力是对照反应的292%;酶对4-氯儿茶酚的催化活性非常低,属于Ⅰ型儿茶酚1,2-双加氧酶。以萘为底物生长时,ND6菌株的细胞提取液中既存在催化邻位裂解途径的儿茶酚1,2-双加氧酶活性,也存在催化间位裂解途径的儿茶酚2,3-双加氧酶活性。以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为唯一碳源生长时,ND6菌株细胞提取液的儿茶酚1,2-双加氧酶活性远远大于儿茶酚2,3-双加氧酶活性。表明ND6菌株既能通过儿茶酚间位裂解途径降解萘,也能通过儿茶酚邻位裂解途径降解萘,而以苯甲酸、对羟基苯甲酸和苯乙酸为诱导物时只利用儿茶酚邻位裂解途径。     

食酸丛毛单胞菌AN3菌株降解苯胺代谢途径的研究

食酸丛毛单胞菌(\%Comamonas acidovorans\%)AN3菌株中降解苯胺的酶类均为诱导酶,在以苯胺为唯一碳、氮源和能源生长的细胞中,含有苯胺双加氧酶、邻苯二酚2,3双加氧酶、2羟基己二烯半醛酸脱氢酶、4草酰巴豆酸脱羧酶和4羟基2酮戊酸醛缩酶等。苯胺双加氧酶作用于苯胺的\%K\%m值和\%V\%\-\{max\}分别为292μmol/L和3.57μmol\5mg\+\{-1\}·min-1;邻苯二酚2,3双加氧酶作用于邻苯二酚的\%K\%m和\%V\%\-\{max\}分别为16.4 mol/L和15.2μmol\5mg\+\{-1\}\5min\+\{-1\}。根据实验结果,推测了该菌株降解苯胺的代谢途径。     

丛毛睾丸酮单胞菌ZD4-1和铜绿假单胞菌ZD4-3降解芳香烃化合物的机理

从某农药厂二沉池污泥中筛选分离得到两株革兰氏阴性的芳香烃降解菌ZD41和ZD43。经鉴定,它们分别属于Comamonas testosteroni和Pseudomonas aeruginosa。基于16S rDNA 序列的系统分类分析,结果表明,在分类地位上菌株ZD41和ZD43 分别属于两个不同的分类亚组。苯酚降解产物紫外光谱扫描和双加氧酶检测证明,菌株ZD41利用邻裂途径降解苯酚,而ZD43则通过间裂途径降解苯酚,邻裂途径的1,2双加氧酶和间裂途径的2,3双加氧酶都是可诱导的双加氧酶,其活性强烈的依赖于降解底物的出现。芳香烃降解试验结果表明,邻裂和间裂两种途径的降解性能不一样,虽然ZD43降解苯酚的效率要高于菌株ZD41,但是ZD41降解苯酚的pH值范围以及芳烃利用基质谱宽于后者。     

联苯培养条件下红球菌R04转录表达和苯甲酸代谢途径解析

摘要:【目的】研究不同碳源,特别是联苯条件下红球菌的细胞转录应答,以挖掘与多氯联苯(PCBs)转运、代谢及其调控相关的基因,为进一步全面理解PCB微生物降解的分子机制奠定基础。【方法】以一株多氯联苯降解菌红球菌(Rhodococcus sp.R04)为材料,分别提取不同碳源(乙醇、葡萄糖和联苯)培养条件下菌体的总RNA,反转录合成cDNA。采用高通量测序法分别对这三种样品进行转录组测序,分析测序数据得出全基因组表达模式,并对不同条件下的基因表达进行差示分析,进而对联苯代谢网络和红球菌中其他基因的转录调节和代谢应答反应做出相关性分析。Q-RT-PCR分析不同碳源培养条件下的基因表达情况。【结果】测序结果表明,与葡萄糖和乙醇相比,联苯培养条件下明显上调(log2 Ratio 1)基因个数分别为375和332个。与葡萄糖相比,联苯培养条件下,相关基因上调表达量与Q-RT-PCR实验结果基本一致。功能分类获得细胞组分、分子功能和生物学过程三大类别160多个细小分支的差示表达基因,部分基因参与联苯代谢转录调控、联苯转运、抗氧化应激反应以及信号传导通路系统等多种生理过程。参与联苯上游代谢途径的众多同工酶基因中,只有bphC2和bphD1在联苯中大量上调表达,其余同工酶在联苯中基本量不变或下调表达。转录组注释及差示分析推测,红球菌R04中苯甲酸的代谢主要是通过儿茶酚邻位途径、间位途径以及原儿茶酸途径三条代谢途径完成。【结论】与葡萄糖和乙醇相比,红球菌R04在联苯培养条件下基因表达差异明显,这为我们进一步解析多氯联苯代谢特征和代谢调控提供理论依据。     

红球菌R04联苯/多氯联苯代谢相关调控蛋白RHOGL007659的生理功能

【目的】研究红球菌(Rhodococcus sp.)R04调控蛋白RHOGL007659的生理功能及其缺陷菌株的代谢特性,初步探究红球菌R04降解联苯的调控机制。【方法】通过基因同源重组敲除红球菌R04联苯代谢相关基因RHOGL007659。比较红球菌R04(野生型)和缺陷型菌株R04Δ7659(基因RHOGL007659缺陷型的R04)在不同碳源培养下的生长情况,HPLC分析R04和R04Δ7659转化联苯的能力。提取R04和R04Δ7659的总RNA,实时荧光定量PCR检测联苯降解关键基因的转录表达。纯化Bph B(联苯降解脱氢酶)和Bph D(联苯降解水解酶),制备多克隆抗体。Western blot分析Bph B和Bph D蛋白在R04和R04Δ7659中的表达水平。【结果】获得了RHOGL007659基因的缺陷型菌株R04Δ7659,与R04相比,R04Δ7659在联苯培养条件下的生物量趋近于零。HPLC分析表明,RHOGL007659基因的缺失使红球菌R04丧失转化联苯的能力。实时荧光定量PCR结果表明,在联苯培养条件下,缺失RHOGL007659后的R04,其联苯降解关键基因均有不同程度的下调表达。Western blot分析显示RHOGL007659缺失后,联苯降解关键酶Bph B和Bph D表达量均降低,这与实时荧光定量PCR结果相一致。【结论】RHOGL007659是红球菌R04联苯降解关键基因簇的调控蛋白,该蛋白对红球菌R04代谢联苯过程具有正调控作用。     

红球菌R04细胞的不对称分裂及其在联苯胁迫下的分裂抑制

【目的】研究红球菌R04细胞的分裂方式及联苯对其形态和细胞分裂的影响。【方法】以一株多氯联苯降解菌株(Rhodococcus sp.R04)为研究对象,利用荧光显微镜、扫描电子显微镜及透射电子显微镜分析红球菌R04在不同培养条件下的细胞分裂。【结果】红球菌R04细胞表现出对称分裂(约占30%)和不对称分裂(约占70%)两种分裂方式,且培养条件不影响不对称分裂细胞所占的比例。细胞分裂过程中,隔膜主要分布于细胞长度的30%–50%。在联苯的分解代谢过程中,红球菌R04细胞的生长分裂会受到联苯的抑制,但不影响红球菌R04细胞的分裂方式,在联苯胁迫下,细胞形成丝状化,表现出异常分裂,随着培养时间的延长,在细胞生长指数后期至转换期,细胞能够进行正常分裂。【结论】环境异生型化合物联苯/多氯联苯对其降解菌株——红球菌R04细胞的生长和分裂有较强影响,但是并不影响其分裂方式。     

芳香族化合物生物降解的研究进展

本文综述了以苯、取代苯、联苯和多环芳烃为代表的芳香族化合物的生物降解途径,其共同之处在于经过两步双加氧酶作用,生成二醇和开环。两步双加氧酶分别为芳环羟基化双加氧酶和芳环断裂双加氧酶。以甲苯途径为代表讨论了芳香族化合物的分子生物学研究情况。代谢工程研究是九十年代兴起的芳香族化合物生物降解的研究内容,通过对甲苯途径的代谢工程研究明确了途径中的关键酶,并通过对关键酶的活性提高使整个途径的代谢流增加。     

邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构和功能研究进展

邻苯二酚是所有芳香族化合物降解过程中的重要的中间产物,其降解有邻位和间位裂解两条裂解途径,分别由邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)催化裂解。本综述简要介绍了邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构和功能的研究进展。