质粒介导的核衣壳蛋白siRNA干扰A型流感病毒复制的研究

A型流感病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科流感病毒属,可引起鸟类、多种禽类、人类和低等哺乳动物的严重疾病[1],该病毒基因组为负链单股RNA病毒, 分8个节段,容易引起抗原漂移和抗原变异,现有的疫苗和药物不能有效的控制该病毒感染.     

流感病毒A非结构蛋白功能的研究进展

流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxoviridae),是一种带包膜并且分节段的单负链RNA病毒。根据病毒核衣壳蛋白(Nucleocapsid)和基质蛋白(Matrix,M)抗原性的差异,流感病毒可分为甲、乙、丙3个型。甲型流感病毒呈球形或丝状,其RNA基因组总长度在13.6kb左右,分为8个节段,共编码10个蛋白     

SARS冠状病毒中的核衣壳蛋白

严重急性呼吸综合征(SARS)的元凶是一种新冠状病毒,研究病毒结构蛋白的功能有助于了解病毒的感染、复制和包装等生理过程。其中核衣壳蛋白是SARS冠状病毒中含量最丰富和最保守的结构蛋白,自身聚合后包被病毒RNA基因组形成螺旋状核壳体是SARS冠状病毒成熟的关键步骤;核衣壳蛋白能与病毒或宿主细胞中多种蛋白质相互作用,还能影响宿主细胞的多个通路。因此核衣壳蛋白是一个重要的多功能蛋白质,参与了病毒感染、复制和病毒包装等过程。     

Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的转基因小鼠。方法:用分子克隆的方法构建包括肺表面活性蛋白A(SP-A)启动子、SARS-CoVN蛋白基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和人生长激素(hGH)polyA的转基因载体pSP-A-N。以显微注射的方法将8.3kb的转基因片段引入小鼠受精卵。通过PCR、Southern印迹和LacZ染色检测子代小鼠中转基因的整合及表达。结果:共注射952枚受精卵,移植至42只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠128只,经PCR、Southern印迹鉴定,其中11只小鼠基因组上整合有SARS-CoVN蛋白基因,整合率为8.6%。鉴定结果显示,11只转基因首建者小鼠中有1只表达外源基因并能正常传代。LacZ染色结果表明N蛋白基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中特异表达。结论:成功构建了Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS-CoVN蛋白的转基因小鼠,为深入研究该基因的病理生理学效应奠定了基础。     

siRNA在抗流感病毒感染中的研究进展

季节性流感和全球性大流感的危害已普遍受到社会各界的关注,而目前的流感治疗药物和流感疫苗在使用上存在一定局限性。siRNA及其介导的RNAi过程自发现以来,其高度特异性和强选择性被广泛应用于抗流感病毒感染的研究中,为流感病毒的防治提供了新思路。而随着研究的深入,siRNA仍面临巨大挑战。对siRNA在抗流感病毒感染中的研究进展进行了综述。     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的研究进展

核衣壳蛋白(N蛋白)是SARS冠状病毒(SARS-CoV)的结构蛋白,与病毒RNA结合形成核衣壳,是主要的抗原分子。最近的亚定位研究表明,它主要定位到细胞质,核仁内也有较少的分布。SARS-CoVN蛋白参与SARS-CoVRNA合成的调控以及核衣壳的形成,并能结合人亲环素(hCypA)解离病毒核心,激活AP-1信号转导途径,类泛素蛋白化干扰宿主细胞分裂,在缺乏生长因子的情况下诱导细胞凋亡。     

杆状病毒核衣壳组装相关蛋白研究进展

杆状病毒生命周期中会产生包埋型和芽生型两种病毒粒子,这两种病毒粒子的包膜组成存在明显的差异,但拥有相同的核衣壳结构.杆状病毒核衣壳是由衣壳蛋白和杆状病毒基因组两部分组成,核衣壳的正常组装对两种病毒粒子的形成都是不可或缺的,因此核衣壳的正常组装在病毒的整个感染传播过程中发挥着重要作用.尽管越来越多参与核衣壳组装的蛋白被鉴定出来,目前还有许多核衣壳组装细节不明了,例如这些衣壳蛋白之间的互作关系是怎样的,宿主通过何种方式参与到病毒核衣壳组装过程等.本文主要以杆状病毒模式物种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)为例综述了参与杆状病毒核衣壳组装的相关蛋白,并对一些参与核衣壳运输有关的核衣壳蛋白也做了阐述.     

水稻草矮病毒核衣壳蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

水稻草状矮化病于70年代曾在南亚、东南亚大面积发生,给当地的水稻生产造成严重损失,在我国也有分布[1].其病原是水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV),为纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员,病毒粒体丝状,由核衣壳蛋白和基因组RNA组成[2].基因组含六个ssRNA片段,均为双义编码[3,4],其中RNA5的毒义互补链编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NCP)[3].本文报道应用RT-PCR技术获得RGSV沙县分离株(RGSV-SX)NCP基因的cDNA克隆,并得到其在大肠杆菌中的表达产物.     

肾综合征出血热病毒核衣壳蛋白在抗感染免疫中的应用

采用区带离心纯化的肾综合征出血热（ＨＲＲＳ）汉滩病毒ＬＲ１株核衣壳蛋白（ＮＰ）分别免疫新西兰白家兔和昆明种小鼠。以ＮＰ免疫家兔后用ＬＲ１株病毒攻击,实验显示,免疫后的家兔可保护１００ＩＤ５０同株病毒的攻击;ＮＰ免疫母鼠所产的乳鼠能抵抗１０＾４－１０＾５ＬＤ５０同株病毒的攻击。以上结果表明：ＨＲＲＳ的病毒ＮＰ组分在抗感染免疫中起重要作用。     

鸭肠炎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的：对DEV贵州分离株NP基因进行克隆与序列分析,构建NP基因的原核表达载体,分析NP基因原核表达产物的免疫反应性。方法：根据GeneBank登载的DENNP基因序列设计引物,对DEV贵州分离株进行PCR扩增、克隆和测序,采用生物信息学软件程序分析NP蛋白的氨基酸序列;将该基因插入到原核表达载体pET32a上进行原核表达和Western Blotting分析。结果：DEV贵州分离株NP基因全长759bp,核苷酸序列与参考株一致;NP基因编码蛋白相对分子量为27．1kDa,理论pI为5．89,肽链上第10．15、88．92和182．186区段及其附近区域可能是B细胞表位优势区;构建得到的重组质粒pET32-NP可表达出一条大小约为48kDa的蛋白,且能与兔抗DEN-IgG发生特异性结合。结论：NP基因在DEN基因组中高度保守,其原核表达产物具有良好的免疫反应性。     

利用靶定基质蛋白基因m的小干扰RNA抑制2009甲型H1N1流感病毒的复制

目的:设计、构建并筛选针对流感病毒基质蛋白基因m的小干扰RNA(siRNA),检测其对2009甲型H1N1流感病毒复制的抑制效果。方法:设计3条针对流感病毒m基因的siRNA,并克隆到短发夹型(shRNA)siRNA表达载体pSilencer2.1-U6-hygro上;经测序证明构建成功后,将表达3种siRNA的质粒和阴性对照质粒psiRNA-control分别转染MDCK细胞,用潮霉素筛选稳定表达细胞株,用H1N1流感病毒感染细胞,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果。结果:构建了3个针对流感病毒m基因的siRNA表达质粒,3种siRNA均使m基因的mRNA水平降低,其中M1-306的抑制效率达60%;3种siRNA均使流感病毒NA蛋白的表达量降低,M2-25、M1-105的抑制效率明显,M1-306略低。结论:针对m基因的siRNA可以有效抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制及基因表达研究进展

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由21～23个核苷酸组成的双链RNA(dsRNA)所引发的生物细胞内同源基因转录后沉默的现象,是生物体在进化过程中普遍存在的一种基因调控机制。目前对由乙型肝炎病毒(HBV)引起的病毒性肝炎尚无令人满意的治疗效果,而RNA干扰技术的出现为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。本文对RNA干扰抑制HBV复制及基因表达的研究现状、存在问题及应用前景进行了综述。     

PML Suppresses Influenza Virus Replication by Promoting FBXW7 Expression

Virologica Sinica - Influenza A viruses (IAV) are responsible for seasonal flu epidemics, which can lead to high morbidity and mortality each year. Like other viruses, influenza virus can hijack...     

靶向山羊痘病毒DNA聚合酶基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

本研究针对山羊痘病毒基因组高度保守的DNA聚合酶区段,选取了5个干扰靶位点。根据RNAi技术原理,构建了包括对照在内的6个shRNA重组表达质粒,转染细胞后接种病毒,通过细胞毒液的TCID_(50)测定和用实时荧光定量PCR检测siRNA重组质粒对羊痘病毒DNA聚合酶基因表达的抑制作用。结果显示,重组表达质粒组的抑制率在63%以上,其中以pSI-W2最为明显,抑制率为93.8%。该研究应用RNAi技术在细胞水平筛选出了能够高效抑制山羊痘病毒增殖的干扰片段,为抗山羊痘病毒转基因羊的研究奠定了基础。     

shRNA表达载体构建方法的优化

目的探讨shRNA表达载体的构建方法 ,以加速RNA干扰研究的进程。方法对shRNA表达载体的构建过程进行分析和监测 ,并加以优化。结果发现shRNA表达载体构建的退火过程容易产生障碍 ,经优化退火缓冲液的NaCl含量后 ,能明显提高退火效率及shRNA表达载体构建的成功率。结论shRNA表达载体构建的退火过程需加以关注 ,退火缓冲液中NaCl含量应提高至 2 0 0mmol/L以上为宜     

利用转hpRNA基因水稻抗水稻矮缩病毒

具有发夹结构的双链RNA(hairpin RNA,hpRNA)能高效诱导转录后基因沉默的发生.以水稻(Oryza sativaL.)矮缩病毒(RDV)基因组中第八片段编码区128～754 bp的序列为臂构建hpRNA,并克隆到植物表达载体pROK-2上.通过农杆菌介导的方法转化水稻"中花11".Southern blot分析表明,共获得12株阳性转化体.用带有RDV的叶蝉(Nephotettix cincticeps)接种Tl代转hpRNA水稻,结果表明转基因水稻对RDV具有高抗性或表现为症状延迟.而相同序列的有义链的转基因水稻和空载体的转基因水稻表现为典型的RDV侵染症状.HpRNA在转基因水稻中对RDV高抗性发挥重要作用.     

短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖

 以新城疫病毒（NDV）NP基因为标靶,构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA（shRNA）的质粒载体,在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡胚上进行了RNAi试验,筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1.用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect 将ndv1转染CEF,以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照,4 h后接种NDV,与对照相比,干涉组在病毒感染后3 h NP基因的表达量降低2.3倍,6 h 降低21.1倍,9 h降低9.8倍;ndv1能在48 h内完全阻断NDV在CEF中的增殖,延缓病变出现时间,减轻病变程度.将Silent-fect-ndv1混合物与NDV同时注入10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔,能使10⁵ ELD₅₀NDV感染后17 h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少94.4%,使10⁶ ELD₅₀NDV感染后17　h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少62.5%.实验结果证实,在CEF中存在RNAi机制,抑制NDV NP基因的表达能有效阻断该病毒增殖,说明NP基因在NDV复制过程中起重要作用.实验结果为进一步利用RNAi技术在CEF和鸡胚中研究病毒基因组功能及筛选抗病毒小分子奠定了基础.