植物细胞表面蛋白的研究 Ⅲ 烟草细胞表面蛋白的组分

用有机溶剂CM、Tris-HCl缓冲(pH7.5)的生理盐水(TS)和稀碱(AS)溶液分类分离烟草细胞表面蛋白,发现含有10％左右的CM蛋白,30％左右的TS蛋白,60％左右的AS蛋白和一些未经鉴定的碱不溶性物质(AIS)。 CM蛋白的紫外吸收光谱分析,在波长260 nm附近有一吸收峰,波长320 nm处有一个肩,Sephadex LH-20亲脂性柱层析可分离出四个组分,按其光谱特性可分成两大类。TS蛋白主要是一些水解酶,已测出的有过氧化物酶,酯酶、磷酸酶和腺甙三磷酸酶。AS蛋白在Sepharose 4B柱上可分离出两个洗脱峰,SDS-10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结果表明,主带分子量接近1.5×10~5道尔顿。 显微镜下观察TCSP及其用CM、TS和AS相继提取后的残存物形态,看到悬浮在无离子水中的TCSP表面密布黄色球形颗粒。CM提取后颗粒消失,出现比较平滑的表面。TS提取后残存物表面出现纹理结构和丝状物。AS提取后剩下的是一束束解开的纤维状物质。     

白皮松蛋白细胞中的ATP酶和酸性磷酸酯酶活性定位及其与季节变化的关系

本文报道白皮松茎次生韧皮部蛋白细胞中ATP酶和酸性磷酸酯酶的定位结果及其季节性变化。无论蛋白细胞发生在直立射线薄壁细胞中,还是横卧射线薄壁细胞或径向片薄壁细胞中,它们的ATP酶和酸性磷酸酯酶活性都显著地高于普通射线薄壁细胞。而且,与成熟筛胞联系的成熟蛋白细胞具有最为显著的ATP酶和酸性磷酸酯酶活性。蛋白细胞一旦解体,酶活性便急剧下降或消失。酶活性的表达贯穿春、夏、秋三季,以夏季最为显著。但是,两种酶在表达的时间和空间上有一定差异。作者认为,白皮松蛋白细胞中显著的ATP酶活性和酸性磷酸酯酶活性可能对韧皮部中碳水化合物的转运具有重要意义。     

巴豆油正丁酸对Raji细胞的联合诱导作用

以4mM正丁酸,400ng/ml巴豆油对Raji细胞进行联合激发,24小时后DNase活性及EA阳性细胞百分率均平行地急剧上升,72小时后达到高峰,以后EA阳性细胞急速下降,而DNase活性仍保持在高峰水平,粗酶液中的DNase活性能被EBV阳性血清中和90％以上。 激发Raji细胞粗酶液DEAE层析谱显示,有三个DNase活性峰,主峰洗脱浓度为220mM磷酸盐。检测了未激发及经激发(48小时)Raji细胞提取液的DNA多聚酶活性,前者能被50mM(NH_4)_2SO_4所抑制,抑制?原酶活性的23.3％,后者能被50mM(NH_4)_2SO_4所激活,激活为原酶活性的147.7％。     

以SecA为靶点的新型抗绿脓杆菌药物细胞水平筛选模型的建立和应用

Sec途径(即分泌途径secretion pathway)是蛋白质转运的主要途径.其中,最为关键的组分之一是SecAATP酶,是蛋白质转运途径中的"动力泵",通过ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜,在细菌中是不可缺少的.我们推测抑制SecAATP酶活性的化合物.必然会在一定程度上抑制蛋白质的转运和分泌.通过绿脓杆菌与大肠杆菌SecA蛋白的互补作用,利用本实验室构建的高效表达SecA蛋白的基因工程菌,建立了SecA蛋白ATP酶活性抑制剂的细胞水平筛选模型.利用所纯化的绿脓杆菌SecA蛋白的ATP酶活测定体系,验证了所建立的细胞水平筛选模型具有一定的特异性.研究结果表明其中两个酯相组分在细胞水平和蛋白水平均具有活性,值得进行深入的研究.     

生物膜能量偶联 ATP 酶的研究:鼠肝线粒体 ATP 酶(F_1)的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP 酶(F_1)在1MKCl-TEA 缓冲液(Tris-SO_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP 水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH 中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH 基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu 膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP 酶水解活力和对DCCD 的敏感性。     

生物膜能量偶联ATP酶的研究:鼠肝线粒体ATP酶(F_1)~*的解离和重组

纯化的鼠肝线粒体ATP酶(F_1)在1MKCl-TEA缓冲液(Tris-So_4~-,50mM;EDTA,1mM;ATP,2 mM;pH=7.6)中,2～3℃下处理40～90分钟丧失ATP水解活力,比活力从70～100下降到0.5～1.0。7%聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,随着酶活力的下降和F_1的电泳酶带的消失,在凝胶柱上出现三条F_1的解离蛋白带。解离后的F_1于30℃对TEA(pH5.7)介质透析脱盐能重新出现有活力的F_1,活力恢复到原来酶活力的19～22%,此种重组的F_1在pH中性偏碱条件下保持稳定。重组过程不需外加Mg~( )的促进和SH基的保护。重组的F_1与去F_1的Tu膜可重新结合,完全恢复原来线粒体内膜的ATP酶水解活力和对DCCD的敏感性。     

安宫牛黄丸药效组分对内毒素损伤小鼠脑组织ATP酶活性的影响

目的:观察安宫牛黄丸药效组分对内毒素损伤小鼠脑组织ATP酶活性的影响。方法:腹腔注射脂多糖制备内毒素损伤小鼠模型,利用比色方法测定安宫牛黄丸药效组分对模型小鼠脑组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的影响。结果:安宫牛黄丸药效组分可显著提高内毒素损伤小鼠脑组织Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,与安宫牛黄丸具有等效性。结论:安宫牛黄丸药效组分可使脑组织ATP酶活性升高,在安宫牛黄丸改善脑损伤、促清醒中发挥积极作用。     

Anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白靶向结合体外乳腺癌细胞表面受体的研究

为了研究不同表达系统获得的携带绿色荧光抗HER2单链抗体(Anti-HER2-ScFv-GFP)是否既可靶向结合HER2阳性乳腺癌细胞表面,也可通过观察绿色荧光变化直接判断抗体结合乳腺癌细胞表面后细胞的动态变化,在前期成功构建两种表达系统的基础上,利用Ni~(2+)-NTA亲和层析法纯化来源于真核表达系统pFAST Bac to Bac HT A/Tn-5B1-4和原核表达系统pBAD His B/TOP10的融合蛋白Anti-HER2-ScFv-GFP,设置HER2阳性细胞SKBR3为实验组、HER2阴性细胞MCF7为对照组,分别与之混合24 h后,1×PBS洗脱细胞3次,激光共聚焦显微镜观察到两种不同表达系统获得的融合蛋白在HER2阳性细胞SKBR3表面分布均有绿色荧光,真核表达的蛋白结合效率明显高于原核表达的蛋白,SKBR3结合高浓度的融合蛋白后细胞表现出皱缩,绿色荧光明显增强,而两种不同来源的融合蛋白与HER2阴性MCF7混合后均易被洗脱。GFP标准品与SKBR3混合后也容易被洗脱。实验表明构建的携带绿色荧光抗HER2单链抗体同时具有靶向结合和报告作用两方面的功能。     

猪传染性胃肠炎病毒重组核衣壳(N)蛋白的纯化

通过对大肠杆菌表达,经载体pPROEXHTb克隆的TGEV重组N蛋白纯化方法中一系列条件的探索,最终得到了纯化融合蛋白的最佳优化方法。即在裂解液中含有1mM PMSF的条件下,分别经过2倍体积的bufferA和bufferB洗脱后,再收集pH5．9,含有80mM咪唑的1倍体积bufferC洗脱液,在波长280nm处检测蛋白吸收值A,再将峰值经SDS－PAGE电泳分析,可得到纯度较高的融合蛋白。     

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。     

白皮松茎次生韧皮部中蛋白细胞的细胞化学研究

蛋白细胞是裸子植物次生韧皮部中唯一与筛胞发生单侧筛域联系的一类特殊的薄壁组织细胞,并且具有相当高的代谢潜势。本文在白皮松次生韧皮部蛋白细胞解剖学和细胞学研究的基础上进行了蛋白细胞中酸性磷酸酯酶和 ATP 酶的定位,首次报道成熟蛋白细胞中存在相当高的 ATP 酶活性的研究结果。     

一种纯化细菌有机磷水解酶的简便方法

Cibacron blue T_3GA与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联后,产生一种能有效地分离有机磷水解酶的吸附剂。用0.15mol/L MgCl_2溶液从黄杆菌P3—2细胞抽提出的粗酶液通过柱层析分离,即可得到纯化8倍、酶活性回收率为269.4％的纯酶制品。该酶制品用凝胶电泳测是均一的。     

NaCl及KCl对叶绿体膜上偶联因子腺三磷酶活力的调节

在不外加Mg~(2 )的条件下,激活液中加入30 mMNaCl或15 mM KCl,能促进叶绿体膜上偶联因子的腺三磷酶活力。其促进程度与叶绿素浓度、反应底物ATP浓度及DTT的存在有关。但此促进现象可被加入低浓度的EDTA所消除,NaCl及KCl可将叶绿体内含有的内源或结合态的Mg~(2 )释放出来,有活化腺三磷酶的作用。     

HeLa细胞端粒酶的分离纯化及其蛋白质组分的研究

根据端粒酶含有蛋白质组分和RNA组分的特点,采用寡核苷酸亲和纯化法从HeLa细胞蛋白粗提物中分离纯化人类端粒酶,纯化产物以TRAP法检测其延伸端粒活性,并采用RNA印迹法进行鉴定,然后从纯化产物中分离蛋白质组分,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其蛋白质亚基成分,可见到4种蛋白质亚基成分,与蛋白质分子质量标准比较,有两条位置接近212.2 ku,一条接近116.0 ku,一条接近42.7 ku.结果表明,蛋白质寡核苷酸亲和纯化法一步性分离纯化HeLa细胞端粒酶可得到端粒酶活性片段.     

白念珠菌翻译起始因子蛋白Ca-tif1的表达和纯化

本文构建了白色念珠菌体内翻译起始因子Ca-tif1的原核表达载体,纯化Ca-tif1蛋白,并测定其ATP酶活性。采用化学合成Ca-tif1序列片段,酶切并与p ET28a载体对应位点连接,连接后载体转化BL21感受态细胞,IPTG诱导Ca-tif1表达,用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白,并采用孔雀绿-磷钼酸分光光度法测定目的蛋白ATP酶活性。结果显示,根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化的重组质粒p ET-28a-Ca-tif1顺利表达可溶性的目的蛋白Ca-tif1,每升大肠杆菌表达产物经纯化后得到Ca-tif1 7.0 mg,纯化后的Ca-tif1具有ATP酶活性,1.25×106U/mg。通过成功构建白色念珠菌翻译起始因子Ca-tif1的原核表达载体p ET-28a-Ca-tif1,高效表达并纯化了Ca-tif1,经测定Ca-tif1具有ATP酶活性,为基于白色念珠菌翻译起始因子的一系列研究奠定了基础。     

大麦醇溶蛋白中高赖氨酸组分的溶解特性研究

脱脂的大麦粉经2次 NaCl 溶液和一次重蒸馏水提取盐溶和水溶蛋白后,用55％异丙醇提取醇溶蛋白。经 Sephadex G-100柱层析,用0.2％SDS 洗脱,得到的分子量为14000-20000道尔顿的峰2蛋白,称为大麦醇溶蛋白 A,其赖氨酸含量达2.6mol/100mol,溶解性试验结果表明这组含赖氨酸较高的蛋白确是一组醇溶性蛋白。     

燕麦根细胞质膜K+刺激ATP酶的纯化(英文)

Triton X-100加KI能够有效地溶解燕麦根细胞质膜上K~+刺激的ATP酶(张堃等1989)。对这种溶解的K~+刺激的ATP酶进行甘油梯度离心,得到了一些结果:1.在pH 7.5甘油梯度离心,溶解的ATP酶活性损失约85％,在pH 4.5时活性仅损失约50％,这表明低pH条件对于ATP酶活性稳定的重要性,2.使用水平转子进行甘油梯度离心效果较好;3.甘油梯度离心纯化的ATP酶经SDS-PAGE分析,85％以上的酶蛋白分子量为34kD的多肽。这一低分子量的具有K~+刺激的ATP酶活性的多肽与100kD左右的ATP酶(Serrano 1984)之间的关系有待进一步研究;4.经甘油梯度离心纯化后,K~+刺激的ATP酶活性占K~+,Mg~(2+)-ATP酶活性的52％;而溶解的ATP酶活性中,K~+刺激的部分仅为35％(表1)。此结果类似透析对溶解的ATP酶的影响(张堃等1989)。表明溶解的ATP酶制剂中K~+的存在掩盖了K~+对ATP酶的刺激作用。     

猪链球菌2型的表面蛋白烯醇化酶在细菌黏附和引发免疫下调中的作用

利用克隆表达获得了具有酶活性的猪链球菌2型(S.suis2)05ZYH33重组烯醇化酶(Enolase)蛋白。流式细胞术FCM的细胞定位发现Enolase可部分存在于S.suis205ZYH33细菌的表面。进而利用Hep2细胞探讨猪链球菌表面Enolase参与细菌对宿主细胞的黏附作用。免疫空斑试验的结果提示,Enolase可能作为一个免疫下调蛋白对于引发猪链球菌相关疾病发挥着重要的作用。     

利用S-层蛋白在细胞表面展示α-淀粉酶和金属硫蛋白

选用苏云金芽胞杆菌CTC菌株细胞表面S 层蛋白作为表面展示载体 ,利用其N 端信号肽以及锚定序列分别将不同生物特性的外源蛋白带到胞外并锚定在细胞的表面。为研究外源蛋白的分子量和生化特性对表面展示以及对其在细胞表面生物活性的影响 ,选用分子量较大的分泌性蛋白α 淀粉酶和富含半胱氨酸的非分泌性蛋白金属硫蛋白作为目标蛋白。将α 淀粉酶的结构基因 (amy)和金属硫蛋白的结构基因 (smtA)与S 层蛋白的锚定区slh结合 ,构建融合蛋白基因slh amy及slh smtA ,克隆至穿梭载体pHT30 4上 ,得到重组质粒pBMBSA 30 4和pBMBSM 30 4 ;转入带有帮助质粒的重组菌株BMB171 pBMB CSA中 ,得到新的重组菌株BMBSAC和BMBSMC。SDS PAGE显示融合蛋白SLH AMY和SLH SMTA在重组菌的表面得到了表达。利用锥虫蓝染色 打孔加膜法表明重组菌SAC的确具有表面酶活性 ,α 淀粉酶被固定在细胞表面。碘液法测定的数据表明重组菌SAC的菌悬液样品较之受体菌BMB171菌悬液样品酶活提高了 4 2 4 %。Ni NTA 琼脂糖微球吸附试验显示重组菌SMC能够被微球所吸附 ,证实SMTA在重组菌表面具有活性。对游离镉离子的吸附试验显示重组菌对镉离子的吸附能力是对照受体菌的 4倍。     

天麻发育过程中蛋白质、脂类及酶的组织化学定位初步观察

天麻胚内含有丰富的脂肪及总蛋白质,少量的碱性蛋白质,胚体萌动时还显示出明显的多酚氧化酶,酯酶及ATP酶的活性。在营养生长期,顶端分生组织,叶原基,维管束薄壁细胞,外皮层细胞以及大型维管柱细胞内含有丰富的总蛋白质,其分布与贮存多糖的分布相反。脂肪及碱性蛋白含量不明显。顶端分生组织,表皮层及维管束薄壁细胞内呈现出酸性磷酸酶,酯酶,ATP酶,多酚氧化酶及过氧化物酶较高的活性。开花期,球茎内这几种酶的活性均较高,在花序轴内ATP酶及过氧化物酶的活性比水解酶类的活性稍高些。球茎中央薄壁组织细胞由于贮存的多糖和蛋白质被逐渐消耗而形成空腔。果实成熟后,球茎内贮存的营养物质耗尽,酶类的活性显著下降。