自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达研究

目的:通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶(HRS或Jo-1)。方法:PCR扩增Jo-1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-Jo-1。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用SDS-PAGE和免疫酶斑点法鉴定。结果:PCR产物长约1500bp,与预期1526bp接近;pPIC9k-Jo-1重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库的报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物Jo-1的相对分子质量约55000,免疫酶斑点法证实表达产物具有天然Jo-1分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。结论:Jo-1在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功,为后续研究打下了基础。     

纤溶酶抑制剂textilinin-1在毕氏酵母的表达及应用

目的研究真核表达的textilinin-1蛋白纯化品对纤溶酶抑制作用。方法根据textilinin-1的天然氨基酸序列,按照毕氏酵母偏好密码子进行优化,合成textilinin-1基因,重组到pPICZα载体上,并转化至Pichia p.X-33菌种中,实现高效分泌表达,并进行重组textilinin-1活力单位的定义及小鼠断尾试验。结果通过高密度发酵及两步柱层析纯化,最终从10L发酵液中得到6g纯度达97.0%以上的重组textilinin-1。活性研究表明,重组textilinin-1对纤溶酶的活性具有抑制作用,并对tPA所致的小鼠出血倾向有一定的抑制作用。结论重组textilinin-1可抑制纤溶酶活性,并对纤溶性出血小鼠模型有止血作用,具有开发为止血药的潜力。     

人自身抗原SSA52的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立

人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题。通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法。采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SSA52。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究。结果显示,RT-PCR产物约为1 400 bp,与预期1 428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52的相对分子质量约52 kD。Western blot法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。DIGFA与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2%(120/126),阴性符合率为94.0%(47/50),总符合率为94.9%(167/176);两种方法检测结果无统计学显著差异(P>0.05)。说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用

本文介绍了来源于野生型石油酵母Y11430的巴斯德毕赤酵母的3种宿主菌的不同之处,并介绍了其甲醇诱导型基因AOX,同时说明了酵母菌体内微体对合成蛋白质的作用。从启动子类型、启动强弱、终止子及信号肽等方面对整合型载体做了详细的介绍。在外源蛋白表达方面,简要介绍了表达过程,重点讨论了如何防止外源蛋白降解,对影响毕赤酵母高效表达的因素做了扼要论述并提出了相应的解决方案。     

人Mn-SOD cDNA的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT-PCR扩增出人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)cDNA,将其插入含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组质粒pPIC9k-MnSOD,转化毕赤酵母GS115,筛选出整合了多拷贝hMn-SOD基因的Mut^ 表型菌株,摇瓶培养,0．5％甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中hMn-SOD的表达量约为上清总蛋白的32％,酶比活可达247、7u／mg。hMn-SOD在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌性表达。     

巴斯德毕赤酵母表达系统优化策略

巴斯德毕赤酵母 (Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ,Ｐｐ)表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。Ｐｐ的如下优点是促成此表达系统在近十几年里迅速发展和被广泛应用的重要原因 :Ｐｐ为单细胞真核生物 ,生长快 ,易于分子遗传学操作 ;Ｐｐ的醇氧化酶 1 (ＡｌｃｏｈｏｌＯｘｉｄａｓｅ 1 ,ＡＯＸ 1 )基因的启动子具有强诱导性和强启动性 ,适于外源基因的高水平诱导表达 ;Ｐｐ具有强烈的好氧生长偏爱性 ,可进行细胞高密度培养 ,利于大规模工业化生产 ;Ｐｐ可高水平分泌表达外源蛋白 ,纯化方便 ;Ｐｐ具有真核细胞的翻译后…     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达体系是近年发展起来的最为成功的真核表达体系。对巴斯德毕赤酵母表达系统及影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素进行了简要综述。     

基因工程抗体在巴斯德毕赤酵母中表达的研究进展

简述了运用巴斯德毕赤酵母系统表达基因工程抗体从构建载体到表达的一般过程,及如何改善和提高抗体的表达。侧重介绍运用该系统获得抗体高表达、高产量的研究近况。     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

人p53蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

将人ｐ５３ 基因装入 Ｐｉｃｈｉａ 分泌型质粒ｐ Ｈ Ｉ Ｌ Ｓ１ 中,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合,经筛选得到一高表达ｐ５３ 蛋白的克隆。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 显示表达量约占分泌总量的３０ ％ 。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 验证重组人ｐ５３ 存在免疫学活性。在诱导时就降低 Ｐｉｃｈｉａ 酵母系统水解酶活力等方面进行优化,经 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ 分离纯化得到约２００ ｍ ｇ／ Ｌ 表达量。     

人胰岛素在甲醇酵母Pichia pastoris中的分泌表达

将猪胰岛素前体基因和在其５’端引入９个氨基酸的间隔肽序列的ＰＩＰ基因插入到Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ的分泌表达质粒ｐＰＩＣ９中,得到分泌表达质粒ｐｐＩＣ９／ＰＩＰ和ｐＰＣ９／ｓｐ－ＰＩＰ７并用以转化ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５。用点杂交筛选,获得高拷贝转化Ｐ３９（－ｓｐ）和Ｓ５１（＋ｓｐ）。     

前列腺特异膜抗原在Pichia pastoris酵母中的表达及鉴定

前列腺特异膜抗原是一种具有高度前列腺特异性的糖蛋白 ,其表达的增高与肿瘤的术后复发、激素抵抗及较差的预后正相关 ,在前列腺癌的诊断和治疗中有广泛的应用前景 .从前列腺癌组织提取总RNA ,利用RT PCR技术获得PSMA基因的全长序列 ,构建了重组酵母表达载体pPIC3.5K PSMA .电击法转化Pichiapastoris酵母 ,通过表型筛选和PCR鉴定证实该基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .SDS PAGE显示 ,获得的PSMA蛋白分子量约 10 0kD ,表达产物经West ern印迹证实可特异地与PSMA单克隆抗体 4G5结合 .结果表明 ,成功地获得PSMA编码的cDNA并在酵母细胞中获得表达 .     

巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展

巴氏毕赤酵母表达系统具有真核生物表达的特点。本文综述了巴氏毕赤酵母菌及其表达载体的特点以及外源基因在该系统中表达存在的一些问题。     

人可溶性gp190在酵母Pichia pastoris中的表达

人可溶性gPl90(sgp190)是白血病抑制因子(LIF)的可溶性受体,可能在LIF行使众多生物学功能中扮演着重要的角色。为获得这一蛋白以研究它在人体内的生物学活性,在酵母Pichia pastoris中实现了重组sgp190分泌表达。利用基因重组技术,将编码人可溶性gP190(LlF受体α亚基gP190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgp190。原生质体法转染Pichia pastoris GS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgp190蛋白的毕赤酵母菌株GS115／pPIC9K-sgp190,sgp190蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的26％。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125kD,具有免疫活性。对sgp190体外活性分析表明它能够抑制LIF诱导滋养层细胞分泌hCG。     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的？…

将编码血管内皮细胞生长因子受体ＦＩｔ－１胞外区１－３ｌｏｏｐ３１６个氨基酸残基的ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ＦＩｔ＝１（１－３）,转化酵母景菌ＧＳ１１５,筛选Ｈｉｓ＾＋Ｍｕｔ＾ｓ表型转化子,经插瓶培养,１％甲醇诱导表达４ｄ后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,培养上清中ＦＩｔ－１（１－３）表达这总蛋白的３０－％