细菌的活的非可培养状态

在微生物生态学研究中已经知道并非自然界所有细菌都能用人工培养方法分离培养出来,尤其在水环境中,直接显微镜镜检计数细菌总数往往比常规培养法计数(包括平板法和MPN法)高许多倍,而导致这种现象的原因并不十分清楚。近年来,在对人类肠道病原细菌在水环境中的存活和生长规律研究中发现     

活的但非可培养(VBNC) 状态菌的研究进展

VBNC(viable but non-culturable)是指处于活的但非可培养状态的微生物,此微生物体的细胞仍有代谢活性,但用常规方法无法分离培养.本文阐述了VBNC状态菌的形成机理、转变与种类、复苏、研究意义及其应用展望.并报道了我们在十余年间针对生态环境中处于VBNC状态菌的复苏、可培养化、系统进化关系及潜在功能等方面的一些研究成果,拟为微生物资源的开发与应用提供新的科学依据.     

细菌VBNC态检测技术的研究进展

细菌在一些不良压力条件下会进入"活的非可培养状态"(viable but non-culturable,VBNC),其仍具有活力但不能采用常规的平板培养基进行培养,VBNC态细菌一旦培养条件适宜仍能继续生长繁殖,有些致病菌依旧具有毒力。如果检测方法不当,会造成假阳性或假阴性的结果,需要采取适合的检测方法进行检测。文章概述了几种检测VBNC态细菌的方法,如活菌直接计数法、核酸染料检测法、呼吸检测法、分子生物学法、免疫学法、流式细胞仪检测法等,并对检测方法的应用现状进行了评述。     

"活的非可培养状态"细菌荧光观察方法

目的：建立一套稳定、简便、快捷,可靠的细菌活的非可培养状态（VBNC）荧光显微镜观察方法。利用市售的黑色钢笔墨水着染微孔滤膜,然后采用手动压片方式,将经LIVE/DEAD BacLightTM Bacterial Viability Kit（13152）染色的细菌样本固定在滤膜上,用落射荧光显微镜直接观察。结果：该法所得的荧光图像背景无光亮且黑暗,菌体荧光、形态、排列等均清晰可见,而且呈现绿色荧光的活菌与呈现红色荧光的死菌较易分辨。与现行技术相比,还能缩短染色时间近12～16h。结论：建立的VBNC细菌荧光观察方法能有效地克服现有技术存在的适用范围狭窄、取材困难、观察结果不准确、操作时间长等缺点,可为细菌VBNC研究提供值得借鉴的方法。     

环境微生物可培养性影响因素及培养方法研究进展

目前,已知并能利用的微生物只是自然界微生物很小的缩影,过低的可培养效率使人类在认识和利用微生物上处于瓶颈阶段。现综述了微生物活的非可培养状态及其检测方法,阐述了微生物可培养性的影响因素,探讨了提高微生物可培养效率的培养策略和方法进展,以期为提高微生物的可培养性和菌种资源开发提供依据。     

一种新发现的细菌的特殊存活形式—活的非可培养状态

人类肠道细菌和病原细菌在海洋与河口环境中存活规律的研究,已经进行了约一个世纪。不同研究者得到的结果基本是一致的,即外来的人类肠道细菌和病原细菌不能在海洋环境中较长期地存活。但是,这个结论是使用常规培养法进行研究而得出来的,也就是当细菌随污水等途径排入海洋与河口环境中,或者在实验室内把细菌加入到一定盐度的模拟水体内进行存活实验,经过一段时间之后,不能再用常规培养法分离培养出这些细菌。人们推测影响人类肠道细菌和病原细菌在海洋     

自然界中处于VBNC状态微生物的研究进展

自然界中大约有90％以上的微生物尚未被分离鉴定。80年代初提出VBNC状态微生物的存在,所谓的VBNC是指微生物在自然界中生存的一种状态,本综述了在实验室条件下VBNC状态的形成条件、培养性的恢复及处于VBNC状态微生物的检测方法等方面的研究进展,并介绍了第一个微生物生长因子Rpf.     

细菌“活的不可培养状态”的生态意义及研究进展

"活的不可培养(VBNC)"状态是细菌在不良条件下的一种生存方式.VBNC状态作为细菌的一种生理状态,对传统微生物学产生了深远的影响.进入VBNC状态的细胞发生了一系列变化,无法继续用常规培养方法检测,在医学健康,环境科学等领域产生了巨大的影响,改进检测方法具有重要的意义.本文介绍了进入VBNC状态细菌在DNA、蛋白质组成等方面发生的变化,复苏过程.同时还介绍了VBNC状态的最新检测方法,最后对VBNC状态未来的研究方法进行了讨论.     

广西蚕沙细菌组成多样性解析和VBNC菌群的发掘

【目的】解析广西蚕沙中细菌群落组成与多样性,为蚕沙中菌种资源发掘和蚕沙的综合利用提供科学依据。【方法】通过高通量测序技术研究细菌群落组成特征,同时利用常规稀释涂布平板法和基于复苏促进因子(Rpf)的MPN培养系统解析并筛选蚕沙中可培养和活的非可培养(VBNC)状态的优势菌群,并经16SrRNA基因测序对筛选得到的菌株作初步分类鉴定。【结果】高通量测序表明,广西蚕沙样品中细菌归属于10个门、18个纲、27个目、57个科、96个属,其中4个属的丰度达1%以上,优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)肠杆菌属(Enterobacter);通过稀释涂布平板法共获得14个属的33株可培养细菌,其中4个属(Citrobacter、Weissella、Chitinophaga、Pseudoclavibacter)在高通量测序中未被检测到;而在MPN培养系统中,基于复苏促进因子的处理组细菌总数最大检出丰度提高了100倍,并从中共检出21株对Rpf敏感的VBNC菌株,其中6个属(Paenibacillus、Caulobacter、Roseomonas、Pantoea、Erwinia、Acine...     

氧化压力下沙门氏菌可培养性检测及其活的非可培养状态形成情况

【背景】氧化压力会导致细菌进入活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态,菌落形成能力可能受到亚致死损伤的影响。目前对于VBNC态细菌的定量检测是基于活菌数与可培养数的差值,因此可培养数的检测对于VBNC态定量研究很关键,培养基组成不合适可能会造成漏检。【目的】分析培养基组成对氧化压力下亚致死损伤细菌检测的重要影响;探究常见食源性致病菌肠炎沙门氏菌在氧化压力下形成VBNC态的情况。【方法】分别采用Luria-Bertani (LB)、beef peptone yeast (BPY)和Salmonella Shigella (SS)培养基检测并比较肠炎沙门氏菌的可培养数;采用RT-qPCR、荧光染色-激光共聚焦显微镜观测氧化压力下肠炎沙门氏菌形成VBNC态的情况。【结果】非选择性培养基LB和BPY能检出亚致死细菌,SS培养基中牛胆盐导致可培养数减少;肠炎沙门氏菌经53°C过氧化氢处理1.5 h后进入VBNC态的比例显著高于53°C过氧化氢+亚铁离子和过氧化氢+柠檬酸处理(P<0.05)。【结论】在对VBNC态的检测中应选择合适的固体培养基检测可...     

活的但非可培养功能菌群对多氯联苯降解的探索进展

活的但非可培养(“viable but non-culturable”,简称VBNC)状态是微生物应对各种环境压力的一种生存机制.面对日益严重的异生质污染问题,研究污染胁迫下VBNC状态菌的潜在环境功能具有重要意义.该文阐述了VBNC状态菌的研究现状,针对多氯联苯微生物降解存在的问题,重点介绍环境中潜在VBNC功能菌群的复苏培养.提出利用藤黄球菌(Micrococcus luteus)复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,简称Rpf)探索具有潜在多氯联苯降解功能的VBNC状态菌群,为多氯联苯高效降解菌群的筛选提供新思路.同时,结合VBNC状态菌絮凝、硝化除臭等方面的探索研究,对VBNC状态菌的潜在环境功能进行了展望.     

自然界中处于VBNC状态微生物的研究进展*

自然界中大约有 90 %以上的微生物尚未被分离鉴定。 80年代初提出VBNC状态微生物的存在 ,所谓的VBNC是指微生物在自然界中生存的一种状态 ,本文综述了在实验室条件下VBNC状态的形成条件、培养性的恢复及处于VBNC状态微生物的检测方法等方面的研究进展 ,并介绍了第一个微生物生长因子Rpf。     

PMA-qPCR法检测冷冻基质中非可培养状态(VBNC)副溶血性弧菌

【背景】副溶血性弧菌为冰鲜产品及肉制品中常见的污染微生物,致病性强,危害严重,出入境运输及加工的肉食品常采取冷冻冷藏的处理手段来防止微生物污染及生长,以保持食物新鲜。而残留的部分副溶血性弧菌会进入活的非可培养状态(Viable but non-culturable state,VBNC),从而构成潜在的风险隐患。【目的】建立可用于冷冻食品中VBNC副溶血性弧菌的快速检测方法,并探讨其适用性。【方法】将大西洋鲑鱼1:10匀浆,加入终浓度为6.6×10~5 CFU/mL的副溶血性弧菌,-20°C分别诱导10、20、30和50 d。建立实时荧光PCR技术(qPCR)方法,测定其特异性、灵敏度及稳定性。利用PMA-qPCR法对不同冷冻时期样品中的副溶血性弧菌进行检测,同时与qPCR、平板培养法进行比较。【结果】建立的qPCR方法特异性好,与其他阴性参考株无交叉反应;灵敏度高,检测限为19.8 CFU/mL;重复性好,C_q值的变异系数(CV)均在1.5%以下;标准曲线为y=-3.272x+45.310,线性回归系数R~2为0.996,定量范围为1×10~2–1×10~9 CFU/mL。在低温诱导10-50 d后,qPCR法的C_q值在26.32-27.34之间,与诱导前相比几乎没有变化;叠氮溴化丙锭(PMA)-qPCR法的C_q值则从诱导前的26.43逐步上升到38.84,呈现明显的上升趋势,表明死菌的数量在显著上升。经过比较及统计,PMA-qPCR检测的活菌数均高于平板培养法测出的数量,差异显著(P0.05)。【结论】PMA-qPCR特异性及灵敏度高,能有效抑制对死菌的扩增,同时能克服传统平板培养法对VBNC的漏检缺陷,可方便、快捷地用于冷冻食品中受损致病微生物,尤其是进入VBNC状态的细菌检测。     

活的不可培养的细菌的研究进展

活的不可培养微生物(VBNC)即一些微生物明显地丧失了可培养的特性,但是保留了自身原有的代谢活力,并且在一定条件下,又可以回复到可培养的状态。从VBNC细菌的诱导条件、生物学特性和检测方法3个方面对VBNC细菌研究进展做一综述。     

微生物在水环境中的存活和生长

在灭菌自来水模拟水体中,研究了7种细菌的存活和生长规律。Klebsiella pneumo-niae,Enterobacter aerogenes,Agrobacterium tumefatciens,在7天内平板计数降至0,而水体中镜检细菌总数(AODC)和活菌直接计数(DVC)结果无大变化,说明细菌已变成活的非可培养状态。Micrococcus,flavus 和 Streptococcus faecalis 的可培养菌数也可降至0。Pseudomonas sp.在48小时内由10~5降至10~2cfu/ml,随即升至10~6 cfu/ml 并持续到实验终了(41天)。Bacillus subtilis 在48小时平板计数降至10~2cfu/ml 并维持在该水平至实验结束(38天)。研究结果表明仅用涂布平板法检测多种细菌在水环境中的生存和分布是不合适的。     

北欧海海水可培养细菌多样性

【目的】为了解北欧海表层海水可培养细菌多样性与所在水文环境的关系。【方法】利用2216E、R2A和海水培养基对该海域暖流区、寒流区、海盆区及交汇区等多个区域不同站位的表层海水样品中的可培养细菌进行分离培养,通过16S r RNA基因测序对分离的菌株进行分类鉴定,并构建系统发育树进行系统发育分析。【结果】从北欧海表层海水中共分离到407株细菌,通过RFLP分析选取其中154株进行测序,结果表明此154株细菌分属于3个门,18个属,27个种。3个门包括变形菌门、厚壁菌门和放线菌门,优势属为假交替单胞菌属、嗜冷杆菌属等,优势种为食琼脂假交替单胞菌、海雪嗜冷杆菌等,并分离到闪烁交替单胞菌等多株嗜冷菌。比较不同区域的微生物多样性可以看出,γ-变形菌纲的细菌在各个区域均占较高比例。交汇区的细菌多样性最高,分离到了10个不同属的细菌,而海盆区细菌多样性最低,只分离到了4种。除了海盆区外,其他3个区域的样品中都分离到了特有的类群。【结论】从以上结果可以看出,北欧海域有较为丰富的微生物资源,且交汇区微生物多样性较其他区域高。     

低温寡营养条件下副溶血弧菌形成活的非可培养状态及其复苏研究

为研究在低温寡营养条件下副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能否进入活的非可培养状态(VBNC),将浓度为1×1010CFU/mL的副溶血弧菌HW799在陈海水中4℃保存,每隔5天取样分别用吖啶橙染色荧光显微镜直接计数法(AODC)、活菌直接计数法(DVC)和涂布平板法(PC)测定细菌总数、活细菌数和可培养细菌数.在第30天时总细菌数基本不变,仍保持在109CFU/mL,活菌数为106CFU/mL,比总菌数低了约三个数量级,可培养细菌数为零,表明绝大部分副溶血弧菌HW799进入了VBNC状态;用扫描电镜、流式细胞仪对副溶血弧菌HW799活的非可培养状态、正常状态以及复苏后的细胞形态的研究表明进入VBNC状态后副溶血弧菌HW799形状变为球状,体积比正常状态明显变小,活细胞数也略有减少;采用在培养液中添加营养物质升温培养的方法,使VBNC状态的副溶血弧菌细胞在48h内复苏为可培养状态,复苏后的副溶血弧菌HW799与正常状态的细菌形态相似.     

致病微生物应对环境胁迫形成的VBNC状态及其对风险评估的潜在影响

防止食源性致病菌对食品的污染是保障食品安全的重要策略之一。研究表明,环境胁迫下微生物可能形成"活的不可培养状态"(VBNC状态),成为食品安全的潜在风险。本文对致病微生物VBNC状态的最近发现进行了归纳和总结,重点分析了不同环境胁迫(包括自然胁迫以及食品加工和保藏过程中的各种胁迫等)因素下菌体进入VBNC状态的普遍性、诱导条件和生理特点等,并对现行的基于微生物可培养性而建立起来的常规检测方法的局限性及其对食品安全风险评估潜在影响进行了讨论。     

紫色非硫细菌固体石蜡双层平板培养法

紫色非硫细菌是一类不产氧光合细菌,具有重要的生态学意义和应用价值。建立固体石蜡双层平板法,与传统的培养法相比较,发现该方法可以更方便、更快捷地计数和分离紫色非硫细菌。结合分子生物学技术,将该方法应用于水稻土紫色非硫细菌的研究,发现以甲酸为碳源的固体石蜡双层平板法可以很好地对环境中可培养的紫色非硫细菌多样性进行研究。该方法的建立将更有助于紫色非硫细菌的研究。     

松口蘑(Tricholoma matsutake)菌塘土壤可培养细菌多样性

松口蘑(Tricholoma matsutake)也称松茸,是具有重要经济和药用价值的野生食用菌,菌塘是其子实体发生发育的场所。本文采用土壤平板稀释技术研究了云南省6份松口蘑菌塘土壤可培养细菌,共获得了178条细菌的16S r DNA碱基序列,经分析分别属于4个门、18个属、38个OTUs,变形菌门(Proteobacteria)序列占58.43%,厚壁菌门(Firmicutes)占26.40%,拟杆菌门(Bacteroidetes)占10.67%,放线菌门(Actinobacteria)占4.49%,其中厚壁菌门的芽孢杆菌属(Bacillus)占24.72%,变形菌门的伯克氏菌属(Burkholderia)占21.34%,假单胞菌属(Pseudomonas)占11.24%,拟杆菌门的金黄杆菌属(Chryseobacterium)占10.67%。云南松口蘑菌塘土壤可培养细菌的多样性较为丰富。