豆豉中高产乳酸乳酸菌的筛选及其产酸条件的优化研究

目的 从云南传统发酵豆豉中分离并筛选得到一株高产乳酸的乳酸菌菌株,并对其产酸培养基组成及条件进行优化探讨.方法 运用紫外分光光度法,对豆豉由来高产有机酸菌株YM-4-3的碳源进行优化.结果 分子生物学鉴定结果表明该乳酸菌菌株属于植物乳杆菌,并将之命名为Lactobacillus plantarum YM-4-3,碳源优化结果表明,乳糖是L.plantarum YM-4-3 菌株生物合成乳酸的最佳碳源,而果糖则是最利于各种主要有机酸合成的碳源,由于此时各常见有机酸的含量均高于其他碳源时的含量,且其总酸含量高达9696.32 mg/L.结论 云南传统发酵豆豉可以成为功能性乳酸菌筛选的菌种资源库,所分离得到的L plantarum YM-4-3产酸能力较强,它可被应用于有机酸发酵及豆豉发酵的酸化处理.     

一株重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建及其高效生产γ-氨基丁酸转化条件的优化

为实现微生物法高效率生产γ-氨基丁酸(GABA),从一株经多次诱变筛选的具有较高谷氨酸脱羧酶(GAD)活力植物乳杆菌GB 01-21全基因组DNA中PCR扩增获得GAD酶基因lpgad,构建重组质粒pET-28a-lpgad,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中高效诱导表达。并采用Ni柱亲和层析纯化获得重组GAD,并对其酶学性质进行初步研究,为改良转化工艺提高GABA产量提供可靠理论依据。结果显示,重组大肠杆菌中GAD酶活显著提高,可达8.53 U/mg,是植物乳杆菌GB 01-21中GAD酶活的4.24倍。将该重组菌应用于转化L-谷氨酸生产GABA,5 L发酵罐水平转化24 h产量可达143.5 g/L,摩尔转化率为97.32%,是植物乳杆菌GB 01-21的2.19倍。纯化后酶学性质进行初步研究表明:其最适pH为4.8;最适温度为37℃;Ca2+、Mg2+对其有较强的激活作用,将上述实验结果用于转化条件的优化,最终5 L发酵罐上进行转化实验,批次添加底物L-谷氨酸共600 g,转化24 h,GABA累计浓度可达204.5 g/L,摩尔转化率为97.92%,与最初转化条件相比,GABA浓度提高了42.5%,为其工业化应用打下了良好的基础。     

产γ-氨基丁酸屎肠球菌的鉴定及其谷氨酸脱羧酶酶学性质

目的:鉴定1株产γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的乳酸菌HS3,并研究了其谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)粗酶酶学性质。方法:根据形态培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对及系统发育分析对菌株HS3进行了鉴定。采用菌体细胞破碎后的粗酶液,研究了温度、pH和金属离子对酶活的影响。结果:菌株HS3的形态培养和生理生化特征符合肠球菌属(Enterococcus)特征,其16S rDNA序列与Enterococcus faecium(EU717962)16S rDNA序列同源性达99%,鉴定菌株HS3为屎肠球菌(Enterococcus faecium),菌株HS3 GAD最适作用温度为40℃,最适作用pH4.5。酶的热稳定较好,50℃处理4h,在pH3.5～6.0酶活基本稳定。Ca2+对酶有激活作用,5mmol/L和50mmol/L浓度酶活分别提高了37.41%和17.43%。Ba2+和Zn2+在5mmol/L浓度时激活作用明显,而Mg2+在5mmol/L浓度激活作用较好。结论:菌株HS3的GAD活力较高,稳定性较好,为生物合成GABA提供了新的微生物菌种资源。     

爱尔兰帚霉产低温纤维素酶的酶学性质和发酵工艺

本文旨在对爱尔兰帚霉E71702M菌株产低温纤维素酶的酶学性质进行初步研究,并获得其最优发酵条件,为低温纤维素酶开发利用提供参考。通过单因素试验确定温度、pH及金属离子对纤维素酶活力的影响;以Plackett-Burman试验设计从8个培养条件中筛选出影响产酶的3个主要因素,即麸皮含量、装瓶量和起始pH;运用Box-Behnken试验设计及响应面分析法确定这3个主要因素的最优发酵条件。对酶学性质的初步研究表明,该酶最适pH为3.0,最适反应温度为30℃,在0℃时残余酶活力为最适反应温度时的56.3%。响应面分析得到最优发酵条件为:麸皮含量8.79g/L、装瓶量40.93m L、初始pH 4.01。通过优化,纤维素酶活力由0.6338IU/m L提高到1.7386IU/m L,提高了174%。     

云南传统发酵豆豉中产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及其产酶条件的研究

目的从云南豆豉样品中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌,并对其产酶条件进行研究。方法从云南省元阳、红河、建水、石屏等地采集豆豉样品,并从中分离得到355株微生物。结果经明胶诱导、脱脂乳平板实验,复筛得到87株蛋白酶产生菌,从中筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌。通过X-Gal平板实验,共获得34株产β-半乳糖苷酶菌株,通过酶活测定,最终筛选得到1株高产β-半乳糖苷酶菌株GJ-1-3L,经16S rDNA序列分析鉴定为短乳杆菌;GJ-1-3L在以葡萄糖为碳源、多聚蛋白胨为氮源、起始pH 6.5的MRS培养基中,接种量为4%,35℃发酵培养12 h,其β-半乳糖苷酶活性高达6.73 U/mL,Cu2＋、Ba2＋对酶活有抑制作用,而K2HPO4、MgSO4则能促进酶活。结论 GJ-1-3L菌株来源于豆豉,能够产生β-半乳糖苷酶发酵乳糖,同时产生乳酸,其在食品与乳品加工等方面具有很好的应用前景。     

链霉菌产木聚糖酶条件和酶学性质以及重离子诱变对产酶的影响研究

以一株由青藏高原牦牛粪中分离出的链霉菌为出发菌株,对其培养特性、产酶条件和酶学性质进行初步研究.通过重离子诱变,筛选出遗传稳定的高产菌株.结果表明,该菌以玉米芯和麸皮(1∶1)为碳源能高效地诱导木聚糖酶的胞外分泌,其最适培养基和培养条件氮源为酵母膏、初始pH7、培养温度为25℃,在此条件下,第4天酶活力达到峰值3480.25 U/mL.说明该酶能够利用农业废弃物高效生产木聚糖酶.该菌株所产木聚糖酶的最适反应温度为15℃、pH4,属低温酸性木聚糖酶.经重离子诱变后,筛选出一株高产菌株SZ10-7,其酶活力可达5 338.42 U/mL.     

产木聚糖酶芽胞菌Y-12的筛选及产酶条件的研究

利用透明圈平板培养和木聚糖发酵试验,筛选出1株高产木聚糖酶的芽胞杆菌,并对该菌株的酶学特性和适宜发酵条件进行研究。结果表明,此菌对秸秆和麦麸的分解率分别为43.3%和63.4%。产酶较高的最适培养条件,即大豆蛋白胨2%、胰蛋白胨3%、酵母粉0.1%和葡萄糖2%。适宜反应温度和pH分别为37℃和7。采用10 L发酵罐发酵,培养48 h后,酶活达3024 U/m l,比三角瓶发酵(酶活达2185 U/m l)提高了38%。     

高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究

筛选到1株菊粉酶高产克鲁维酵母菌株,采用酵母高密度细胞发酵方法,最高菊粉酶产量达到288.78u/mL,比80～90年代国际上报道的克鲁维酵母菊粉酶最高产量高6.8倍。该酶的菊粉酶/转化酶活性比为1/24.72;菊糖m=13.3mmol/L,蔗糖Km=62.6mmol/L;最适反应pH值为4.4,但在pH3.8～5.6的范围内均保持了较高的活性,相当于最适pH值下活性的90%;最适反应温度为55℃,在50～575℃范围内能够保持较高活性,50℃下酶的半衰期约为16h;外加Mg2+提高酶活性11.28%。     

低温脂肪酶的产酶条件优化及其酶学性质

利用单因素筛选和正交试验对Burkholderia sp. SYBC LIP-Y发酵产酶的液体培养基和发酵条件进行了优化,其优化配方为：可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏15 g/L、NaNO3 0.252 g/L、橄榄油40ml/L、Triton x-100 10ml/L、初始pH 7.5、接种量10%(V/V),脂肪酶酶活达到85.23U/ml,是优化前的3.63倍。通过对双水相纯化得到的脂肪酶进行酶学性质研究,确定该酶反应的最适pH为10.0,最适温度为30℃,40℃下保温60min酶活性还有80%以上,该脂肪酶为低温脂肪酶,热稳定性好,具有一定的耐醇性,应用前景广阔。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究

研究黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶学特性,采用酶学研究方法,通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100纯化了β-葡萄糖苷酶,并进行了黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及米氏常数等特性研究,采用SDS-PAGE凝胶电泳测定了分子量。研究表明,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为70℃、最适反应pH为4.5;在40、50和60℃下较稳定,80℃以上稳定性差;β-葡萄糖苷酶在pH为3、7、8、9的缓冲液中的稳定性很差,在pH为4、5、6的缓冲液中稳定性较好,其中在pH为5时,稳定性最好;酶的Km=41.67 mmol/L,Vmax=23.81 U/L;其分子量为65.2 ku。β-葡萄糖苷酶在饲料工业具有良好的应用前景。     

耐酸性黑曲霉β-甘露聚糖酶的克隆及其在毕赤酵母中的表达分析

目的:克隆黑曲霉β-甘露聚糖酶基因,研究该基因在毕赤酵母中的表达情况。方法:运用RT-PCR从黑曲霉AN070902中克隆β-甘露聚糖酶cDNA片段,与载体pPIC9K相连,构建重组载体VMAN-pPIC9K,电转化毕赤酵母GS115,筛选产酶最高菌株进行5 L液体发酵,对该菌株所产重组酶进行酶学性质分析。结果:克隆获得1152 bpcDNA,编码由383个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质属于GH5家族,理论pI和相对分子质量分别为4.48和41.6×103;筛选获得的重组菌株VMAN-pPIC9K-GS115在5 L液体发酵中上清酶活达11 785 U/mL;表达的重组酶是一种酸性β-甘露聚糖酶,最适反应pH值为3.0,经pH2.0～9.0处理2 h后剩余酶活保持90%以上;该重组酶最适反应温度为65℃,70℃处理1 h后剩余酶活保持75%以上;该重组酶活性被1 mmol/L的Fe3+和Mn2+显著抑制,被1mmol/L的Co2+显著激活。结论:重组耐酸性β-甘露聚糖酶的特性,决定了其在工业生产中,特别是动物饲料和食品加工中具有应用价值。     

酸菜中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选

从酸菜中筛选到2株相对高产γ-氨基丁酸的乳酸菌(GABA)菌株,酸菜1号和酸菜3号。酸菜1号初步鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum);酸菜3号初步鉴定为乳酸链球菌(Streptococcus lactis)。实验还对酸菜1号菌株的培养基和培养条件进行了优化:用蔗糖为碳源、蛋白胨和牛肉膏作为复合氮源、培养基初始pH为6.0、培养温度为30~34℃时该菌株发酵产GABA的量最多,发酵过程中的振荡培养(100 r/min)和静置培养对GABA的产量无明显影响;在最佳培养基组合和发酵条件下,发酵液中GABA含量可达4 g/L以上,表明利用乳酸菌进行富含GABA食品的生产是可行的。     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

一株产胆固醇氧化酶的不动杆菌的筛选鉴定及特性研究

目的：筛选鉴定产胆固醇氧化酶的菌株并对其酶的性质及发酵条件进行初步的研究。方法：利用唯一碳源的胆固醇平板筛选,酶活测定比较得酶活力最高的菌株;生理生化试验结合16S rDNA序列分析鉴定其种属,单因素及正交实验优化培养基及发酵条件。结果：所得菌株H4与产不动杆菌（Acinetobacter）有最近的亲缘关系,其胆固醇氧化酶作用的最适温度和pH分别为37℃和8.0,金属离子Mg2＋、Zn2＋、Fe2＋对该酶具有一定激活作用,菌株产酶的最适培养基为（g/L）：胆固醇1.5,蔗糖5,蛋白胨7,硝酸铵3,吐温1.0,pH7.5;最适培养条件为33℃,15mL培养基/100mL三角瓶,摇床培养（200r/min）48h,优化后发酵液酶活达135.8U/L。结论：获得了1株产胆固醇氧化酶的菌株H4,并初步鉴定为不动杆菌（Acinetobacter）。     

α-葡萄糖苷酶高产菌株HB-9-5的选育及产酶条件的优化

从土壤中筛选出一株高产α-葡萄糖苷酶的细菌HB-09-5,对其粗酶液进行研究发现,最适反应pH为6.0,最适反应温度为50℃,pH在4.0-7.0,温度在55℃以下保持酶活力相对稳定。通过对产酶条件进行优化,单因素试验表明,最佳碳源为可溶性淀粉,最佳氮源为牛肉膏,Mg2+和Ca2+对产酶有促进作用。优化发酵条件后,菌株HB-09-5产酶水平可达到20.95U/mL,比出发菌酶活提高了2.3倍。     

产壳聚糖酶菌株的筛选、鉴定及酶学特性分析

【目的】利用筛选培养基,从福建沿海潮间带泥样中分离筛选产壳聚糖酶的菌株,并研究菌株的产酶特性。【方法】通过形态学观察,结合26S rDNA序列进行分类鉴定,采用DNS法测定酶活力。【结果】筛选得到产壳聚糖酶的菌株KQ-1002与草酸青霉(Penicillium oxalicum)的同源性为99%,并初步鉴定为青霉属的一种。发酵培养的最适温度为30°C,最适碳源为1.0%水溶性壳聚糖,最适氮源为1.87%(NH4)2SO4,最适pH为6.0。该菌株液体发酵培养72 h产壳聚糖酶活性最高,经优化后最高产酶量为18 U/mL。纯化后的壳聚糖酶经SDS-PAGE分析其分子量约40 kD。酶促反应最适pH为5.0,最适反应温度为55°C,Km值为1.293 g/L。在离子浓度为1.0×10 3mol/L时,金属离子Cu2+、Hg2+、Ag+对酶的活性均有强烈的抑制作用。壳聚糖酶对不同底物及脱乙酰度的壳聚糖具有不同的降解作用。【结论】筛选获得产壳聚糖酶的真菌菌株KQ-1002的壳聚糖酶活力经优化后提高了约7倍,是一株具有研究和应用潜力的产壳聚糖酶菌株。     

高产耐高温脂肪酶生产菌的筛选与鉴定

从小笼包蒸屉垫中筛选得到了两株脂肪酶高产菌株J2和J3,经形态观察以及26S rRNA基因(26S rDNA)序列比对鉴定,两株菌分别属于Aureobasidium属的两个变体。200 r/min、30℃下摇瓶发酵3-5 d后,以对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)作为底物,用分光光度法测得J2和J3发酵上清液中的脂肪酶酶活分别为10.61 U/m L和14.43 U/m L。对两株菌所产脂肪酶的耐热特性研究显示,菌株J2产脂肪酶的最适反应温度为50℃,并且酶液在50℃保温5 h无酶活损失;另一株菌J3所产脂肪酶的最适反应温度为60℃,酶液在50℃保温5 h后酶活剩余42.19%,在40℃保温5 h没有酶活损失。这表明J2和J3菌株所产脂肪酶具有较好的热稳定性和较高的最适反应温度。     

高产(+)γ-内酰胺酶菌株的筛选与发酵产酶研究

从土壤中筛选获得高产(+)γ-内酰胺酶的微生物菌株,并鉴定和保藏为Delftia sp.CGMCC No.5755.对该Delfiia sp菌株的发酵产酶条件进行了研究,结果表明,最适发酵培养基为:蔗糖30 g/L,蛋白胨30 g/L,牛肉膏25 g/L,乙酰胺5 g/L,MgS04 1 g/L;最适发酵温度及初始pH分别为32℃和pH 7.0.该菌株在上述条件下发酵培养20 h,菌体生物量为16.0 g/L,(+)γ-内酰胺酶的酶活为692 U/L.采用Delftia sp.静息细胞对100 g/L的外消旋底物2-氮杂二环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(简称(±)γ-内酰胺)的水解拆分反应中,产物(-)γ-内酰胺光学纯度大于99.9％e.e.,转化率为53.7％.研究为生物催化法高效制备光学纯(+)γ-内酰胺提供了可行的途径.     

高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析

从徂徕山温泉附近土样中分离到9株产高温蛋白酶菌株,选取一株碱性蛋白酶高产菌株L7为出发菌株,进行显微形态、16S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为短芽孢杆菌(Brevibacillus sp.)。研究该菌株发酵条件,确定产酶的最佳培养基组成为葡萄糖40 g/L,蛋白胨20 g/L,磷酸氢二钠1.4 g/L,氯化钙0.6 g/L,硫酸镁0.4 g/L,通过培养基优化,酶活达到103.08 U/mL。最佳培养条件为250 mL三角烧瓶中装液量50 mL、pH8.0、培养温度为55℃、培养时间为24 h。对该菌株酶学性质研究,L7菌株所产高温蛋白酶的最适温度为55℃,最适pH为10,并且具有良好的温度稳定性和pH稳定性,酶活性受PMSF强烈抑制。     

金龟子绿僵菌固态发酵产壳聚糖酶

对金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）AS3．4606产壳聚糖酶进行了固态发酵条件优化及酶学部分特征的研究。正交实验结果表明,以麸皮为碳源,日本根霉菌丝体粉末为氮源,在起始pH5．0,m（碳）：m（氨）为1：4,m（干重）：m（液体）为1：1．4,27℃下培养120h,壳聚糖酶活性可达35．08U／g（干培养基）。粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,酶在pH5．0～6．0条件下稳定性最高。该酶不能水解固体甲壳素和纤维素粉末,最适底物为胶体壳聚糖。