DGGE/TGGE技术在土壤微生物分子生态学研究中的应用

传统的微生物生态学研究方法只限于环境样品中极少部分(0.1%￣1%)可培养的微生物类群,极大程度地限制了对土壤微生物群落结构的研究。综述了以16S rDNA为主要研究对象的DGGE/TGGE(Denaturing gradientgel electrophoresis,DGGE/Temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)技术原理,以其为主要手段结合PCR扩增、克隆建库、序列测定以及种系分析对土壤微生物的群落结构和多样性研究的最新动态。DGGE/TGGE技术极大地推动了土壤微生物分子生态学的发展,同时也为实际问题的诊断、作物生长跟踪监测等提供了技术支撑,在土壤微生物分子生态学研究和生产实践中起着越来越重要的作用。     

微生物分子生态学研究方法及其存在的缺陷

微生物群落多样性是微生物生态学和环境学研究的重点之一.分子生物学方法应用于微生物群落结构分析使得对环境样品中占大多数的不可培养微生物的研究成为了可能.然而,PCR过程中的偏差(bias)会引起结果并不能如实地再现原始的群落结构,随着多个宏基因组项目的研究,发现所谓的“通用引物”并不能覆盖全部的微生物类型,即使可以添加简并碱基,也无法与通过宏基因组得到的rRNA序列完全匹配,这导致了在诸多研究中会忽略环境中的微生物群落.即使是不经过PCR扩增的元基因组和元转录组学研究方法,对于分子微生物群落也存在着一定的问题.     

16S rRNA基因在微生物生态学中的应用

16S rRNA(Small subunit ribosomal RNA)基因是对原核微生物进行系统进化分类研究时最常用的分子标志物(Biomarker),广泛应用于微生物生态学研究中。近些年来随着高通量测序技术及数据分析方法等的不断进步,大量基于16S rRNA基因的研究使得微生物生态学得到了快速发展,然而使用16S rRNA基因作为分子标志物时也存在诸多问题,比如水平基因转移、多拷贝的异质性、基因扩增效率的差异、数据分析方法的选择等,这些问题影响了微生物群落组成和多样性分析时的准确性。对当前使用16S rRNA基因分析微生物群落组成和多样性的进展情况做一总结,重点讨论当前存在的主要问题以及各种分析方法的发展,尤其是与高通量测序技术有关的实验和数据处理问题。     

生物技术在分子微生物生态学上的应用

分子生物学及其技术的发展和变革开辟了生态学研究的新途径。分子生物学与生态学交叉的研究,越来越引起人们的重视,于是分子生态学便应运而生了。而分子微生物生态学则为其中的重要分支,它是运用分子的方法和技术,在基因水平上估计种的个体丰度,查明种的变异情况以及探究群落中微生物间相互关系的科学。生物技术的应用,使我们不必培养微生物,而直接通过对环境中的遗传物质的研究来达到目的,它为微生物生态学的研究开辟了新的途径。１用于分子微生物生态学的主要生物技术１．１核酸探针检测技术探针是能与特定核苷酸序列发生特异性互…     

变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学中的应用

由于从环境样品中分离和培养细菌的困难,分子生物学方法已发展用来描述和鉴定微生物群落。近年来基于DNA方法的群落分析得到了迅速的发展,如PCR扩增技术,克隆文库法,荧光原位杂交法,限制性酶切片段长度多态性法,变性和温度梯度凝胶电泳法。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌,古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品。具有可重复和容易操作等特点,适合于调查种群的时空变化,并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员。DGGE分析微生物群落的一般步骤如下：一是核酸的提取,二是16S rRNA,18S rRNA或功能基因如可容性甲烷加单氧酶羟化酶基因(mmoX)和氨加单氧酶a一亚单位基因(amoA)片段的扩增,三是通过DGGE分析PCR产物。DGGE使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶,该凝胶能够有区别的解链PCR扩增产物。由PCR产生的不同的DNA片段长度相同但核苷酸序列不同。因此不同的双链DNA片段由于沿着化学梯度的不同解链行为将在凝胶的不同位置上停止迁移。DNA解链行为的不同导致一个凝胶带图案,该图案是微生物群落中主要种类的一个轮廓。DGGE使用所有生物中保守的基因片段如细菌中的16S rRNA基因片段和真菌中的18S rRNA基因片段。然而同其他分子生物学方法一样,DGGE也有缺陷,其中之一是只能分离较小的片段,使用于系统发育分析比较和探针设计的序列信息量受到了限制。在某些情况下,由于所用基因的多拷贝导致一个种类多于一条带,因此不易鉴定群落结构到种的水平。此外,该技术具有内在的如单一细菌种类16S rDNA拷贝之间的异质性问题,可导致自然群落中微生物数量的过多估计。DGGE是分析微生物群落的一种有力的工具。不过为了减少DGGE和其它技术的缺陷,建议研究者结合DGGE和其它分子及微生物学方法以便更详细的观察微生物的群落结构和功能。     

油藏微生物多样性的分子生态学研究进展

油藏微生物是一类宝贵的资源, 在油层生态系统的物质循环和能量流动中发挥着主导作用。传统上, 主要依赖纯培养技术, 使得大部分油藏微生物都没能得到充分认识。分子方法克服了纯培养方法中遇到的问题, 能更好地了解环境微生物群落多样性。近年来, 在油藏微生物群落多样性研究中的应用进展迅速, 对油藏微生物学和生态学的发展产生了重要影响。文中评述了近年来国内外在油藏微生物分子生态方面的研究进展, 并对进一步的研究提出了展望。     

油藏微生物多样性的分子生态学研究进展

油藏微生物是一类宝贵的资源,在油层生态系统的物质循环和能量流动中发着主导作用.传统上,主要依赖纯培养技术,使得大部分油藏微生物都没能得到充分认识.分子方法克服了纯培养方法中遇到的问题,能更好地了解环境微生物群落多样性.近年来,在油藏微生物群落多样性研究中的应用进展迅速,对油藏微生物学和生态学的发展产生了重要影响.文中评述了近年来国内外在油藏微生物分子生态方面的研究进展,并对进一步的研究提出了展望.     

MAR-FISH技术及其在环境微生物群落与功能研究中的应用

对复杂环境中微生物群落结构和功能的研究是微生物生态学的重要任务。尽管现代分子生物学技术已经成功地用于解析环境中微生物的群落结构, 但是这些方法并不能提供微生物的原位生理学信息。而一种新的方法, 微观放射自显影和荧光原位杂交集成技术(MAR-FISH)则能够同时在单细胞水平上, 检测复杂环境中微生物的系统发育信息及其生理特性。本文总结了MAR-FISH方法的原理, 实验步骤及其在环境微生物群落与功能研究中的应用。     

应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是通过核酸片段对微生物群落进行研究,可以监测未培养细菌及其功能基因,被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析,并成为微生物分子生态学研究中的重要手段之一。文中论述了DGGE操作过程中遇到的常见问题,并提出了相应的解决方法。全面分析了样品预处理过程和PCR扩增效果对DGGE分析的影响,探讨了DGGE图谱的优化过程和图谱分析方法,并对DGGE的应用前景进行了综述。     

微生物生态学研究方法的新进展

微生物生态学是研究微生物群体与其周围的生物和非生物环境条件相互作用关系的科学。近些年 ,在此领域的方法学上有许多新的进展。通过各种荧光染料对微生物进行直接染色或定量 PCR的方法可进行微生物现存量的研究。测定整个群落的碱基组成和 DNA的复杂性或者自然环境样品中直接扩增的 16 Sr DNA的分析可估计出总的群落的遗传结构及其复杂性。在单个细胞水平上分析微生物群落结构多是采用 FISH(荧光原位杂交 )的方法。     

汾河入黄口夏季微生物群落结构分析

【背景】河流交汇区日益成为流域生态治理的焦点和热点之一。【目的】探明汾河入黄口微生物群落结构及其主要环境影响因子。【方法】应用16S rRNA基因Illumina MiSeq高通量测序技术,分析了汾河入黄口夏季微生物群落结构,并利用典范对应分析(Canonical correspondence analysis,CCA)了解影响微生物群落的主要环境因子。【结果】多样性指数分析表明该区域微生物群落多样性较高。微生物多样性分析发现优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria);在属分类水平上,相对丰度最高的菌属为芽孢杆菌属(Bacillus),其次为乳球菌属(Lactococcus)和hgcI_clade。Spearman相关性分析及典范对应分析表明环境因子对水体微生物群落结构具有显著影响。【结论】汾河与黄河微生物群落组成具有一定的差异,不同环境因子对不同微生物的影响程度不同,p H和溶解氧(Dissolved oxygen,DO)是汾河入黄口微生物群落结构的主要影响因子。     

Capturing the uncultivated majority

The metagenomic analysis of environmental microbial communities continues to be a rapidly developing area of study. DNA isolation, the first step in capturing the uncultivated majority, has seen many advances in recent years. Protocols have been developed to distinguish DNA from live versus dead cells and to separate extracellular from intracellular DNA. Looking to increase our understanding of the role that members of a microbial community play in ecological processes, several techniques have been developed that are enabling greater in-depth analysis of environmental metagenomes. These include the development of environmental gene tags and the serial analysis of 16S rRNA gene sequence tags. In addition, new screening methods have been designed to select for specific functional genes within metagenomic libraries. Finally, new cultivation methods continue to be developed to improve our ability to capture a greater diversity of microorganisms within the environment.     

Protein-RNA interface residue prediction using machine learning: an assessment of the state of the art

Background

Understanding the interaction among different species within a community and their responses to environmental changes is a central goal in ecology. However, defining the network structure in a microbial community is very challenging due to their extremely high diversity and as-yet uncultivated status. Although recent advance of metagenomic technologies, such as high throughout sequencing and functional gene arrays, provide revolutionary tools for analyzing microbial community structure, it is still difficult to examine network interactions in a microbial community based on high-throughput metagenomics data.

Results

Here, we describe a novel mathematical and bioinformatics framework to construct ecological association networks named molecular ecological networks (MENs) through Random Matrix Theory (RMT)-based methods. Compared to other network construction methods, this approach is remarkable in that the network is automatically defined and robust to noise, thus providing excellent solutions to several common issues associated with high-throughput metagenomics data. We applied it to determine the network structure of microbial communities subjected to long-term experimental warming based on pyrosequencing data of 16?S rRNA genes. We showed that the constructed MENs under both warming and unwarming conditions exhibited topological features of scale free, small world and modularity, which were consistent with previously described molecular ecological networks. Eigengene analysis indicated that the eigengenes represented the module profiles relatively well. In consistency with many other studies, several major environmental traits including temperature and soil pH were found to be important in determining network interactions in the microbial communities examined. To facilitate its application by the scientific community, all these methods and statistical tools have been integrated into a comprehensive Molecular Ecological Network Analysis Pipeline (MENAP), which is open-accessible now (http://ieg2.ou.edu/MENA).

Conclusions

The RMT-based molecular ecological network analysis provides powerful tools to elucidate network interactions in microbial communities and their responses to environmental changes, which are fundamentally important for research in microbial ecology and environmental microbiology.     

A Natural View of Microbial Biodiversity within Hot Spring Cyanobacterial Mat Communities

This review summarizes a decade of research in which we have used molecular methods, in conjunction with more traditional approaches, to study hot spring cyanobacterial mats as models for understanding principles of microbial community ecology. Molecular methods reveal that the composition of these communities is grossly oversimplified by microscopic and cultivation methods. For example, none of 31 unique 16S rRNA sequences detected in the Octopus Spring mat, Yellowstone National Park, matches that of any prokaryote previously cultivated from geothermal systems; 11 are contributed by genetically diverse cyanobacteria, even though a single cyanobacterial species was suspected based on morphologic and culture analysis. By studying the basis for the incongruity between culture and molecular samplings of community composition, we are beginning to cultivate isolates whose 16S rRNA sequences are readily detected. By placing the genetic diversity detected in context with the well-defined natural environmental gradients typical of hot spring mat systems, the relationship between gene and species diversity is clarified and ecological patterns of species occurrence emerge. By combining these ecological patterns with the evolutionary patterns inherently revealed by phylogenetic analysis of gene sequence data, we find that it may be possible to understand microbial biodiversity within these systems by using principles similar to those developed by evolutionary ecologists to understand biodiversity of larger species. We hope that such an approach guides microbial ecologists to a more realistic and predictive understanding of microbial species occurrence and responsiveness in both natural and disturbed habitats.     

分子生态网络揭示冶金微生物对能源底物的响应

通过分析不同铁硫比的能源底物驯化下冶金微生物群落的演替过程,基于分子生态网络揭示冶金微生物对能源底物的响应特征。对富铁少硫、富硫少铁条件下不同驯化批次的微生物样本进行高通量测序,分析物种组成,比较冶金微生物群落的α多样性和β多样性,并构建分子生态网络,探究驯化过程微生物之间的相互作用关系。鉴定关键物种,分析冶金微生物群落对能源底物的响应。研究发现在基于不同能源底物驯化过程中,富铁少硫群落的优势物种为嗜酸氧化亚铁硫杆菌Acidithiobacillus ferrooxidans和铁氧化嗜酸硫杆菌A.ferriphilus;而富硫少铁群落经过3个批次的驯化,氧化硫硫杆菌A. thiooxidans占比高达90%。α、β多样性分析结果表明,富硫少铁能源底物驯化过程使冶金微生物群落多样性降低,且随着驯化批次的增加群落组成发生显著变化。分子生态网络分析显示关键物种均为低丰度稀有物种,富硫少铁条件下菌种间具有更紧密的互作共生关系,群落更加稳定。通过该驯化实验,明确了不同能源底物对冶金微生物群落的影响。采用富硫少铁能源底物驯化冶金微生物,使冶金微生物群落更加稳定,有助于优势物种高效发挥铁、硫氧化功能...     

活性污泥微生物菌群研究方法进展

活性污泥是活性污泥法处理污水系统的功能主体。人类对活性污泥微生物菌群的认识随着其研究方法的发展而逐步深入。传统培养方法只能检测到活性污泥中1％～15％的微生物。随着一系列基于免培养的分子生物学技术的出现,活性污泥中菌群的复杂性和多样性以惊人的速度被人们认识,大量依靠传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物逐渐被发现。许多模拟活性污泥菌群生存环境条件的现代培养技术开始发展,且已成功培养了一部分传统培养方法不能培养的细菌类群,这为研究基于免培养方法发现的大量新的微生物菌群的生理特性和作用机制提供了可能,也无疑将把人们对活性污泥菌群的认识推向一个新的层次．主要介绍活性污泥微生物菌群研究的一系列方法,从传统培养方法到基于免培养的现代分子生物学技术,再到现代培养技术,着重论述了现代分子生物学技术及其在活性污泥微生物菌群研究中的进展。     

油藏微生物群落研究的方法学

油藏微生物群落的解析和认知是开发和应用微生物采油技术的基础。利用各种提高油藏微生物可培养性的方法和非培养技术解析不同油藏微生物的群落结构、功能和多样性,对定向调控油藏微生物群落、开发和应用有效微生物驱油技术具有重要的指导意义。通过调查新近发展的提高微生物可培养性的方法和措施以及不依赖于培养的分子微生物生态学技术,总结了油藏微生物群落研究方法学的最新进展。提高微生物可培养性的方法和措施主要通过模拟微生物的生存环境,减少富营养的毒害作用、添加信号分子维持微生物细胞间的作用和提供新型电子供体和受体等手段采用稀释法、高通量培养法等方法得以实现;不依赖于培养的分子微生物生态学技术主要包括荧光原位杂交、末端限制性片断长度多态性分析、变性梯度凝胶电泳和构建克隆文库等技术。这些方法学的进展为更有效的获得各种油藏微生物资源、调控油藏微生物群落以提高石油采收率提供理论指导。     

Analysis of 16S rRNA amplicon sequencing options on the Roche/454 next-generation titanium sequencing platform

Background

16S rRNA gene pyrosequencing approach has revolutionized studies in microbial ecology. While primer selection and short read length can affect the resulting microbial community profile, little is known about the influence of pyrosequencing methods on the sequencing throughput and the outcome of microbial community analyses. The aim of this study is to compare differences in output, ease, and cost among three different amplicon pyrosequencing methods for the Roche/454 Titanium platform

Methodology/Principal Findings

The following three pyrosequencing methods for 16S rRNA genes were selected in this study: Method-1 (standard method) is the recommended method for bi-directional sequencing using the LIB-A kit; Method-2 is a new option designed in this study for unidirectional sequencing with the LIB-A kit; and Method-3 uses the LIB-L kit for unidirectional sequencing. In our comparison among these three methods using 10 different environmental samples, Method-2 and Method-3 produced 1.5–1.6 times more useable reads than the standard method (Method-1), after quality-based trimming, and did not compromise the outcome of microbial community analyses. Specifically, Method-3 is the most cost-effective unidirectional amplicon sequencing method as it provided the most reads and required the least effort in consumables management.

Conclusions

Our findings clearly demonstrated that alternative pyrosequencing methods for 16S rRNA genes could drastically affect sequencing output (e.g. number of reads before and after trimming) but have little effect on the outcomes of microbial community analysis. This finding is important for both researchers and sequencing facilities utilizing 16S rRNA gene pyrosequencing for microbial ecological studies.     

PCR-DGGE技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)在微生物生态学领域有着广泛的应用。研究采用化学裂解法直接提取出不同农田土壤微生物基因组DNA,并以此基因组DNA为模板,选择特异性引物F357GC和R515对16S rRNA基因的V3区进行扩增,长约230bp的PCR产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分离后,得到不同数目且分离效果较好的电泳条带。结果说明,DGGE能够对土壤样品中的不同微生物的16S rRNA基因的V3区的DNA扩增片断进行分离,为这些DNA片断的定性和鉴定提供了条件。与传统的平板培养方法相比,变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术能够更精确的反映出土壤微生物多样性,它是一种有效的微生物多样性研究技术。