乙型肝炎病毒X基因及HBx蛋白的研究进展

我国是乙型肝炎高发区,乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录所必需的作用因子,在乙肝的致病过程中起到重要作用。HBx可直接或间接改变肝脏结构细胞的结构和功能,引发肝脏细胞的凋亡;具有广泛的非特异性反式激活作用,反式激活细胞内的某些癌基因或病毒基因,与乙型肝炎和肝细胞癌的发生关系十分密切。本文从多方面综述了X基因及HBx蛋白目前的研究进展,展现了X基因功能的多样性。     

HBx抑制IGFBP3转录的机制

【目的】在细胞水平上研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)转录的影响并对具体机制进行初步探索。【方法】首先采用RNA-Deep-Sequencing技术分析HepG2和乙型肝炎病毒(HBV)转基因细胞HepG2-4D14中表达差异的基因,然后通过实时定量PCR对相关基因进行验证;利用启动子报告基因分析,研究HBx对相关基因IGFBP3转录的调控;通过染色质免疫共沉淀方法,分析HBx抑制IGFBP3启动子活性的机制。【结果】RNA-Deep-Sequencing的结果表明IGFBP3在HBV转基因细胞HepG2-4D14中水平显著下调,实时定量PCR结果与RNA-Deep-Sequencing一致。进一步研究表明HBx能明显抑制IGFBP3的转录,通过实时定量PCR发现HBx对IGFBP3转录的抑制作用依赖于p53;染色质免疫共沉淀实验结果表明HBx能够通过抑制p53与IGFBP3启动子的结合,从而抑制IGFBP3的转录。IGFBP3是一种细胞周期负调控蛋白,我们推测HBx对IGFBP3水平的下调是其促进细胞增殖的途径之一。【结论】HBV能显著下调IGFBP3的转录,机制研究揭示HBV HBx通过干扰p53与IGFBP3启动子的结合进而抑制IGFBP3的转录。     

SOCS3基因重组腺病毒的构建及其在猪脂肪细胞中的表达

本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的重组腺病毒表达载体,获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经测序验证后,重组的穿梭质粒用PmeI酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得的重组质粒pAd-SOCS3,经PacI线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增,纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确,病毒滴度为1.2×109PFU/mL;感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒,感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。     

SOCS家族蛋白在病毒感染中发挥的作用

SOCS(Suppressor of cytokine signaling),是一种细胞因子信号通路抑制蛋白,目前认为该蛋白家族可以调节LIF(Leukemia inhibitory factor)、G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor)、IL-6(Interleukin-6)、IL-10(Interleukin-10)、IFN-λ(interferon-λ)等30多种细胞因子,而这些因子是机体抵抗入侵的外来病原体的主要免疫防御反应。病毒在感染宿主的过程中通过劫持宿主中的SOCS蛋白,从而对细胞中的JAK/STAT、NF-κB等与抗病毒因子调控相关的信号通路以及对T细胞的分化的调控调节病毒感染。近年来,大量的文献证实SOCS蛋白的变化与病毒感染的程度以及愈后的器官损伤具有紧密的联系,使得SOCS蛋白作为抗病毒靶点的研究尤为重要。本文主要讨论SOCS蛋白通过调控JAK-STAT、NF-κB等信号通路,在病毒感染过程中发挥的作用和作用机制。     

双香豆素在HBx介导的肝癌细胞生长增殖中的作用及其机制研究

HCC是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其中50％以上与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关,且乙肝相关性肝癌患者术后复发率明显高于未合并乙肝患者.而病毒蛋白HBx是促进乙肝相关性肝癌进展的主要因素.因此,寻找能够有效抑制HBx促癌作用的小分子化合物,减缓乙肝相关性肝癌的疾病进展,对于延长患者生存期具有重要意义.该研究初步探...     

HBV X基因的表达及在真核细胞中对内质网压力的作用

运用PCR技术获得HBx基因,分别克隆到原核表达载体pET-his和真核表达载体pcDNA3.1(-)上.重组质粒pET-his-HBx转化大肠杆菌BL21(DE3)后, IPTG诱导表达,利用Ni柱纯化后的蛋白免疫家兔,获得特异性的抗-HBx兔抗血清.重组质粒pcDNA3.1(-)-HBx分别转染HepG2和Hep3B细胞系后,经RT-PCR和Western blot检测,证明HBx可以在这两种细胞系中表达.通过报告基因的表达研究了HBx对XBP1和GRP78启动子的激活活性,结果表明瞬时转染HBx的细胞系中,XBP1和GRP78启动子介导的荧光素酶活性比相应的对照细胞增加了3～7倍.通过RT-PCR分析证明,转染了HBx的细胞中XBP1 mRNA发生了剪切.因此,可以初步推断HBx在HepG2和Hep3B细胞中的表达可以引起内质网压力反应,为进一步阐明HBx表达对内质网的影响和肝脏病原发生机制奠定了基础.     

HBV X基因的表达及在真核细胞中对内质网压力的作用

运用PCR技术获得HBx基因,分别克隆到原核表达载体pET-his和真核表达载体pcDNA3.1(-)上。重组质粒pET-his-HBx转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,利用Ni柱纯化后的蛋白免疫家兔,获得特异性的抗-HBx兔抗血清。重组质粒pcDNA3.1(-)-HBx分别转染HepG2和Hep3B细胞系后,经RT-PCR和Westernblot检测,证明HBx可以在这两种细胞系中表达。通过报告基因的表达研究了HBx对XBP1和GRP78启动子的激活活性,结果表明瞬时转染HBx的细胞系中,XBP1和GRP78启动子介导的荧光素酶活性比相应的对照细胞增加了3～7倍。通过RT-PCR分析证明,转染了HBx的细胞中XBP1mRNA发生了剪切。因此,可以初步推断HBx在HepG2和Hep3B细胞中的表达可以引起内质网压力反应,为进一步阐明HBx表达对内质网的影响和肝脏病原发生机制奠定了基础。     

HCV核心蛋白抑制干扰素α诱导的抗病毒基因表达及其机制研究

研究HCV核心蛋白对干扰素α诱导的抗病毒分子PKR和2′-5′OAS表达的影响及其机制。HCV核心蛋白表达质粒转染HepG2细胞,RT-PCR分析PKR和2′-5′OAS的mRNA水平变化,荧光素酶活性分析核心蛋白对ISRE介导的基因表达的影响;Western-blot分析SOCS3、STAT1及STAT1磷酸化水平的变化。在干扰素α刺激情况下,表达HCV核心蛋白的细胞中,PKR和2′-5′OAS的mRNA水平下降,ISRE介导的荧光素酶活性降低,STAT1磷酸化水平下降。此外,核心蛋白表达的细胞中SOCS3的mRNA和蛋白水平明显升高。结果表明,HCV核心蛋白可能通过激活SOCS3、抑制STAT1的磷酸化,从而下调干扰素α诱导的PKR和2′-5′OAS表达。     

小鼠免疫抑制蛋白SOCS3脯氨酸富集区为其生物学功能所必需

SOCS3（suppressors of cytokine signaling 3）可以调节信号转导过程并影响造血干细胞的分化.利用生物信息学方法,发现SOCS3蛋白含有脯氨酸富集区,采用重组PCR技术缺失SOCS3蛋白中的129～161位的氨基酸（SOCS3Δ129-161）,并将其克隆到pcDNA31/V5质粒载体中.转染细胞,然后通过流式细胞技术,分析预测的功能区对SOCS3蛋白功能的影响.结果表明,此脯氨酸富集区对SOCS3蛋白的三级结构和功能有重要的意义.建模结果显示,SOCS3Δ129-161蛋白结构发生显著变化.脯氨酸富集区的缺失也影响小鼠骨髓细胞向CD8+T细胞分化.研究结果显示,SOCS3蛋白中129～161位的脯氨酸富集区在其结构和功能上有重要的作用.     

HBx对感染细胞信号通路的调控及其与肝癌的发生

乙型肝炎病毒（HBV）X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录所必需的作用因子。同时,HBx通过与宿主功能蛋白直接或间接地相互作用而调节多种蛋白的功能,参与调控多条细胞信号通路转导,激活多种转录因子,在肝细胞抗凋亡和引发肝癌的过程中起重要作用。     

乙肝病毒X 蛋白通过CREB 上调HBx结合蛋白促进肝癌细胞迁移

乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx）对肝癌的发生发展具有十分重要的作用. HBx 具有促进肝癌迁移的作用,但其作用的分子机制不清. 本研究对 HBx 促进肝癌细胞迁移的分子机制进行了探讨. 伤口愈合和 Boyden’s chamber结果表明,HBx 可明显促进肝癌 HepG2 细胞迁移. 在稳定转染 HBx 的 HepG2（HepG2-X）细胞中转染 HBx 结合蛋白（hepatitis B X-interacting protein,HBXIP）的 RNA 干扰片段,可明显抑制 HBx 的促迁移作用. 免疫组化和实时定量 PCR 结果表明,HBXIP 在肝癌组织中显著高表达,并且与 HBx 表达成正相关. 荧光素酶报告基因和免疫印迹结果表明,HBx 显著增强 HBXIP 的启动子活性和蛋白质表达水平. 应用 HBx 的 RNA 干扰处理 HepG2-X 细胞,HBXIP 的启动子活性和蛋白质表达水平明显下降.将 HBXIP 启动子区的cAMP效应元件结合因子（CREB）结合位点突变后,HBx 上调 HBXIP 的作用消失. 应用 CREB 的 RNA 干扰处理肝癌细胞,在启动子水平和蛋白质水平上, HBx 对 HBXIP 的上调作用被显著抑制. 染色质免疫共沉淀结果表明,HBx 能够通过 CREB 结合到 HBXIP 的启动子上,进而发挥激活 HBXIP 的功能. 本研究结果表明,HBx 促进肝癌细胞迁移的作用是通过 CREB 上调 HBXIP 实现的. 这一发现对进一步揭示 HBx 促进肝癌细胞迁移的分子机制具有重要意义.     

HBXIP基因对乙肝病毒X蛋白诱导细胞凋亡的影响

探讨乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(hepatitisBXinteractingprotein ,HBXIP)基因在乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)诱导肝癌细胞凋亡时对细胞周期的影响.构建HBXIP基因真核表达载体pcDNA3 hbxip ,进行瞬时基因转染,将克隆有HBx基因的pCMV X (分别为1μg、2 μg和3μg)和pcDNA3 hbxip质粒分别和共转染至人H74 0 2肝癌细胞中(总体积分别为5 0 μl) .发现瞬时转染3μgpCMV X质粒后,肝癌细胞凋亡发生率为34 4 % ,肝癌细胞的细胞周期相关蛋白p2 7表达水平发生明显上调;与对照组相比,瞬时转染1μg、2 μg和3μg时,细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平均发生明显上调,但随着HBX水平的增加细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平发生明显下降;在稳定转染pCMV X质粒的H74 0 2 X肝癌细胞中无明显的细胞凋亡发生,研究发现p2 7的表达水平发生了明显下调,而细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平发生了明显上调;当pcDNA3 hbxip质粒与pCMV X质粒进行共瞬时转染时,细胞凋亡发生率由pcDNA3质粒与pCMV X质粒共转染时的2 9 2 %下降为13 3% ,p2 7的表达水平发生了下调,但细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平无明显变化.研究结果表明,瞬时转染一定剂量的x基因可导致肝癌细胞发生凋亡,细胞周期相关蛋白p2 7、细胞周期蛋白D和     

A comprehensive molecular interaction map for Hepatitis B virus and drug designing of a novel inhibitor for Hepatitis B X protein

Hepatitis B virus (HBV) infection is a leading source of liver diseases such as hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In this study, we use computation methods in order to improve our understanding of the complex interactions that occur between molecules related to Hepatitis B virus (HBV). Due to the complexity of the disease and the numerous molecular players involved, we devised a method to construct a systemic network of interactions of the processes ongoing in patients affected by HBV. The network is based on high-throughput data, refined semi-automatically with carefully curated literature-based information. We find that some nodes in the network that prove to be topologically important, in particular HBx is also known to be important target protein used for the treatment of HBV. Therefore, HBx protein is the preferential choice for inhibition to stop the proteolytic processing. Hence, the 3D structure of HBx protein was downloaded from PDB. Ligands for the active site were designed using LIGBUILDER. The HBx protein's active site was explored to find out the critical interactions pattern for inhibitor binding using molecular docking methodology using AUTODOCK Vina. It should be noted that these predicted data should be validated using suitable assays for further consideration.     

Hepatitis B virus X protein induces size-selective membrane permeabilization through interaction with cardiolipin

Hepatitis B virus X protein (HBx) functions in a variety of cellular events during the HBV life cycle. In a previous study, we reported that the HBx protein is sufficient to induce mitochondrial membrane permeabilization; however, the exact mechanism of HBx-induced mitochondrial membrane permeabilization has been not proposed. In this study, we report that HBx specifically targets cardiolipin (CL) and induces membrane permeabilization depending on CL concentration in mitochondrial outer membrane–mimic artificial liposomes. Interestingly, HBx-induced membrane permeabilization was enhanced by liposomes containing phosphatidylethanolamine, which plays a crucial role in forming a negative curvature on the membrane. We also show that the 68-117 region of HBx, which interacts with mitochondria, is necessary for membrane permeabilization. We examined the size of the pores formed by HBx and found that HBx permeates fluorescent dyes depending on the hydrodynamic diameter with a pore size of approximately 10 nm. The results of this study suggest that CL is necessary for HBx-induced membrane permeabilization and provide important information that suggests a new strategy for anti-HBV therapy.     

乙型肝炎病毒X蛋白与端粒酶的关系

端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的重复序列,对维持染色体的稳定性具有重要作用 .端粒酶（telomerase）是维持端粒长度必需的一种逆转录酶,在细胞增殖、衰老、永生化 和癌变等方面具有重要的作用.在肿瘤细胞中端粒酶发生明显变化,有较高水平的表达和很 强的活性,成为肿瘤细胞的重要特征之一.乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）X蛋白（HBx ）与肝癌的发生密切相关,HBx可以通过多种途径发挥致癌作用,其中一个重要的分子机制 ,即激活人端粒酶反转录酶hTERT（为端粒酶的催化亚单位）使细胞发生永生化而癌变.因此 ,详细阐明HBx与hTERT的关系对于揭示乙肝病毒致癌机制具有重要的意义.本文对HBV的分子 结构和HBx的分子生物学特性进行了详细的阐述,对HBx与hTERT及其调控因子的关系进行了 归纳和总结,有助于进一步阐明HBx的致癌机制.     

乙型肝炎病毒adr亚型X蛋白在大肠杆菌中的高效表达

将ａｄｒ亚型ＨＢＶ的完整Ｘ基因克隆到表达质粒ｐＰｒｏＥＸＨＴｂ中,实现了Ｘ蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达。表达产物全长１７９个氨基酸残基（其中Ｘ蛋白部分１５４个氨基酸残基）,分子量约１９．７ｋＤ,约占细菌总蛋白的３４％。其氨基端融合部分含有６组氨酸肽段,经ＨｉｓＴｒａｐＴＭ亲和层析纯化,一步可达纯度９３％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明,该表达产物可与ＨＢＶ感染患者体内的抗Ｘ抗体特异性结合。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

提高对丙型肝炎患者实验室检测的灵敏度和特异性,对相关人群进行筛查和早期诊断,是控制丙型肝炎病毒(HCV)流行与传播的有效措施。为了建立更为可靠的HCV诊断方法,通过采用PCR方法从J6/JFH12a型病毒中克隆出HCV ns3基因片段,将其连接到p ET-28a载体上,重组载体p ET-28a-ns3转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,以10%SDS-PAGE进行鉴定,获得表达的NS3重组蛋白分子量为72 k Da。将纯化的NS3蛋白免疫BALB/c小鼠,第4次免疫后采集血液并分离血清进行抗体活性鉴定,小鼠抗体效价为1∶256 000。进一步的Western blotting和间接免疫荧光结果显示,以重组NS3蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体可以很好地识别HCV感染Huh7.5.1细胞中的NS3蛋白,为下一步开展单克隆抗体制备和检测试剂盒研制工作奠定了基础。