高温强光对温州蜜柑叶绿素荧光、D1蛋白和Deg1蛋白酶的影响及SA效应

以3年生温州蜜柑（Citrus unishiu Marc.）植株为试材,用叶绿素荧光分析、Western-blotting蛋白质印记技术及DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显色法,研究了高温强光（38℃和1600 μmol?m-2?s-1）对叶片叶绿素荧光参数、PS（光系统）II反应中心D1蛋白和Deg1蛋白酶的影响和SA（水杨酸）的效应。结果表明,高温强光交互作用4 h后,叶片的初始荧光Fo升高,最大光能转化效率Fv/Fm、表观光合电子传递速率ETR及PSII的量子产额ΦPSII显著降低,在D1蛋白降解的同时,Deg1蛋白酶含量也下降,并伴有H2O2的积累。在高温强光下,外源的H2O2使叶绿素荧光动力学快相参数(Fi-Fo)/(Fp-Fo)值（反映PSII中QB非还原中心的数量）升高和I-P的斜率（反映PSII 活化中心还原态QA积累的值）下降,Fv/Fm、ETR、ΦPSII及D1蛋白和Deg1蛋白酶下降幅度增大;而外源的SA使这些参数下降幅度减小。这些结果说明,高温强光诱导H2O2的积累造成Deg1蛋白酶和光系统反应中心D1蛋白的降解,Deg1蛋白酶的减少也进一步限制了D1蛋白的周转,进而使温州蜜柑PSII反应中心遭到破坏,SA对光合机构光破坏有保护作用。     

PSⅡ反应中心D1蛋白的小肽抗体的制备和鉴定

用人工合成的PSⅡ反应中心D1蛋白中(229～240)的12肽,与牛血清白蛋白偶联后做为抗原免疫家兔, 获得抗菠菜D1蛋白抗体. 免疫双扩散法测得其具较高的效价,蛋白印迹检测结果显示该抗体仅与D1蛋白有免疫亲和反应. 表明此抗体可作为检测D1蛋白及其光抑制时降解产物的探针.     

柑橘叶片中叶黄素循环对PSII反应中心D1蛋白的保护效应

用叶黄素循环抑制剂二硫苏糖醇（DTT）处理7h的柑橘离体叶片,其非光化学猝灭系数NPQ大幅度下降;在中等强度光（500μmol·m^-2·s^-1）和高强度光（1500μmol·m^-2·s^-1）下,DTT处理的叶片光化学效率（Fv/Fm）分别下降3．8％和39．7％,光合电子传递速率（ETR）分别下降12％和49．5％,D1蛋白含量也分别下降87％和92.3％;黑暗对DTT处理叶片的各种荧光参数和D1蛋白的影响不大。显示叶黄素循环在保护光系统（PS）II反应中心、抵御光抑制中有一定的积极效应,可能影响了D1蛋白周转。     

D1-D2-Cyt b559复合物与33 kD 蛋白重组时光谱性质研究

将分离纯化的菠菜光系统ⅡD1-D2-Cyt b559反应中心复合物和33kD外周蛋白按摩尔比1：1或2：1的比例进行体外重组,监测重组过程中的室温可见光区吸收光谱和荧光发射光谱的变化。结果表明：重组过程中．样品的室温可见光区吸收光谱几乎无变化,但室温荧光发射光谱却有明显的变化,蛋白质内源荧光和叶绿素荧光的强度都有先增加后降低的现象,暗示33kD蛋白与D1-D2-Cyt b559复合物在形成稳定的重组复合物之前、存在一个复杂的蛋白构象变化过程,重组时33kD蛋白与反应中心复合物的结合,可能影响了反应中心D1或D2色素蛋白所结合的叶绿素a等色素分子的微环境。     

拟南芥Psrp-4基因参与光合作用机制的研究

叶绿体核糖体是植物特有的细胞器之一,其主要功能是合成质体基因编码的蛋白质。已有研究表明在叶绿体核糖体内含有6个质体特有蛋白PSRP(plastid-specific ribosomal protein),分别命名为PSRP1~PSRP6。然而,这些蛋白在叶绿体蛋白合成过程以及光合作用中的作用机制研究尚处初级阶段。在本研究中,为了阐明PSRP-4蛋白在叶绿体发育过程中的作用机制,我们利用Gateway系统构建了Psrp-4基因(At2g38140)的RNAi表达载体,转化野生型拟南芥后获得了Psrp-4基因表达量明显降低的psrp-4突变体。研究结果表明:psrp-4突变体比野生型生长略微缓慢,但叶片颜色与野生型差别不大,能够进行正常的光合作用。在高光胁迫条件下,测定psrp-4突变体光合化学效率,发现与野生型差异不明显;进一步的蛋白免疫印记实验证明Psrp-4基因表达量的降低对PSⅡ反应中心D1蛋白的周转也没有明显影响。因此,推测PSRP-4蛋白可能不是叶绿体蛋白合成以及光合作用的正常进行所必需的。     

不同混合速率下阳光UV辐射对假微型海链藻PSⅡ功能的影响

以浮游硅藻假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana(Hustedt)Hasle et Heimdal CCMP 1335)为材料,研究不同混合速率下,随辐射水平增加,UV辐射和可见光PAR对其光系统Ⅱ功能的影响。结果显示,混合速率慢时,随着PAR及UV辐射水平的增加,假微型海链藻PSⅡ的光化学效率(F_v/F_m)持续受到抑制,光合效率α和相对最大电子传递速率rETR_(max)下降。尤其是UV辐射存在时,PSⅡ反应中心D1蛋白含量下降,有活性的PSⅡ反应中心数量减少,单位反应中心吸收(ABS/RC)和耗散(DI_0/RC)的能量增加。混合速率快时,PAR辐射下PSⅡ光化学活性相比混合速率慢时升高,D1蛋白含量增加;而UV辐射存在下各光合参数表现出与混合速率慢时类似的变化趋势。研究结果表明水体混合速率的加快可缓解高水平可见光导致的光抑制,而对UV辐射的抑制效应并未产生显著改变。     

Deg2蛋白酶在拟南芥光损伤D1降解及光保护中的作用

已有研究表明叶绿体内有200种蛋白酶,然而,多数蛋白酶的作用机制尚不清楚,尤其哪些蛋白酶参与了D1蛋白周转.其中Deg2蛋白酶体外实验证明,其参与了光损伤D1蛋白的的初步剪切.为了进一步研究Deg2蛋白酶在植物体内的作用机制,我们筛选了拟南芥Deg2蛋白酶功能缺陷型突变体.在120 μmol·m-2·s-1光照生长条件下,deg2突变体与野生型的生长曲线基本一致;在进一步的高光胁迫(1 800 μmol·m-2·s-1)处理及相同的光胁迫处理条件下,无论林可霉素存在与否,突变体PSⅡ的最大光化学效率(Fv/Fm)都和野生型没有区别;利用蛋白免疫印迹实验同样证明了光损伤D1蛋白的降解速度在deg2突变体和野生型之间也没有明显区别.我们认为Deg2蛋白酶在光抑制情况下对于光损伤D1蛋白的降解以及PSⅡ的修复不是必需的.     

抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性及其识别抗原表位的初步鉴定

为了明确抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性,并鉴定其识别表位,首先在E.coli中表达了人类冠状病毒229E(HCoV-229E)和OC43(HCoV-OC4)N蛋白,用Western blotting和间接免疫荧光方法分别检测了4株抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体(1-1C2、1-1D6、2-8F11和2-2E5)与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白的交叉反应情况,而后应用12种重组截短型SARS-CoV N蛋白对上述4种单克隆抗体的识别表位进行了初步定位.结果显示(1)在4株抗N蛋白单克隆抗体中,1-1C2、1-1D6和2-2E5不与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白发生交叉反应,为SARS-CoV N蛋白特异性抗体;(2)2-8F11、1-1D6和2-2E5针对的抗原表位位于SARS-CoV N蛋白的aa 30-60,1-1C2针对的抗原表位则位于SARS-CoV N蛋白的aa 170-184.这一研究为阐明SARS-CoVN蛋白的免疫学特征,建立特异性免疫诊断技术和研究其致病机制提供了必要的依据和材料.     

抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性及其识别抗原表位的初步鉴定

为了明确抗SARS-CoVN蛋白单克隆抗体的特异性,并鉴定其识别表位,首先在E.coli中表达了人类冠状病毒229E(HCoV-229E)和OC43(HCoV-OC4)N蛋白,用Westernblotting和间接免疫荧光方法分别检测了4株抗SARS-CoVN蛋白单克隆抗体(1-1C2、1-1D6、2-8F11和2-2E5)与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白的交叉反应情况,而后应用12种重组截短型SARS-CoVN蛋白对上述4种单克隆抗体的识别表位进行了初步定位。结果显示:(1)在4株抗N蛋白单克隆抗体中,1-1C2、1-1D6和2-2E5不与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白发生交叉反应,为SARS-CoVN蛋白特异性抗体;(2)2-8F11、1-1D6和2-2E5针对的抗原表位位于SARS-CoVN蛋白的aa30-60,1-1C2针对的抗原表位则位于SARS-CoVN蛋白的aa170-184。这一研究为阐明SARS-CoVN蛋白的免疫学特征,建立特异性免疫诊断技术和研究其致病机制提供了必要的依据和材料。     

快速检测植物类囊体膜蛋白体内磷酸化的方法

借助特异的磷酸蛋白探针,建立了快速检测植物类囊体膜蛋白体内磷酸化的方法,可以检测到光照处理的豌豆叶圆片类囊体膜中8条磷酸化蛋白带存在,它们的分子质量分别为65、45、36、33、30、29、20和10 ku.进一步使用光系统Ⅱ反应中心蛋白和捕光色素复合物Ⅱ(LHCⅡ)的特异抗体,确定了上述磷酸化蛋白的归属,分别是磷酸化D1和（或）D2的聚合体（65 ku）、CP43（45 ku）、D2（36 ku）、D1（33 ku）,LHCB1（30 ku）,LHCB2（29 ku）和psbH gene产物（10 ku）,20 ku小肽尚不清楚其来源.并与其他几种检测磷酸化蛋白的方法进行了比较.