胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因的克隆及转化植株耐盐性分析

胡杨(Populus euphratica Oliv.)具有极强抗盐碱能力。本实验室前期胡杨微阵列芯片数据结果显示:盐胁迫下,胡杨谷胱甘肽过氧化物酶基因(PeGPX)的转录上调,暗示该基因可能对胡杨耐盐性具有一定的作用。为分析 GPX 对植物耐盐性的贡献,本研究以胡杨为材料,利用 RT-PCR 方法克隆了胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因,并在烟草中过量表达该基因,以分析谷胱甘肽过氧化物酶活性与植物耐盐性的关系。研究结果显示,实验中克隆的 cDNA (PeGPX)编码谷胱甘肽过氧化物酶,其 ORF 为 693 bp,其蛋白由 231 个氨基酸编码。过量表达 PeGPX 基因的烟草与野生型烟草的耐盐性实验结果显示,野生型烟草植株在加 NaCl(200 mmol/L)的 MS 培养基中生长 15 d 后,无明显的长高,且不长根;而转基因烟草在同样的加盐培养基上,生长基本没有受到抑制,植株生长状态良好,并且能够长根。光合数据显示,在盐胁迫下过量表达 PeGPX 基因烟草的净光合速率受到影响明显小于野生型烟草的净光合速率。酶活数据显示,转基因株系 GPX 酶活与野生型的相比在盐胁迫下活性有非常显著的提高。我们的研究结果说明:过表达 PeGPX 基因使得烟草的耐盐性得到显著提高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。     

丹参谷胱甘肽过氧化物酶的生物信息学分析

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)是动植物体内一种重要的抗氧化酶,它能够清除机体逆境胁迫而产生的过氧化氢和脂质过氧化物,使机体进行正常生长发育,因此解析丹参GPX的氨基酸序列,并与其它植物进行比较,为丹参GPX基因的后续研究提供重要参考。采用生物信息学的方法,在丹参基因组库中找到8个GPX基因,并对其进行生物信息学分析。8个GPX基因有不同的等电点和相对分子量,而二级结构存在相似特征;序列比对与系统发生分析表明,8个基因都具有3个保守结构域以及3个保守的催化残基;除Sm GPX4、At GPX4和Zm GPX02,Sm GPX8与At GPX8处于系统进化树的同一分支外,其它基因与玉米和拟南芥GPX基因的亲缘关系较远;Sm GPX1-2、Sm GPX6-1、Sm GPX6-2、Sm GPX8主要在叶片中表达,而Sm GPX1-1主要在花中表达,具有组织特异性。本研究为进一步了解丹参谷胱甘肽过氧化物酶的基本功能奠定了基础,为开展植物抵御氧化胁迫研究提供了理论依据。     

三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)基因cDNA全序列。序列分析表明, 该基因cDNA序列全长1286 bp, 包括5′端非翻译区(Untranslated Region) 39 bp、3′端非翻译区659 bp和开放阅读框(Open reading frame, ORF)588bp, 共编码195个氨基酸, 分子量约为22.2 kDa, 理论等电点为8.44, 属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构, 对酶的三级结构起稳定作用。在线分析结果表明: GPX的氨基酸序列不存在明显的疏水区, 也不存在信号肽序列。氨基酸相似性对比结果显示, 三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高, 为73.1%-80.8%, 与其他型GPX相似度较小, 相似度低于60%。构建的系统进化树显示三角帆蚌GPX与其他几种鱼类GPX聚为一类, 与其他已发表的几种软体动物GPX相距较远, 推测本实验克隆的三角帆蚌GPX基因和已发表的软体动物不属于同一种GPX类型。     

草鱼胞浆谷胱甘肽过氧化物酶cDNA全长的克隆与分析

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs,EC1.11.19)是生物体内抗氧化防御系统的重要组成部分。本文从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)克隆到胞浆谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPX1)cDNA全长序列。该序列全长890bp(GenBank accession No.EU828796),包括完全开放阅读框(ORF)576bp、5'非编码区(5'-UTR)17bp和3'-UTR297bp。其ORF编码191个氨基酸残基,包含一个由"UGA"(通常为终止密码子)编码的硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec40)残基,并与另2个残基(Glu75和Trp153)构成酶活性中心。同时,草鱼GPX1cDNA的3'-UTR中具有保守的硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence,SECIS)元件。氨基酸序列相似性比较显示,草鱼GPX1cDNA的推测氨基酸序列(GenBank accession No.ACF39780)与斑马鱼GPX1(GenBank accession No.NP_001007282)的相似性为95.8%,与鳗鲡GPX1(GenBank acces-sion No.ACN78878)的为84.8%,与哺乳类的为59%~72%。采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测草鱼GPX1的组织表达特征。结果表明,草鱼GPX1的mRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝、鳃和肾表达水平较高,在红肌、脂肪和肠道中表达水平较低。本研究结果将有助于进一步探讨鱼类GPX1基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础。     

盐芥EsABCG25的克隆及其表达分析

旨在揭示盐芥(Eutrema salsugineum)ABCG25的结构及其对干旱、盐害以及温度等胁迫的响应。以山东生态型盐芥作为材料,通过电子克隆以及RT-PCR技术,获得一个腺苷三磷酸结合盒转运蛋白G(ABCG)家族成员基因的全长cDNA序列,命名为EsABCG25,GenBank登录号为KY111263。EsABCG25全长2 154 bp,含1 983 bp的开放阅读框,编码一个含有660氨基酸的蛋白分子。该基因定位于盐芥第5染色体,含有4个外显子和3个内含子。EsABCG25蛋白具有一个核苷酸结合结构域(NBD)和一个跨膜结构域(TMD),与来源于同科植物芜菁的ABCG25亲缘关系最近。对高通量测序数据分析表明该基因在盐芥的茎部表达最为丰富,在莲座叶中表达丰度最低,且在不同组织中均有可变剪接事件。Real-time PCR结果显示,该基因表达受多种逆境影响,尤其受到ABA的明显诱导。EsABCG25具有ABCG家族的典型序列特征;该基因在盐芥不同组织中的表达丰度存在差异,表达受到多种逆境的诱导,与盐芥的抗逆性关系密切。     

马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因(Dd-Gpx)的克隆与原核表达

旨在研究植物寄生线虫谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)的结构和功能,通过RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)Gpx基因,并成功克隆到p ET-41b载体上进行融合表达。结果表明,该基因c NDA全长950 bp,含有1个681 bp的开放阅读框,共编码226个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白N端有明显信号肽,属于分泌蛋白。将其克隆到p ET-41b载体在BL21(DE3)中进行原核表达,结果显示,在60 k D处有一条明显的带。经质谱鉴定,此条带有7个肽段与马铃薯腐烂茎线虫GPX匹配。表明重组Dd-GPX蛋白表达成功。     

石榴PgGPX基因克隆及盐胁迫下的表达分析

该研究以‘红玉石籽’籽粒为材料,通过RACE技术克隆了石榴GPX基因,利用Real-time PCR检测石榴在不同器官中及石榴叶片在盐胁迫处理下的相对表达量。结果表明:(1)PgGPX基因cDNA全长872bp,其中开放阅读框504bp,编码168个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白具有植物GPX的典型结构,与可可树、荔枝、甜橙、玉米等植物的GPX基因相比,具有较高的一致性,分别为90.30%、87.40%、86.80%、86.20%。(2)PgGPX在石榴的叶片、花瓣和籽粒中均有所表达,且具有组织特异性,在盐胁迫下,石榴叶片中的PgGPX表达量显著上升。推测PgGPX基因在胁迫反应中可能发挥重要作用。     

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因结构及其调控序列分析

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (PHGPx) 是谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx) 家族的重要一员,是目前已知能直接保护生物膜免受过氧化损伤的唯一酶类 . 此前的研究表明,萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因 (RsPHGPx) 编码一个有生理功能的过氧化物酶 , 并且 RsPHGPx 基因的表达可能受发育和环境胁迫信号的复杂调控 . 要深入了解该基因的表达调控机制首先必须阐明 RsPHGPx 基因的结构及其上游调控序列 . DNA 印迹表明萝卜 RsPHGPx 基因以单拷贝的形式存在于基因组中 . 以基因组 DNA 为模板,通过常规 PCR 与染色体步行相结合的方法克隆到了一段 3.3 kb 长的 RsPHGPx 基因组序列 . 分析发现,该基因由 7 个外显子和 6 个内含子组成,所有内含子的剪切位点均符合真核生物 GT-AG 规则 . 另外还发现该基因的上游基因是生物素合成酶基因;位于 RsPHGPx 基因上游的调控序列只有不足 300 bp. 这些结构特征与拟南芥 AtGPX3 基因极其相似 . 顺式作用元件的数据库搜索发现 RsPHGPx 基因的上游调控序列含有多个响应激素 ( 如 E-Box 和 W-Box) 、胁迫 ( 如转录因子 MYB 和 MYC 的结合位点 ) 和光 ( 如 Box Ⅱ和Ⅰ -Box) 信号的元件 . RNA 印迹分析表明 RsPHGPx 基因的表达受到脱落酸 (ABA) 和连续光照 ( 在黄化苗中 ) 处理的负调控,受到冷胁迫 (4℃ ) 的正调控,这暗示了预测的顺式作用元件的调控作用 . 然而,除草剂 paraquat 对该基因表达的正调控作用,暗示了某些与氧化胁迫相关的未知元件的存在 . 这些结果进一步印证了 RsPHGPx 基因的表达受发育和环境胁迫信号复杂调控的推测 . 这是迄今为止首个关于植物 PHGPx 基因结构和上游调控序列的系统报道,为今后全面认识植物 PHGPx 基因的表达调控机制奠定了必要基础 .     

二氧化硫胁迫导致拟南芥防护基因表达改变

研究SO2熏气对拟南芥细胞中mRNA和蛋白质表达的影响,分析植株对逆境胁迫的响应机制.结果表明,30 mg·m-3 SO2 熏气72 h后拟南芥地上组织中差异表达1倍以上的基因有494个,其中抗氧化酶、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、硫氧还蛋白等多种与逆境生理关系密切的基因表达上调;2.5～30 mg·m-3 SO2 熏气可导致超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和GST的活性诱导性增高,SOD、CAT同工酶谱带特征改变.研究结果表明,SO2 胁迫能够诱导拟南芥中防护基因在mRNA和蛋白质表达水平的改变,这些基因的差异性表达可能对逆境生理过程有益.     

盐胁迫盐芥和拟南芥褪黑素含量及合成相关基因表达模式分析

盐生植物盐芥（Eutrema salsugineum）耐盐适应性强且具备模式植物特征,是研究植物逆境适应机理的理想材料。作为一种多功能的激素信号分子,褪黑素在盐芥耐盐性中的作用仍不清楚。本研究以盐芥为主要材料,以拟南芥做对比,主要通过褪黑素酶联免疫以及实时荧光定量PCR分析,比较了二者在不同组织中褪黑素的积累和在响应盐胁迫过程中褪黑素合成、相关基因的表达模式以及外源褪黑素处理对其盐应答表型的影响。结果显示,两种植物的褪黑素合成均在幼叶中最高,盐芥本底褪黑素合成水平显著高于拟南芥,且盐胁迫诱导了两种植物中的褪黑素含量,但不同于盐芥,拟南芥在处理7 d后褪黑素合成明显下降。通过序列比对发现在不同植物中,盐芥和拟南芥褪黑素合成相关基因的亲缘关系较近。盐应答表达分析显示,盐芥SNAT1、ASMT和COMT在盐处理3 d表达上调,而拟南芥中的相关基因在处理1 d和3 d后受盐诱导,7 d后拟南芥中表达下降而盐芥中则无明显变化,表明两种植物相关基因响应盐信号的表达变化存在差异。此外,外源褪黑素处理明显缓解了两种植物在盐逆境下的胁迫表型。综上,褪黑素有效贡献于盐芥抗盐性,参与调节盐芥和拟南芥的耐盐适...     

Cloning and characterization of a flowering time gene from Thellungiella halophila

Thellungiella halophila (T. halophila) (salt cress) is a close relative of Arabidopsis and a model plant for salt tolerance research. However, the nature of its later flowering causes some difficulties in genetic analysis. The FRIGIDA (FRT) gene plays a key role in the Arabidopsis vernalization flowering pathway, whose homolog in T. halophila may also be a key factor in controlling flowering time. In order to study the molecular mechanism of vernalization responses in T. halophila , a full length cDNA named ThFRI (Thellungiella halophila FRIGIDA) was isolated from the young seedlings of T. halophila by RT-PCR and RACE. The ThFRI cDNA was 2017 bp in length and contained an open reading frame encoding a putative protein of 605 ami no acids. The ThFRI showed significant homology to AtFRI (74.5% at the nucleotide level and 63.9% at the ami no acid level). To study its function, ThFRI cDNA was transformed into Arabidopsis thaliana , driven by CaMV 35S promoter. Transgenic plants expressing ThFRI exhibited late-flowering phenotype, which suggests that ThFRI is the funtional FRI homolog in T. halophila . The cloning and funtional characterization of the FRI homolog of T. halophila will faciliate further study of flowering time control in T. halophila .     

Low unidirectional sodium influx into root cells restricts net sodium accumulation in Thellungiella halophila, a salt-tolerant relative of Arabidopsis thaliana

Thellungiella halophila is a useful model species for research into plant salt tolerance. It is closely related to Arabidopsis thaliana, but shows considerably higher salt tolerance. Comparative analysis of ion homeostasis in the two species allows the identification of ion transport pathways that are critical for salt tolerance and provides the basis for future studies into their molecular features. Previous studies indicated that salt tolerance in T. halophila is accompanied by low accumulation of Na in the leaves. Kinetic analysis of net ion uptake over three days confirmed lower Na uptake and K loss in T. halophila compared with A. thaliana. Differential net Na uptake rates were still apparent after 6 weeks of salt treatment. To assess the contribution of unidirectional Na fluxes to net Na uptake, kinetic studies of (22)Na fluxes were carried out in both species. The results show that unidirectional root Na influx is significantly lower in salt-grown T. halophila plants than in A. thaliana exposed to the same level of salinity (100 mM). Quantitative comparison of unidirectional influx and net Na accumulation suggests that both species operate efficient Na efflux, which partly compensates for Na influx. Kinetic analysis of (22)Na efflux indicated higher root Na efflux in A. thaliana than in T. halophila. Thus A. thaliana appears to spend more energy on Na export while nevertheless accumulating more Na than T. halophila. It is proposed that limitation of Na influx is the main mechanism by which T. halophila secures low net Na accumulation in saline conditions. This strategy provides the basis for a positive balance between growth and net Na uptake rates, which is essential for survival in high salt.     

盐胁迫对拟南芥和盐芥莲座叶芥子油苷含量的影响

芥子油苷是十字花科植物中一类含氮、含硫的次生代谢产物,与其水解产物在植物防御功能中有重要意义且与环境因子关系密切。以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和盐生模式植物盐芥（Thellungiella halophila）为研究对象,系统地分析了盐胁迫下二者芥子油苷组成和含量的变化规律。拟南芥（生长4周）和盐芥（生长6周）叶片的芥子油苷组成在盐胁迫后没有改变。拟南芥的芥子油苷总量、脂肪族芥子油苷总量、吲哚族芥子油苷总量受盐胁迫的影响均不显著,而盐芥的则随盐胁迫增强先减少、后增加并高于对照水平。拟南芥脂肪族的3MSOP、5MSOP和吲哚族的4OHI3M、4MOI3M随盐胁迫增强而含量降低,而脂肪族的6MSOH、吲哚族的I3M以及盐芥脂肪族的3MSOP则随盐胁迫增强有含量增加的趋势。拟南芥脂肪族的8MSOO和吲哚族的1MOI3M,盐芥脂肪族的3MTP、Allyl、10MSD和吲哚族的4MOI3M,在盐胁迫下的含量变化与盐芥芥子油苷总量的变化趋势一致。     

水稻锌指蛋白基因OsBBX6的克隆、表达及生物信息学分析

锌指蛋白作为植物体内一类重要的转录因子,对植物生长发育、基因调控以及响应外界环境变化方面发挥重要作用。Os BBX6基因属于水稻锌指蛋白B-Box基因家族成员,启动子元件分析发现其含有高温应答元件(HSE)、干旱应答元件(MBS)及非生物胁迫响应元件(TC-rich repeats)等逆境相关元件。组织特异性定量表达分析表明,Os BBX6在叶片中表达最高,根其次,茎和幼穗中表达最低。胁迫处理后的荧光定量PCR发现其受低温诱导上调,受高温、干旱、盐胁迫等抑制表达,表明其正向响应低温胁迫,负向响应高温、干旱、盐胁迫等。另外,本研究还克隆了OsBBX6基因,并对其进行了系统进化、蛋白跨膜、蛋白亚细胞定位及OsBBX6基因共表达等分析,为进一步研究其生物学功能奠定基础。     

Genome-Wide Characterization,Evolution, and Expression Analysis of the Ascorbate Peroxidase and Glutathione Peroxidase Gene Families in Response to Cold and Osmotic Stress in Ammopiptanthus nanus

Ascorbate peroxidase (APX) and glutathione peroxidase (GPX) are two families of essential peroxidases that maintain redox balance in cells by catalyzing the reduction of hydrogen peroxide. Ammopiptanthus nanus is a rare broad-leaved evergreen shrub that lives in the temperate desert areas of Central Asia and exhibits strong resistance to low temperature and water stress. GPX and APX family members might contribute to the stress response of A. nanus by participating in reactive oxygen species scavenging. In the present study, APX and GPX family members in A. nanus were identified and their structure, evolution, and expression patterns under stress conditions were investigated. A total of 8 GPX genes, 6 APX genes, and 1 APX-like gene were identified in A. nanus, and these genes were unevenly distributed on 7 chromosomes. These APXs and GPXs showed conservation in amino acid sequence, three-dimensional structure, and intron–exon structure. The GPX gene family in A. nanus expanded in gene number, and the expansions were mainly driven by segmental duplication caused by large-scale duplication events in the evolution of Tribe Sophoreae and might play important roles in the freezing and drought tolerance in A. nanus. Expression profiling based on RNA-seq datasets and qRT-PCR analysis showed that most of the APX and GPX members were differentially expressed under osmotic and cold stress, which is in line with the high copies of stress and hormone response-related cis-acting elements predicted from the promoters of the APX and GPX family genes. The study provided new insight into the evolution of APX and GPX family and promoted the understanding of the molecular mechanism underlying the stress tolerance of A. nanus.