水稻PDK2基因原核表达和多克隆抗体制备

本研究以水稻幼苗为材料,通过RT-PCR扩增得到1.1 kb的编码PDK2(登录号:AK100033)基因的片段,成功构建重组表达载体pET-23d=PDK2并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.研究结果表明,重组蛋白以包涵体的形式存在,且PDK2的最佳表达条件为:28℃,120 r/min,0.5 mmol/L IPTG诱导60min.经纯化后免疫新西兰大白兔以制备PDK2多克隆抗体.Western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好,这为进一步研究水稻PDK2的生物学功能奠定了基础.     

水稻Argonaute 2蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备水稻Argonaute 2(AGO2)的多克隆抗体,该研究采用RT-PCR扩增OsAGO2蛋白165~401aa片段和440~570aa片段的编码序列,并构建了2个原核表达载体。诱导表达重组蛋白后注射家兔,制备了相应的多克隆抗体,最后利用Western blot初步分析水稻AGO2蛋白的表达模式。结果表明:成功构建2个表达载体,通过诱导获得了分子量约为30kD和23kD的重组蛋白。其中,以440~570aa片段为抗原所制备的多克隆抗体免疫印记效果较好。Western blot表明在水稻花药、愈伤组织及小穗中检测到OsAGO2表达。该研究为进一步深入探讨水稻OsAGO2基因的特性与功能奠定了基础。     

水稻LRR型类受体蛋白激酶胞外区的原核表达及多克隆抗体制备

前期研究表明,水稻根尖细胞质膜类受体蛋白激酶OsRLK的表达受盐胁迫诱导.为了进一步研究该激酶的生理功能,通过反转录PCR得到OsRLK胞外区cDNA片段,将其亚克隆至pET29a原核表达载体并在大肠杆菌中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%.重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化得到1:20 000效价的多克隆抗体.Wescem blot结果显示,该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型类受体蛋白激酶,并且在蛋白质水平证实该激酶为盐胁迫响应蛋白.     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

spindlin1基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的:明确人新基因spindlin1的组织表达谱、相互作用蛋白。方法与结果:应用PCR技术获得spindlin1的开放读框,并将其插入原核表达载体pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,融合蛋白GST-Spindlin1获得了可溶性表达。用SDS-PAGE胶上的目的条带做抗原制备了多克隆抗体,进行了抗体纯化。结论:spindlin1在OVCar3细胞中可能以二聚体形式存在,这一现象还有待于进一步研究。     

通粳1号水稻乙醛脱氢酶基因的克隆及原核表达

目的：克隆通粳1号水稻乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase,ALDH）基因,并在大肠杆菌中进行体外表达。方法：提取通粳1号水稻幼根总RNA,RT-PCR法扩增ALDH基因开放阅读框架片段,双酶切后连接至pET5a表达质粒中,转化BL21（DE3）宿主菌,平板培养筛选,挑取阳性菌落并提取质粒,酶切、电泳鉴定插入片段并测定其序列。含重组质粒的BL21（DE3）进行常规LB扩大培养,用不同浓度的IPTG作用不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。结果：质粒中插入的ALDH片段为1668bp,含有完整的开放阅读框架,序列与GenBank比较无差异,插入方向正确无误,表达蛋白分子量为61.8kDa左右,符合预期值,IPTG最佳诱导时间为3h,0.1mmol/L～0.8mmol/L浓度的IPTG作用效果无显著差异。结论：该基因的成功克隆和表达为进一步研究水稻中ALDH的作用和应用生物工程法大量获得ALDH奠定基础。     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

自噬相关基因Atg5的原核表达及多克隆抗体制备

目的：克隆自噬相关基因Atg5,在大肠杆菌中重组表达后制备抗Atg5多克隆抗体。方法：用RT-PCR方法从RAW264．7细胞基因组中克隆Atg5基因,连接至pQE80L原核表达载体后转化大肠杆菌DH50α进行诱导表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定表达蛋白;目的蛋白纯化后,以100μg／kg纯化的蛋白免疫新西兰兔,制备抗Atg5多克隆抗体;提取RAW264．7细胞总蛋白,以制备的抗Atg5多抗进行Westernblot反应,检测多抗的生物学活性。结果：克隆了Atg5基因,在大肠杆菌中表达了重组Atg5,SDS-PAGE分析显示表达产物相对分子质量与预期值一致,Western blot结果证明该产物具有较高的生物学活性,纯化蛋白免疫动物后制备了抗Atg5多克隆抗体。结论：在大肠杆菌中表达了重组Atg5,制备了抗Atg5多克隆抗体,为自噬的检测和研究提供了工具。     

牦牛Prdm9基因保守区的原核表达及多克隆抗体制备

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从牦牛睾丸组织获得Prdm9基因的cDNA的保守区序列,克隆到pMD19-T载体中。经测序确证后,将基因克隆到原核表达载体PET32a(+),转化E.coli表达菌BL21(DE3),以IPTG诱导融合蛋白的高效表达。利用Ni柱亲和层析纯化蛋白,将得到的抗原免疫日本大白兔,获得了1∶4效价的牦牛PRDM9保守序列的多克隆抗体,可用于后续试验的研究。     

小菜蛾普通气味结合蛋白2基因的原核表达与多克隆抗体制备

本实验提取羽化3 d的小菜蛾Plutella xylostella成虫触角总RNA,反转录合成cDNA,以此为模板PCR扩增出小菜蛾普通气味结合蛋白2基因,大小为492 bp,Blast结果显示与多种昆虫的GOBP2具有较高的同源性.将该基因克隆到表达载体pMAL-c4E中,转化宿主菌TB1(DE3),获得单克隆重组质粒pMAL-c4E-GOBP2.IPTG成功诱导pMAL-c4E-GOBP2表达出约60 kDa的融合蛋白.优化诱导条件为3 mmol/L终浓度IPTG、6 h,可获得大量可溶性蛋白.表达的融合蛋白通过亲和色谱法纯化、免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.ELISA分析表明制备的抗体效价达1:1.28×105.     

文昌鱼BRA蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

Brachyury编码的转录调控因子BRA参与脊索动物脊索的分化形成,文昌鱼是最早具有真正脊索的后生动物类群,因此开展文昌鱼Brachyury基因功能研究,将有助于揭示脊索的起源与进化。文昌鱼具有2个Brachyury基因:Bra1和Bra2,二者编码的蛋白序列相似度高达93%,缺少有效区分二者的特异抗原表位,转录组数据分析表明Bra2表达量显著高于Bra1,进一步对BRA2蛋白序列特征分析发现其N端拥有丰富的潜在抗原决定簇,因此本研究选择了Bra2 N端696 bp基因序列所编码的蛋白片段作为制备抗体的抗原蛋白。将该段基因序列克隆重组入p ET28a原核表达质粒,经诱导表达获分子量约31 ku的可溶性重组蛋白。通过Ni2+亲和层析柱纯化,得到1.3 g/L高纯度抗原蛋白,用3只ICR小鼠(Mus musculus)经4轮重组蛋白免疫[剂量50μg/(只·次)]后获得最高效价(1︰256 000)的多克隆抗体。Western印迹结果显示,本研究制备的鼠抗文昌鱼BRA多克隆抗体不仅可特异识别重组抗原蛋白,也可高效识别文昌鱼胚胎总蛋白中的BRA1和BRA2,为后续深入研究文昌鱼BRA在脊索发育调控中的作用提供了有力的分子工具。     

苦荞类过敏原的原核表达及多克隆抗体制备

以苦荞种子发育期全长cDNA文库中获得的与甜荞16 kD过敏原同源的基因BALP(Buckwheat Allergenlike protein,BALP; GenBank登录号GO496294)为基础,构建了原核表达载体pET47b-BALP,实现了在大肠杆菌Rosetta gami2 (DE3)中的高效表达,并对诱导...     

水稻NADP-苹果酸酶的原核表达、纯化和抗体制备

构建了水稻NADP-ME_2基因cDNA的原核表达载体pQE30,并诱导表达出有生物学功能的融合蛋白。用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化出NADP-ME_2融合蛋白,并测定了融合蛋白酶学特性(V_(max)、K_m、K_(cat)、底物特异性)。用纯化的NADP- ME_2融合蛋白免疫家兔,制备出抗水稻NADP-ME特异性抗体。全蛋白双向电泳后Western印迹表明水稻中至少有4个NADP-ME家族蛋白质成员。     

黄瓜CsERECTA基因的原核表达及其多克隆抗体制备

ERECTA基因编码一个富含亮氨酸重复序列结构的丝/苏氨酸类受体蛋白激酶,参与调控植物器官的形态建成,在株型控制及抗逆方面也有重要作用。该研究通过构建带有maltose binding protein(MBP)标签的pET21a-CsERECTA融合蛋白原核表达载体,实现了在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的高效表达,并对诱导表达的温度、时间和IPTG浓度进行了优化。利用镍离子螯合层析纯化得到MBP-CsERECTA融合蛋白,再用rTEV蛋白酶对其进行酶切,得到CsERECTA蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体。结果表明,黄瓜CsERECTA蛋白以可溶和包涵体2种形式表达,低温有助于蛋白以可溶性形式大量存在。最佳诱导温度为23℃,诱导时间为6h,IPTG浓度为0.5mmol·L~(-1)。通过Western blot可检测到黄瓜内源的CsERECTA蛋白,说明制备的多可隆抗体具有较好的特异性。多克隆抗体的成功制备为进一步研究CsERECTA的功能奠定了基础。     

果蝇Domeless蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

在果蝇(Drosophila melanogaster)的研究中发现Domeless接受器参与发育期间的JAK/STAT信号调节,在心脏疾病的发生机制中发挥重要作用.为了克隆Domeless,我们利用生物信息学选择果蝇Domeless基因抗原亲水区,将扩增出的PCR片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E.coli(Escherichia coli)中后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-Domeless融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.用Western blot检测抗体的效价和特异性.获得了Domeless原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Domeless多克隆抗体,为后续Domeless功能研究奠定了基础.     

拟南芥转录因子DYT1的原核表达与多克隆抗体制备

以拟南芥雄性不育突变体ms157为材料,对其转录因子DYT1的原核表达进行了分析及多克隆抗体的制备.结果表明:构建的原核表达载体转化入BL21菌株后,经IPTG诱导,表达了分子量约为50 kD的重组蛋白.SDS-PAGE检测结果表明,该重组表达蛋白以可融性形式表达.用该蛋白作为抗原注射新西兰兔后,成功获取了多克隆抗体.Western blotting证实其具良好的免疫原性,ELISA结果表明融合蛋白的效价大于1:5 120.     

草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

斑马鱼Lefty1特异性多克隆抗体的制备

Lefty蛋白是TGFβ大家族的配体,通过与Nodal以及Nodal的受体结合而抑制Nodal信号转导。本文采用PCR技术扩增出斑马鱼lefty1基因（z—lefty1）的部分编码区,将其插入到pGEX-4T-1原核表达载体中。所构建的重组质粒（pGEX／z-Lefiy1）转化入BI21大肠杆菌,通过IPTG诱导表达GST—z—Lefty1融合蛋白。蛋白经尿素洗涤分离后用于免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blotting检测结果表明获得了高效价的特异性兔抗z—Lefiy1多克隆抗体。这为进一步研究斑马鱼心脏发育的分子机制创造了条件。     

小麦TaMAPK2激酶基因的原核表达以及多克隆抗体制备

MAPK蛋白激酶是一类重要的植物胁迫信号调控因子.为了研究小麦MAPK基因的功能,苯试验克隆了小麦MAPK蛋白激酶基因TaMAPK2.为了制备TaMAPK2基因的多克隆抗体,TaMAPK2的非保守区段的DNA序列anti-MAPK2被构建到原核表达载体 pET-28a-(+)上,表达融合蛋白His-antiMAPK2.在终浓度为1 mmol/L IPTG诱导1h的条件下,融合蛋白His-antiMAPK2表达量达到最大.通过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)得到纯化的His-antiMAPK2融合蛋白.利用新西兰大白兔制备了TaMAPK2基因的多克隆抗体,ELISA竞争抑制法检测抗体效价检测,效价为1:80000,能满足后续试验要求的效价值,为进一步分析TaMAPK2的蛋白定位、表达等提供基础.