纤维二糖脱氢酶在纤维素降解中的作用研究*

裂褶菌纤维二糖脱氢酶（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ, ＣＤＨ）可以提高纤维素酶对纤维素的降解。以纤维二糖为电子供体, ＣＤＨ作用于羧甲基纤维素可降低其溶液的粘度,作用于纤维素 ＣＦ１１和磷酸膨胀纤维素,分别使其悬浊液的浊度提高７％和１４．４％。ＣＤＨ与纤维二糖水解酶或内切纤维素酶在降解棉花纤维素时没有表现出协同作用。但若棉花事先在纤维二糖存在下用ＣＤＨ预处理,则变得易于被水解。     

纤维二糖脱氢酶的纤维素降解中的作用研究

裂褶菌纤维二糖脱氢酶（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,ＣＤＨ）可以提高纤维素酶对纤维素的降解。以纤维二糖为电子供体,ＣＤＨ作用于羧甲基纤维可降低其溶液的粘度,作用纤维素ＣＦ１１和磷酸膨胀纤维素,分别使其悬浊液的浊度提高７％和１４．４％。ＣＤＨ与纤维二糖水解酶或切纤维素酶在降解棉花纤维素时没有表现出协同作用。但若棉花事先在纤维二糖存在下用ＣＤＨ预处理,则变得易于被水解。     

岱字15号棉纤维发育过程中纤维细胞壁组分变化的研究

棉纤维初生壁延伸期间(开花后第6～22天),平均每胚珠纤维细胞壁总蛋白质、纤维素、总中性糖及各种中性糖组分含量都不断增加。初生壁延伸停止时,总蛋白质及各中性糖组分含量明显下降,而纤维素含量仍然增加,直至开花后第50天。纤维发育后期,蛋白质含量回升,木糖含量显著地持续增加,而非纤维素葡萄糖含量迅速减少。以纤维细胞壁干重为单位表示的纤维素含量在初生壁延伸期间迅速增加,而总蛋白质、总中性糖含量显著下降,至纤维素含量在壁干重中占了绝对优势,各组分的变化渐不明显。以离子键结合于纤维细胞壁的蛋白质占纤维细胞壁干重的百分率在开花后6～14天逐渐下降,然后陡增,至18天达最大值,接着急剧下降。在开花后第18天此蛋白质电泳分离见到三条明显的带,其余日龄见到二条明显的带。以1MNaCl浸提所得的无论哪一个日龄的材料中这种蛋白质的紫外吸收光谱均为在209 nm处有一较高的吸收峰,245 nm处有一低的吸收峰或一个肩。     

纤维二糖抑制外切纤维素酶水解作用机理的分析

纤维二糖是纤维素分子的结构单元, 也是纤维素酶水解纤维素时的主要产物. 它能强烈抑制纤维素酶的水解作用, 但并不影响酶对纤维素的吸附. 红外、荧光、圆二色谱分析表明, 纤维二糖可结合在外切纤维素酶活性部位附近的色氨酸残基上形成“位阻效应”, 从而阻止纤维素分子链进入活性中心. 同时, 结合纤维二糖后, 外切纤维素酶分子构象发生了较大变化, 致使吸附纤维素后不能导致微纤维的分离, 为“无效吸附”.     

解糖热解纤维素菌F32降解未预处理秸秆及产纤维素酶特性分析

【目的】明确极端嗜热厌氧木质纤维素降解菌解糖热解纤维素菌F32代谢特征,并分析其产酶特性。【方法】使用细胞计数法绘制菌株的生长曲线,使用离子色谱及气相色谱进行产物和残糖量分析,以DNS法及对硝基苯酚法检测菌株胞外蛋白的酶活性。【结果】解糖热解纤维素菌F32在以葡萄糖、微晶纤维素和未经预处理小麦秸秆为碳源时生长状况优于解糖热解纤维素菌DSM 8903。在以葡萄糖为碳源进行培养时,与菌株DSM 8903相比,菌株F32具有产乳酸较多,而产氢气较少的特点。在以微晶纤维素和未经预处理小麦秸秆为碳源进行培养时,与菌株DSM 8903相比,菌株F32胞外蛋白具有较高的内切纤维素酶活性和木聚糖酶活性。【结论】解糖热解纤维素菌F32表现出较强的木质纤维素降解能力,其与DSM 8903的产物组成及胞外蛋白的酶活性具有明显差异。     

棉纤维加厚发育相关物质对纤维比强度的影响

以高、中、低纤维比强度棉花品种科棉1号、美棉33B、苏棉15号和德夏棉1号为材料,研究与棉纤维加厚发育密切相关的可溶性糖、蔗糖和-β1,3-葡聚糖含量动态变化特性及其对纤维比强度形成的影响.结果显示,与中、低强纤维品种相比,高强纤维品种棉花铃龄为10 d时纤维可溶性糖、蔗糖含量高,全铃期内其转化率高且转化彻底,铃龄为24~31 d期间蔗糖累积量高;纤维加厚发育起始期的-β1,3-葡聚糖含量峰值高,其中后期转化迅速而彻底.高强纤维品种棉纤维中可溶性糖、蔗糖和-β1,3-葡聚糖含量动态变化特性利于纤维素累积特性的优化,即快速累积期长、累积速率平缓,易形成高强纤维.研究表明,在物质变化水平上,可溶性糖、蔗糖和β-1,3-葡聚糖含量动态变化特性影响到棉纤维素累积特性,是导致棉纤维比强度品种差异的重要原因.     

新鞘氨醇杆菌属9-1的纤维素酶基因Nspcel8A的克隆表达与酶学特性

木质纤维素转化成燃料酒精是缓解能源和环境危机的途径之一.降低将木质纤维素转化成生物燃料的生产成本,需要提高纤维素酶产量或筛选到具更高酶活性的纤维素酶.新鞘氨醇杆菌(Genus Novosphin-gobium)属于鞘氨醇杆菌科(Sphingomonads),该科的细菌新陈代谢多样化,能够降解有机化合物,也可应用于木质素的降解,但目前新鞘氨醇杆菌属细菌的纤维素酶基因的研究未见报道.本研究对新鞘氨醇杆菌属细菌菌株9-1的纤维素酶基因Nspcel8A进行了克隆表达和酶学特性鉴定.Nspcel8A含有属于糖基水解酶家族8的催化结构域.该酶在大肠杆菌中实现了异源表达并获得了表达产物.Nspcel8A对羧甲基纤维素(car-boxymethylcellulose,CMC)的最适作用pH值和温度分别为4.0和40℃,Nspcel8A具有良好的pH值稳定性,在pH值3.5～11.0范围内放置24 h后能够保持60％以上的酶活力.Nspcel8A对CMC的Km值为10 mg/mL,Vmax为14 μmol·min-1·mg-1.底物特异性测试显示Nspcel8A对CMC有最高的酶活力(8.40 U/mg),但对不可溶纤维维如磷酸膨胀纤维素和Avicel只有较低的酶活力或没有酶活.高效液相色谱法分析显示Nsp-ce18A 不能降解纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖,能把纤维五糖部分降解成纤维二糖和纤维三糖,能把纤维六糖降解为纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖,并以纤维三糖为主.以上结果显示Nspcel8A是一个内切葡聚糖酶,由于它不能水解结晶纤维素,说明它不是Novosphingobium sp.9-1主要的纤维素降解酶.     

极性非质子溶剂中酸强度对纤维素降解制备脱水糖的影响

在极性非质子溶剂中,酸催化剂对于纤维素降解制备脱水糖的反应起到重要作用。本文考察不同强度酸催化剂在极性非质子溶剂1,4-二氧六环中对纤维二糖、纤维素降解制备左旋葡聚糖(levoglucosan, LGA)以及LGA脱水制备左旋葡萄糖酮(levoglucosenone, LGO)的影响。结果表明:酸性过强(pK_a<-3)或酸性过弱(pK_a>-2)的催化剂对脱水糖制备催化性能较差,而pK_a为-3～-2的酸催化剂,如,对甲苯磺酸、甲磺酸、浓硫酸等对纤维素、纤维二糖制备LGA以及LGA脱水制备LGO的反应催化效果较好。以纤维二糖为反应物,甲磺酸为催化剂时,可得到最高的LGA碳收率为45.87%。     

里氏木霉306生物合成t-PA的代谢调节机制的研究

对基因工程菌株里氏木霉 (Trichodermareesei) 30 6生物合成组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)的代谢调节机制进行了研究。在基础发酵条件下 ,L 山梨糖、D 果糖、可溶性纤维素、CMC、麦芽糖、乳糖和棉子糖等单糖及多糖对t PA生物合成都有诱导作用 ,其中L 山梨糖的诱导效果最好 ,加量以 1 .0 %为宜。葡萄糖及其中间代谢产物对t PA的生物合成产生分解代谢物阻遏作用。纤维二糖在低浓度时可以促进t PA的生物合成而在高浓度时对t PA生物合成起反馈阻遏作用     

钙离子浓度对青檀生长和檀皮质量的影响

以Hoagland完全营养液为基质,利用5、10和15mmol·L^-13个Ca^2+浓度处理水平及一个无钙对照处理。对青檀苗木各生物组分积累的钙含量、生物量、密度、纤维长度、纤维宽度和纤维素含量进行测定分析．结果表明。对照处理下的青檀苗大部分死亡,且生长不良,其高生长量仅为有钙处理的50％左右;在有钙处理中,青檀一年苗的高生长和生物量差异不明显,但以10mmol·L^-1钙处理浓度的生长量和生物量最大;Ca^2+促进了根、叶和檀皮中钙的积累,并随着Ca^2+浓度的增加而提高,其分布为根>叶>檀皮;浓度钙处理对青檀木质部和檀皮密度、青檀木质部和檀皮的纤维形态影响不显著,其中10mmol·L^-1钙处理下木质部纤维长度和宽度最大,5mmol·L^-1钙处理下檀皮的纤维长度和长／宽比最大;不同钙处理间,檀皮(韧皮部)纤维均在2．0mm以上,檀皮的纤维长／宽比约为木质部长宽比值的4倍;浓度钙处理对青檀木质部和檀皮中纤维素含量有显著影响,且均以10mmol·L^-1。钙处理下纤维素含量最高．     

酶法制备功能性纤维低聚糖的研究

研究里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C30纤维素酶单一组分EGI、EGII和CBHI降解纤维素的机理及纤维低聚糖酶法制备技术,进而初步研究纤维低聚糖对青春双歧杆菌的增殖作用。以内切葡聚糖酶EGII酶法制备纤维低聚糖,每克纤维素最佳酶用量1 U,最佳酶解时间90 min,制备得到的纤维低聚糖中纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖占总糖的比例分别为43.8%、34.8%和7.9%。以纤维二糖、纤维低聚糖为C源增殖青春双歧杆菌,菌体质量浓度增殖倍数分别为2.14、2.84。     

酿酒酵母异源表达纤维二糖转运蛋白LacY与纤维二糖利用菌株的构建北大核心

【目的】在酿酒酵母体内设计代谢通路,使酿酒酵母能利用纤维素水解产物纤维二糖生产乙醇。【方法】首先,用大肠杆菌DH5α总DNA为模板克隆编码大肠杆菌乳糖透过酶的LacY基因。为过表达LacY基因,以质粒YEplac181作为载体,将酿酒酵母PGK1p强启动子加到LacY基因之前,CYC1t终止子加到LacY基因之后,构建质粒YEplac181-PGK1p-LacY-CYC1t。之后,将纤维二糖转运蛋白LacY表达质粒和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL)表达质粒pRS316-PGK1p-gh1-1-CYC1t依次转入野生型酿酒酵母W303-1A中,使野生型酿酒酵母W303-1A异源表达可转运纤维二糖的LacY蛋白和β-葡萄糖苷酶GH1-1,构建可利用纤维二糖的酿酒酵母工程菌W303-1A GL。最后,通过发酵测定酿酒酵母工程菌W303-1A GL的纤维二糖利用情况和乙醇产量,并对纤维二糖代谢通路中纤维二糖酶活力进行测定。【结果】本研究构建了纤维二糖转运蛋白LacY和β-葡萄糖苷酶GH1-1协同表达的酿酒酵母工程菌W303-1AGL。W303-1AGL可以有效利用纤维二糖发酵生产乙醇,W303-1A GL发酵24 h时乙醇产量达到3.25 g/L,得率为0.325 g乙醇/g纤维二糖,利用葡萄糖产乙醇理论得率为0.511 g乙醇/g纤维二糖,达到葡萄糖产乙醇理论得率的64%,细胞密度最高在第54 h达到OD600=10.84,胞内β-葡萄糖苷酶的酶活在72 h最高,可达到0.51 U/mg。【结论】本研究成功构建了能有效利用纤维二糖的重组酿酒酵母工程菌W303-1A GL,为提高纤维素乙醇生产效率、降低纤维素乙醇生产成本提供了新思路。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节I.槐糖对木霉EA3-867纤维素酶形成的诱导作用

在槐豆荚提取液中分离到白色针状的槐糖结晶,该糖对拟康氏木霉(Trichoderma pseudo-Koningii Rafai) EA3-867的纤维素酶(C1和Cx)有强力的诱导作用。在纤维素酶活力,尤其是产酶速度上明显超过纤维素的诱导作用。槐糖的诱导作用与添加槐糖的时间和菌种有关,并受甘油强烈阻遏。在以纤维二糖(0．5％)为碳源培养时,木霉EA3-867也能较迅速地形成纤维素酶,但在EA3-867的甘油培养物中加入纤维二糖(5×10-3M)并不能诱导Cx酶。槐糖和纤维素对纤维素酶的诱导作用,无论在诱导胞外和胞内纤维素酶的成分上或从凝肢电泳图上,都十分相似。作者认为木霉EA,一867的纤维素酶形成同时受诱导一阻遏机制调节,并对组成型和诱导型的纤维素酶的作用,以及固体纤维素对纤维素酶可能的诱导机制作了推测。     

哈氏噬纤维菌吸附纤维素的影响因素

[目的]探索哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)吸附纤维素的作用机制.[方法]通过比较不同因素对哈氏噬纤维菌吸附纤维素的影响,包括:菌龄、pH、温度、表面电荷、细胞活力、细胞表面蛋白、细胞表面多糖以及纤维素类似物等,寻找在吸附过程中起重要作用的细胞成分.[结果]菌体经蛋白酶及热处理,对纤维素的吸附能力完全丧失;叠氮化钠、甲醛和戊二醛处理对菌体吸附能力影响不明显;菌体经刚果红和高碘酸钠处理,吸附能力变化不大;菌体对纤维素底物的吸附具有特异性,吸附作用不受纤维二糖和羧甲基纤维素的抑制.[结论]实验表明,哈氏噬纤维菌吸附纤维素的能力与菌体表面蛋白密切相关,而受细胞的代谢活性和胞外多糖影响较小,推测细胞表面可能存在特异性的纤维素结合蛋白.     

绿色木霉纤维素酶系中C1酶的提纯与性质

从绿色木霉(Trichoderma viride) X2-85的麸曲抽提液中,分离出纤维素酶系中的C1酶,经纯化后,用聚丙烯酰胺凝腔电泳和超速离心鉴定,都为均一蛋白。在我们的实验条件下,它对羧甲基纤维素、3-葡萄糖苷及纤维二糖,都不表现活性。该酶能降解徽晶纤维紊、磷酸膨胀纤维素和脱脂棉,主要产物是纤维二糖。用Sephadex G一100凝胶过滤和SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量,分别为54,000和55,000。其沉降系数为4.18。     

能源上的应用

<正> 854204 用不同的酵母菌株进行纤维糊精发酵[英]/Gonde,P.…//Appl.Environ.Microbiol.-1984,48(2).-256～269[译自DBA,1984,3(21),84-10295]采用8种能使纤维素二糖发酵的菌株,研究了纤维糊精的发酵。纯圆假丝酵母和异酒香酵母只能发酵葡萄糖和纤维二糖,其培     

β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达

应用表面表达技术对来自Trichodermareesei的β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母表面的表达及后期性质进行了研究。实验结果表明酵母表面表达酶有活性,该酶的最佳诱导时间为24h,最适温度是70℃,而酶活的最适pH是5．5。使异源表面表达了Bgl1的酵母在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长,发酵结果表明纤维二糖被明显利用了,但在培养186h后,发酵液中仍残留一定量的纤维二糖。这种技术对纤维素发酵系统中纤维二糖酶活性低的现状有所帮助。     

常压甘油自催化预处理麦草浓醪发酵纤维素乙醇

目前纤维素乙醇成本偏高的根本原因在于没有达到淀粉质乙醇发酵水平的"三高"(高浓度、高转化率和高效率)指标,提高水解糖液浓度和避免发酵抑制物来实现浓醪发酵,是解决问题的关键。文中以常压甘油自催化预处理麦草为底物,尝试采用不同发酵策略,探讨其浓醪发酵产纤维素乙醇的可行性。在优化培养条件(15%底物浓度,加酶量30 FPU/g干底物,温度37℃,接种量10%)下同步糖化发酵72 h,纤维素乙醇产量为31.2 g/L,转化率为73%,发酵效率0.43 g/(L·h);采用半同步(预酶解24 h)糖化发酵72 h,纤维素乙醇浓度达到33.7 g/L,转化率为79%,发酵效率为0.47 g/(L·h),其中(半)同步糖化发酵中90%以上纤维素已被糖化水解用于发酵;采用分批补料式半同步糖化发酵,补料到基质浓度相当于30%,发酵72 h时纤维素乙醇产量达到51.2 g/L,转化率为62%,发酵效率为0.71 g/(L·h)。在所有浓醪发酵中乙酸不足3 g/L,无糠醛和羟甲基糠醛等发酵抑制物。以上结果表明,常压甘油自催化预处理木质纤维素基质适用于纤维素乙醇发酵;分批补料式半同步糖化发酵策略可用来进行浓醪纤维素乙醇发酵;未来工作中提高基质纯度和强化酶解产糖是浓醪纤维素乙醇达到"三高"指标的关键。     

木质纤维素稀酸水解糖液乙醇发酵研究进展

以木质纤维素为原料生产燃料乙醇,首先要对原料进行预处理得到可发酵糖,在稀酸水解木质纤维素得到的糖液中,除含有葡萄糖、木糖等六碳糖和五碳糖外,根据水解温度、酸浓度和时间的不同,还含有不同浓度的发酵抑制剂。因此,在研究木质纤维素稀酸水解糖液的乙醇发酵中,对代谢木糖成乙醇的菌种的研究、对耐/代谢发酵抑制剂微生物的研究、对稀酸水解糖液的脱毒方法的研究以及对稀酸水解糖液不同发酵方式的乙醇发酵研究等非常重要。重点介绍了以上几个方面近几年研究的进展。     

双碳源单细胞蛋白高密度培养

单细胞蛋白(SCP)培养具有增殖速度快、原料来源广、蛋白质含量高等优点,正在成为重要的蛋白质来源之一。生产SCP的原料包括烷烃、低碳醇类及碳水化合物。由碳水化合物,尤其是由各种农副产品加工的废料、造纸工业废水及木质纤维素水解产物等,生产SCP属于废弃资源的综合利用,具有重要的经济和社会意义。这类原料中常含有多种碳源,例如,在木质纤维水解液中,有以木糖为主的五碳糖,也有以葡萄糖为主的六碳糖,木糖与葡萄糖之比约为1:2。这样,木糖的利用就成了一个关键问题。葡萄糖对木糖代谢的抑制作用随葡萄糖比例的降低而减轻;Slinger和Bothast研究了用混合糖培养Candida shehetane的过程,当木糖与葡萄糖的比例为3:1及1:1时,葡萄糖的利用速度分别比木糖高1.6倍及3.4倍;在低还原势时,酵母产酒精速率降低而细胞增长速率加快,可以达到较高细胞浓度。