布氏鲳鲹CCK基因的克隆及表达分析

缩胆囊素(cholecystokinin, CCK)已被证实是生物体中一类能抑制食欲的重要的细胞因子,为进一步补充鱼类CCK基因相关的生物信息,本研究利用RACE技术和PCR方法对布氏鲳鲹(Trachinotus blochii)CCK基因进行了克隆和组织表达模式研究。结果表明:布氏鲳鲹CCK基因cDNA序列全长822 bp,5'端、3'端非翻译区(untranslated regions, UTR)长度分别为70 bp和340 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF)412 bp,共编码137个氨基酸,其中包括一个信号肽和一个CCK-8肽。预测的蛋白分子量为14.79 kD,理论等电点是5.89。氨基酸序列同源性比对及系统进化树表明,布氏鲳鲹CCK基因与其与同属鲈形目的鰤鱼的同源性最高(91.9%),并且与其聚为一支。实时荧光定量PCR (real time-PCR, RT-PCR)分析显示CCK在布氏鲳鲹的端脑高表达,垂体、肌肉和下丘脑相对表达丰富,肾脏、脾脏、肠和脂肪中低表达,证实了CCK在布氏鲳鲹的神经和消化系统中可能具有重要的调节功能。本研究结果可为今后进一步探讨布氏鲳鲹CCK基因的摄食调控功能提供理论参考。     

布氏鲳鲹VEGFA基因克隆与组织表达分析

血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)主要生理功能是增加小静脉血管与微血管的通透性,是血管生成过程最重要的正向调控因子。本研究采用RACE技术克隆布氏鲳鲹VEGFA基因和实时荧光定量PCR方法对该基因进行组织分布表达分析。结果显示,该VEGFA基因cDNA序列全长1 470 bp,5’UTR、3’UTR长度分别为617 bp和208 bp,ORF为645 bp,共编码214个氨基酸,其中包括一个信号肽和两个N-糖基化位点。理论分子量为25.23 kD,等电点为8.91。同源性分析结果表明,布氏鲳鲹VEGFA基因与同属鲈形目鱼类高体鰤的同源性最高(96.1%)。荧光定量PCR分析显示,VEGFA在布氏鲳鲹组织中均有表达,其中肝脏表达水平最高,其次是心脏,在小脑、胃、肠表达较低,在肾脏组织中的表达量最低,说明布氏鲳鲹VEGFA基因在生理代谢以及血管生成过程中可能发挥重要调节作用。本研究结果为深入研究布氏鲳鲹VEGFA基因的生理代谢调控功能提供理论依据。     

人甘丙肽2型受体基因启动子的克隆与初步功能分析

人甘丙肽2型受体(GalR2)作为G蛋白偶联受体,其功能已被广泛研究,但GalR2基因的转录调控机制尚不明确.我们利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增人GalR2基因上游1121bp的片段,再通过PCR方法将其缺失成3段长度不等的片段,然后分别将其克隆到荧光素酶报告基...     

布氏鲳鲹GHRH基因克隆、组织和胚胎表达模式

促生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)主要生物学功能是刺激垂体细胞分泌生长激素,已被证实是动物体生长轴的重要调控因子之一,布氏鲳鲹是一种生长快速的海洋鱼类,为了揭示其代谢旺盛的调节机制,本研究从GHRH入手,利用RACE技术和qPCR方法对布氏鲳鲹GHRH基因进行了克隆、组织和胚胎表达模式研究。实验结果显示,布氏鲳鲹GHRH基因cDNA序列全长1019bp,5’UTR、3’UTR长度分别为327 bp和164 bp,开放阅读框528 bp,共编码175个氨基酸;同源性分析结果表明,布氏鲳鲹GHRH基因与其它鲈形目鱼类的同源性在91%以上。布氏鲳鲹GHRH基因的表达区域大多都集中在中枢系统,其中下丘脑表达量最高;GHRH在受精卵期到后续发育过程中均检测到表达,其表达水平在仔鱼期达到最高。序列分析、组织及胚胎表达的结果表明,布氏鲳鲹GHRH的调节模式仍然可能通过下丘脑调节垂体释放GH,GHRH在个体发育的较早阶段即开始发挥作用。本研究掌握了布氏鲳鲹GHRH基因的基本规律,为进一步研究生长轴的调控提供了理论参考。     

甘丙肽家族及其受体的功能

甘丙肽家族包含甘丙肽(galanin)、甘丙肽信息相关肽(galanin-message-associated peptide,GMAP)、甘丙肽样肽(galanin-like peptide,GALP)和alarin。目前已经克隆了三种甘丙肽受体,分别是GalR1、GalR2、GalR3,它们都是G蛋白偶联受体。三种受体具有不同的分布特征,介导不同的生理过程。甘丙肽及其受体在生物体内中枢神经系统和外周神经系统中分布广泛,参与学习和记忆、焦虑行为、痛觉调节、摄食活动、渗透平衡、神经损伤修复和神经保护、胃肠道活动以及皮肤炎症处理等多种生理过程。这些生理功能提示甘丙肽及其受体可能在多种疾病的病理过程中发挥着潜在的作用,如阿尔茨海默氏病、癫痫、酗酒、糖尿病、神经性疼痛、抑郁症和癌症。     

营养状态影响大鼠味蕾甘丙肽及其受体mRNA的表达

机体的营养代谢状态参与调制外周味觉信息的整合,影响外周味觉感受和食物摄入。味蕾上的味觉受体及神经递质都是营养状态调节味觉感知的重要靶点。本文旨在探讨营养状态对味蕾上的重要神经递质甘丙肽及其受体表达的影响。我们比较了高脂饮食诱导的肥胖大鼠、慢性限制性饮食大鼠、以及正常膳食大鼠味蕾水平甘丙肽及其受体2 (galanin receptor 2,GalR2)mRNA表达水平的差异,以探讨机体营养代谢状态是否通过调控味蕾水平甘丙肽的表达来影响味觉感知。分别给予各组大鼠6周的高脂饮食、半量饮食和正常饮食,检测其体重、血糖、血脂等代谢相关指标,用real-time PCR方法检测其味蕾甘丙肽与GalR2 mRNA的表达变化。结果显示:与对照组相比,高脂饮食大鼠的体重显著增加,血清甘油三酯及血糖水平显著增高,味蕾水平甘丙肽与GalR2的mRNA表达水平显著降低,而慢性限制性饮食大鼠味蕾甘丙肽的mRNA表达增高,是对照组的2.3倍。结合以前的研究,我们可以得出初步结论:高脂饮食诱导的肥胖大鼠味觉感受行为学的变化可能与味蕾甘丙肽及其受体的表达变化存在相互关系。味蕾水平的甘丙肽及其受体GalR2参与营养状态调控大鼠味觉感知及摄食行为的外周机制。     

甘丙肽受体的研究进展

目前已经克隆了3种甘丙肽受体（GalR1, GalR2, GalR3）,它们都是与G蛋白相偶联的受体.3种甘丙肽受体的氨基酸序列、药理学特性以及第二信使系统各不相同.GalR1/3受体可以抑制腺苷酸环化酶并可以激活钾通道,GalR2受体可以激活磷脂酶C并增加胞内钙离子浓度.用RNA印迹、反转录PCR以及原位杂交等技术对上述3种甘丙肽受体在人、大鼠和小鼠中的分布进行了研究,发现它们具有不同的分布特征,提示不同的甘丙肽受体可能参与不同的生理过程.     

甘丙肽及其受体在嗅成鞘细胞中的表达及对细胞增殖的影响

本实验从新生大鼠嗅球中分离出嗅成鞘细胞,进行体外培养。运用RT—PCR方法检测甘丙肽及其受体在体外培养的嗅成鞘细胞中的表达;运用MTT法检测甘丙肽及其受体激动剂、拮抗剂对嗅成鞘细胞增殖的影响。结果显示：嗅成鞘细胞表达甘丙肽(GAL)及其受体GalR2,而不表达其他两种受体GalRl和GalR3;甘丙肽及两种受体激动剂GALl-11和GAL2-11能够明显地抑制体外培养的嗅成鞘细胞的增殖,这一效应可被非特异性甘丙肽受体拮抗剂M35所阻断。     

甘丙肽及其受体在嗅成鞘细胞中的表达及对细胞增殖的影响

本实验从新生大鼠嗅球中分离出嗅成鞘细胞,进行体外培养。运用RT-PCR方法检测甘丙肽及其受体在体外培养的嗅成鞘细胞中的表达;运用MTT法检测甘丙肽及其受体激动剂、拮抗剂对嗅成鞘细胞增殖的影响。结果显示:嗅成鞘细胞表达甘丙肽(GAL)及其受体GalR2,而不表达其他两种受体GalR1和GalR3;甘西肽及两种受体激动剂GAL1-11和GAL2-11能够明显地抑制体外培养的嗅成鞘细胞的增殖,这一效应可被非特异性甘丙肽受体拮抗剂M35所阻断。     

卵形鲳鲹组织蛋白酶B基因的克隆及表达分析

为研究卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)组织蛋白酶B(Cathepsin B, CatB)基因的表达特征和功能, 应用RT-PCR和RACE技术获得卵形鲳鲹CatB(TroCatB)基因的全长cDNA。TroCatB cDNA全长为2181 bp。其中5′UTR和3′UTR分别为391和797 bp, ORF为993 bp, 推定编码330个氨基酸残基, 推定分子质量和理论等电点分别为36.37 kD和5.73。蛋白结构预测TroCatB蛋白具有信号肽(1Met-18Ala)、前体肽(25Leu-64Gly)和一个典型木瓜蛋白酶家族半胱氨酸结构域, 含107Cys、277His、297Asn 3个蛋白酶催化活性位点。同源性分析显示TroCatB蛋白与其他脊椎动物的同源性为67.0%—90.9%, 成熟肽区与其他脊椎动物的同源性为73.7%—92.4%。NJ系统发育树显示卵形鲳鲹和其他鱼类聚为一支, 与髙体鰤距离最近。实时荧光定量PCR检测TroCatB基因mRNA在健康卵形鲳鲹各组织中均有表达, 在脾脏中表达最高; 在溶藻弧菌感染后, TroCatB基因在脾脏、头肾组织中的mRNA表达水平显著上调(P<0.05), 脾脏在感染6h后, 其表达量达到峰值, 头肾则是在12h达到峰值。以上结果表明, TroCatB蛋白的结构域和催化活性位点在遗传进化过程中保守, TroCatB基因参与了机体对细菌免疫的相关生理活动, 在卵形鲳鲹先天性免疫防御中发挥重要作用, 为进一步阐明TroCatB在免疫过程中的功能以及其对病原的抗病机理提供参考。     

小鼠甘丙肽1型受体在HEK293A细胞中的表达和内化

目的:克隆小鼠甘丙肽1型受体( mGalR1)基因,构建其真核表达载体,并观察该基因在HEK293A细胞中的表达和内化.方法:应用RT - PCR方法,以小鼠下丘脑RNA为模板,扩增获得甘丙肽Ⅰ型受体(mGalR1)基因并定向克隆到pEGFP - N1真核表达载体;mGalR1 - pEGFP表达载体瞬时转染HEK293A细胞,利用激光共聚焦显微技术观察mGalR1在给予甘丙肽(10-7mol/L)0、5、10、15min刺激时的内化情况.结果:克隆得到正确的mGalR1基因全长序列,其cDNA为1047bp,共编码348个氨基酸;共聚焦显微镜结果表明mGalR1主要在膜上表达,经甘丙肽刺激5～15min后受体下膜进入胞浆.结论:成功构建真核表达载体mGalR1 - pEGFP并在HEK293A中表达;在甘丙肽刺激下小鼠甘丙肽1型受体存在内化现象.     

禁食及进餐前后对布氏鲳鲹缩胆囊素表达的影响

缩胆囊素(cholecystokinin, CCK)是生物体中抑制生物食欲的饱食信号因子,布氏鲳鲹属于摄食代谢十分旺盛的鱼类,揭示其CCK的表达规律能够进一步揭示鲳鲹的代谢机制。本研究开展了布氏鲳鲹禁食及餐前餐后养殖实验,并利用荧光定量PCR技术对布氏鲳鲹的缩胆囊素的表达模式进行了分析。在餐前餐后实验中,结果表明布氏鲳鲹下丘脑中的CCK的表达量在餐后0 h迅速上升达到峰值,随后在餐后1 h、3 h逐渐下降,并在+3 h下降至对照组水平。在禁食实验中,下丘脑中CCK的表达量在禁食阶段逐渐降低并在第5天下降至显著低于对照组,复投喂后在第7天又上升到对照组水平并保持至第11天。布氏鲳鲹CCK的表达对于饱食的信号反馈非常迅速,CCK的高表达与鲳鲹食欲控制相关。本研究结果可以为进一步研究布氏鲳鲹CCK基因的功能及调控提供理论参考。     

甘丙肽2型受体在HEK293细胞中的表达及内化过程

构建了在甘丙肽2型受体(GalR2)N端带myc表位标签的真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。Western blot结果发现转染组myc-GalR2蛋白水平呈高表达。myc-GalR2主要分布在细胞膜上,少量分布于胞浆中。当给予甘丙肽(10-7mol/L)刺激后,5min时可见细胞膜上myc-GalR2明显减少,胞浆内myc-GalR2增多,15min时膜上myc-GalR2几乎全部消失。表明GalR2受体与配体结合后发生内化,且受体蛋白内化为时间依赖性的转运过程,证实在HEK293细胞GalR2会出现配体依赖性内化。同时,以已知膜蛋白5-HT1AR的内化作为对照,可见在给予甘丙肽刺激以后,5-HT1AR没有发生内化,受体蛋白仍然表达在膜上。此外,通过测定胞内钙水平激活情况来检测其信号通路激活情况,表明myc对GalR2功能没有明显影响。     

油菜BnMKK2基因的克隆及表达分析

通过实验从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAPK激酶基因BnMKK2基因的cDNA,全长1 344 bp,其中包括5′非翻译区（5′UTR）111 bp,3′非翻译区（3′UTR）165 bp,开放阅读框（ORF）长1 068 bp,编码355个氨基酸,该基因编码的蛋白质分子量为39.3 kDa,理论等电点为6.8。与拟南芥AtMKK2有很高的同源性,因此命名为BnMKK2(GenBank登录号:HQ848661)。该基因实时荧光定量PCR分析表明,BnMKK2基因的表达受低温胁迫诱导。     

油菜BnHMGB2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的BnHMGB2基因的cDNA,全长823 bp,其中包括438 bp的开放阅读框,131 bp的5′非翻译区（5′UTR）,253 bp的3′非翻译区（3′UTR）。与拟南芥AtHMGB2的同源性达到了87.4%,因此命名为BnHMGB2(GenBank登录号：JN807314)。该基因编码145个氨基酸的蛋白质,分子量15.9 KDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR结果表明该基因在油菜根、茎、叶、下胚轴均有表达,根中表达量最高。同时,该基因的表达受低温胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

牦牛BLG基因5'调控成分的克隆及序列分析

目的:克隆牦牛β-乳球蛋白(BLG)基因5'调控成分(3.5kb).方法:利用PCR方法克隆了牦牛BLG基因5'侧翼区,并进行生物信息学分析表明.结论:获得了3.5kb的BLG基因5'调控成分,其中包括5'侧翼区(2 472bp),第一外显子及第一内含子(1 066bp).该序列与牛、绵羊和山羊的同源性分别为98.42%、89.61%和84.41%;平均GC含量为49.3%;存在一个CpG岛;可能存在一个启动子位点,位于起始密码子前-83bp处;AliBaba2.1分析发现该区域有47种潜在的转录因子结合位点,其中包括乳蛋白结合因子(MPBF)、乳腺活化因子(MAF)、糖皮质激素受体(GR)、雌激素受体(ER)、核因子1(NF-1)等结合位点,提示该调控成分可用于构建乳腺特异性表达载体.结果:成功克隆出BLG基因5'侧翼区,为构建转基因牦牛乳腺生物反应器的特异性表达载体奠定基础.     

家兔BMP7基因的克隆及其生物信息学分析

在对已知部分编码序列(CDS)进行分析的基础上, 采用RT-PCR分步扩增以及RACE方法, 对家兔BMP7基因3′和5′末端未知序列进行了克隆与生物信息学分析。测序结果综合分析表明, 所获序列共计1 654 bp, 包括家兔BMP7近全长前肽、全长成熟肽CDS及3′非翻译序列(3′UTR), 将已有的序列向5′和3′端分别延伸了395 bp和628 bp。序列对比表明, 克隆的家兔BMP7 CDS部分与人、小鼠的对应序列的同源性分别为91.89%和89.32%, 预测的氨基酸序列同源性分别为96.51%和96.01%。家兔BMP7 3′UTR长446 bp, 与人、小鼠对应序列同源性分别为57.38%和45.57%; 具有2个转录终止信号位点。推测家兔BMP7成熟蛋白有BMPs特有的7个位置固定的半胱氨酸残基和TGF-β家族指纹。家兔BMP7 3′UTR区转录终止信号的可选择性可能与基因转录后调控有关。     

油菜BnMKK4全长基因的克隆及表达分析

从‘陇油6号’油菜中克隆得到了一个新的BnMKK4基因的cDNA,全长1317bp,其中包括993bp的开放阅读框,159bp的5’非翻译区（5^1UTR）,165bp的3。非翻译区（3’UTR）。与拟南芥AtMKK4有很高的同源性,因此命名为BnMKK4（GenBank登录号JF268686）。该基因编码330个氨基酸的蛋白质,分子量36．5kDa,等电点为9．01。实时荧光定量PCR结果显示该基因表达受低温胁迫和盐胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫和盐胁迫的过程中发挥作用。     

卵形鲳鲹耐低温候选基因△6FAD全长cDNA序列的克隆与表达分析

采用c DNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了卵形鲳鲹△6脂肪酸去饱和酶(△6FAD)的c DNA全长序列,并对其基因和蛋白序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了该基因在不同温度条件下的表达差异及低温下的时序表达模式。结果显示,卵形鲳鲹△6FAD基因c DNA序列全长1 908 bp,其中开放阅读框为1 329 bp,3'非编码区431 bp,5'非编码区135 bp,共编码442个氨基酸;其编码蛋白属于疏水性蛋白,无信号肽特征,含有大量蛋白质二级结构和该家族典型的组氨酸富集区及细胞色素b5结构域。系统进化分析表明,卵形鲳鲹△6FAD基因与尖吻鲈、军曹鱼的△6FAD基因在进化关系上最为接近,其次是大菱鲆、蓝鳍金枪鱼和点带石斑鱼,但与斑马鱼、小鼠和人△6FAD基因进化关系较远。实时荧光定量PCR结果表明,该基因的表达与环境温度和胁迫时间存在明显相关性,其表达水平在降温过程中随温度降低而先缓慢下降后又迅速升高,在不同的低温环境下表现出不同的时序表达模式:13℃时,随时间延长该基因的表达量呈现先降低后又升高至原来水平的变化趋势,16℃和19℃时则表现出一种随时间延长逐渐降低的反馈式调节方式。     

柠条锦鸡儿CkGR基因克隆及功能分析

通过RACE技术从柠条锦鸡儿中克隆得到一个新的GR基因,全长2 122 bp,包括5'非翻译区(5'-UTR)57 bp,3'非翻译区(3'-UTR)415 bp,开放阅读框(ORF)1 650 bp,编码550个氨基酸,推测的蛋白质分子量为59.2k Da,理论等电点为8.2,命名为Ck GR。Ck GR与鹰嘴豆Ca GR的同源性较高,为90.1%。利用染色体步移法克隆得到Ck GR起始密码子ATG上游648 bp的启动子序列,Plant CARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,Ck GR在柠条锦鸡儿的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;Ck GR的表达受低温、高盐和干旱胁迫的诱导,表明Ck GR在柠条锦鸡儿适应低温、高盐和干旱胁迫的过程中发挥作用。