梭梭NAC转录因子HaNA C3～4的克隆及表达分析

本研究从梭梭中克隆了2条NAC基因,分别命名为序列Ha NAC3(KU534095)和Ha NAC4(KU534-096)。序列分析显示Ha NAC3基因编码一条242个氨基酸的多肽,Ha NAC4基因编码一条287个氨基酸的多肽,并且编码的蛋白都为亲水性蛋白。经过同源性比对分析发现2条序列都含有典型的NAC结构域,属于NAC转录因子家族。组织特异性表达分析结果显示Ha NAC3序列在梭梭根部有较高强度的表达;Ha NAC4在梭梭种子中表达量较高。干旱胁迫下,Ha NAC3和Ha NAC4呈现出不同的表达方式,本研究有助于为进一步分析梭梭NAC家族基因功能提供帮助。     

菠菜14-3-3蛋白基因的克隆及硝酸盐胁迫下的表达分析

利用RT-PCR和RACE技术,从菠菜中首次获得了14-3-3蛋白基因的全长cDNA序列(GenBank登录号JX952165),命名为So14-3-3.该基因全长1 166 bp,开放阅读框801 bp,编码266个氨基酸.序列比对发现So143 3蛋白与其他植物14-3-3蛋白氨基酸序列一致性高达77.6％～84.7％.半定量RT-PCR表明,随NO3-胁迫处理时间的延长和浓度的增加,菠菜根和叶中So14-3-3基因的表达增强.实验构建了pGEX4T-So14-3-3原核表达载体,并通过IPTG诱导后获得分子量约为56 kD的蛋白.进一步的蛋白质印迹检测结果表明,随着NO3处理时间的延长和浓度的增加,So14-3-3蛋白表达也增加.该实验结果为进一步研究So14 3-3蛋白功能提供了基本的实验基础.     

柞蚕14-3-3基因的鉴定及表达分析

14-3-3蛋白是一种可以改变其结合蛋白构象的酸性蛋白质.柞蚕14-3-3 cDNA序列全长1 220 bp,包括一个126 bp的5'非编码区和一个350 bp的3'非编码区.该基因的开放读码框长度为744 bp,编码247个氨基酸.序列比对结果表明,柞蚕14-3-3蛋白与家蚕的14-3-3蛋白具有高度同源性.此外对柞蚕14-3-3基因进行了原核表达和重组蛋白纯化.SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,分子量大小约32 kD的重组蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

两个小麦14-3-3基因的特征、亚细胞定位及其对非生物胁迫的响应(英文)

为了探讨14-3-3基因在小麦逆境胁迫应答中的调控作用,利用RACE技术克隆了两个包含完整编码框的14-3-3基因(命名为Ta14R1和Ta14R2),其中Ta14R1 cDNA长999 bp,编码262个氨基酸,而Ta14R2 cDNA长897 bp,编码261个氨基酸。Ta14R1/Ta14R2-GFP融合载体瞬时表达结果显示,Ta14R1和Ta14R2蛋白均定位于细胞质和细胞膜,但不在叶绿体中。荧光定量PCR分析表明,Ta14R1和Ta14R2均在萌发1 d的胚芽鞘中表达量最高;在高温、低温、模拟干旱和ABA处理下,两个基因在小麦的根和叶中都受胁迫诱导而且显著上调表达,推测这两个14-3-3基因通过依赖ABA的非生物胁迫响应途径发挥作用,可能参与了小麦中高温、低温和干旱胁迫的耐受调节过程。     

梭梭肌动蛋白基因HaACT1全长的克隆与表达分析

根据本实验已克隆得到的梭梭肌动蛋白基因Ha ACT1部分序列,通过5'RACE技术获得HaA CT1的cDNA全长序列。序列分析表明,该基因c DNA全长序列1 534 bp,其中5'UTR序列为75 bp,3'UTR序列为325 bp,开放阅读框序列为1 134 bp,编码376个氨基酸。该序列与Gen Bank中收录的其它植物Actin基因核苷酸序列的相似性均在84%以上,并且它们的氨基酸序列的相似性达95%以上,Gen Bank登录号为KM886609。根据得到的c DNA序列设计全长引物,进一步克隆了Ha ACT1的基因组DNA序列,由4个外显子和3个内含子组成。利用半定量和绝对荧光定量PCR对Ha ACT1的表达进行分析,发现该基因在梭梭的不同组织及各种非生物胁迫下均能稳定表达,适合作为梭梭中其它功能基因表达研究中的内参基因。     

梭梭NAC转录因子HaNAC38、HaNAC42克隆及表达分析

本研究从梭梭中克隆得到2个NAC转录因子,分别命名为Ha NAC38和Ha NAC42。Ha NAC38读码框长879 bp,编码292个氨基酸;Ha NAC42读码框长582 bp,编码198个氨基酸。序列比对显示Ha NAC38和Ha NAC42均含有NAC家族的A、B、C、D、E保守结构域。荧光定量PCR分析结果显示,梭梭(Haloxylon ammodendron,H.ammodendron)幼苗中Ha NAC38和Ha NAC42基因在干旱、高盐、IAA、ABA处理以及高温胁迫条件下的表达模式并不完全相同,为进一步研究梭梭NAC转录因子功能和调控机制打下基础。     

梭梭中HaDREB2A的克隆与表达分析

脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子在应激反应相关基因的调控中起重要作用。本研究利用RT-PCR方法从梭梭组织中获得Ha DREB2A基因开放阅读框(ORF)全长(Gen Bank登录号为:KP765243)。生物信息学分析表明,该基因ORF长1 083 bp,编码360个氨基酸,蛋白的分子量为40.5 k D,理论等电点(p I)为5.07,该蛋白在90(K)~143(R)区域含有一个典型的AP2保守结构域。通过物种间系统发育树可以看出Ha DREB2A与Sb DREB2A进化关系最接近,二者属于同一进化分支。半定量RT-PCR表达模式分析显示,该基因在梭梭同化枝、根、茎、花和种子中均有表达,且在同化枝中的表达量最高,并且受干旱、高盐和外源ABA的诱导。     

二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出1个硫氧还蛋白基因全长cDNA序列。基因全长1138bp,其中,5’非翻译（UTR）区128bp,3＇非翻译区212bp,开放阅读框（ORF）全长798bp,编码265个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．58kDa,理论等电点（pI）为9．68。BlastP分析表明二色补血草Trx与拟南芥Trx序列同源性为52％,与葡萄7h序列同源性为76％,从11个物种的氨基酸多序列比对可以看出Trx氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测低温、NaCl和PEG胁迫不同时间后的基因在二色补血草中表达模式的结果表明,NaCl能诱导Trx基因在二色补血草叶中表达,胁迫24h后达到高峰,而聚乙二醇和低温处理则抑制Trx在二色补血草根和叶的表达。     

团头鲂(Megalobrama amblycephala)caspase3基因克隆及其在高温胁迫中的表达分析

采用RACE技术克隆获得团头鲂caspase3基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,团头鲂caspase3基因全长为2 077 bp,开放阅读框长837 bp,5'非编码区长155 bp,3'非编码区长1 085 bp,命名为Ma Casp3。推测该基因编码278个氨基酸,预测分子量为30.92 ku,理论等电点为6.15。同源性和系统进化分析发现,Ma Casp3基因与斑马鱼(Danio rerio)caspase3氨基酸相似性最高,与其他节肢动物caspase3家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,Ma Casp3基因在肝脏中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。与常温对照组相比,高温胁迫7 d后该基因在团头鲂肝脏中的表达量显著升高,表明Ma Casp3基因可能参与团头鲂高温胁迫的应答并引发细胞凋亡级联反应。此外,高温胁迫7 d与胁迫前比较团头鲂幼鱼肝脏组织呈现肝细胞肿大、混浊变性、细胞核溶解、肝细胞空泡化现象,因此实际生产中应密切关注养殖水体水温变化以减少温度应激导致的组织损伤。     

刚毛柽柳ThGRF2基因的克隆和渗透胁迫应答分析

14-3-3蛋白通常也称为通用调节因子（general regulatory factors,GRF）,是一类丝氨酸和苏氨酸磷酸化结合蛋白,通过与其他转录因子或信号蛋白相互作用参与调节细胞内基础代谢、信号传导、参与植物生长发育以及环境胁迫应答等一系列生理过程。本研究从刚毛柽柳干旱转录组中克隆获得一条干旱胁迫差异表达的ThGRF2基因。ThGRF2基因CDS片段全长为786 bp,编码261个氨基酸。相对分子质量为29.40 kDa,理论等电点（pI）为4.76。将ThGRF2基因构建到pROK2过表达载体上,瞬时转化刚毛柽柳,渗透胁迫前后生理指标结果显示,渗透胁迫后ThGRF2过表达提高了转基因柽柳的叶绿素含量、SOD和POD活性,降低了丙二醛（MDA）含量、电导率（EL）和失水率,表明ThGRF2基因在刚毛柽柳渗透胁迫应答中起重要作用。为进一步探究刚毛柽柳ThGRF2基因的非生物胁迫耐受性功能奠定基础。     

小麦富含亮氨酸重复（LRR）蛋白基因TaLRI1的克隆及其特征分析

在水分胁迫反应基因表达谱分析的基础上,采用RACR技术,从‘洛旱2号’小麦中克隆了一个编码富含亮氨酸蛋白的cDNA全长,命名为TaLRI1。序列分析显示,TaLRI1的cDNA全长为2657bp（GenBank登录号为GU593320）,其中5＇-非翻译区47bp,3＇-非翻译区1314bp,开放阅读框1296bp,可编码431个氨基酸。进一步分析显示,TaLRI1基因编码的蛋白具有典型的富含亮氨酸N末端保守域和富含亮氨酸的核酸酶抑制因子保守域,该蛋白为弱酸性蛋白,等电点为5.69,无明显的疏水/亲水区域。三维结构预测显示,TaLRI1蛋白以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为骨架,可形成弧状的螺线管结构以及一对侧臂凸起。RT-PCR分析表明,水分胁迫过程中,TaLRI1基因在根系中的表达量呈先升高后降低的趋势,以胁迫处理12h的表达量最高,推测该基因在水分胁迫反应过程中发挥重要功能。     

梭梭小G蛋白基因HaRAN1克隆与表达分析

采用cDNA-AFLP技术从梭梭中获得了一个干旱诱导的TDF序列,编码RAN基因的cDNA片段,利用5'-RACE和3'-RACE技术克隆到一个1 083 bp的全长基因,含有一个编码221个氨基酸的开放阅读框,具有结合GTP/GDP的4个保守结构域,属于RAN1亚家族,命名为HaRAN1.Blast分析表明,HaRAN1与单、双子叶植物(毛果杨、拟南芥、小麦、水稻)的一致性高达95%~96%以上;与哺乳动物(人类)和真菌(烟曲霉)的一致性高达88%以上;半定量RT-PCR分析显示,干旱、PEG和NaCl胁迫明显诱导HaRAN1基因的表达.结果表明,HaRAN1基因编码蛋白在物种间具有高度保守性,可能在梭梭适应极端干旱的沙漠生境中起重要作用.     

黄花草木樨MoSOS1基因克隆及表达分析

植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因SOS1是植物耐盐性必需的基因之一,在抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。以黄花草木樨叶片总RNA为模板,通过RT-PCR结合RACE方法克隆得到黄花草木樨MoSOS1基因全长序列,命名为MoSOS1。序列分析表明该基因全长为3 931 bp,开放阅读框(ORF)为2 874 bp,编码957个氨基酸,分子量为112.8 k D,等电点为5.31。TMHAM软件跨膜区的预测分析表明,黄花草木樨MoSOS1蛋白具有8个跨膜结构区域,N端和C端都位于细胞外。氨基酸序列分析表明,MoSOS1蛋白含有1个Na+/H+Exchanger superfamily和一个c NMP(Cyclic nucleotide-monophosphate)结合位点以及1个CAP_ED(Catabolite gene activator protein-effector domain)superfamily结构域。生物信息预测显示,MoSOS1的编码蛋白为不稳定酸性蛋白,不存在信号肽,二级结构多为α-螺旋和无规则卷曲。荧光实时定量RT-PCR分析表明:随着Na Cl浓度的增加,黄花草木樨地上部和根中MoSOS1基因表达水平呈增加趋势,根中表达量大于地上部,表明MoSOS1基因的表达受盐胁迫诱导和调节。     

观赏向日葵ζ-胡萝卜素脱氢酶基因HaZDS的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从观赏向日葵新品种闽葵3号黄色花瓣中克隆获得类胡萝卜素合成途径关键酶基因ZDS,命名为Ha ZDS(Gen Bank No.KF263657),该基因c DNA全长2069 bp,具有一个1761 bp的完整开放阅读框(ORF),编码587个氨基酸。推导氨基酸序列分析表明,Ha ZDS蛋白在N-末端区域含有一个叶绿体转运肽序列,含有一个典型的氨基氧化酶结构域和NAD(P)结合结构域,存在一个特征序列。系统发育分析表明,观赏向日葵Ha ZDS与万寿菊、菊花蛋白的同源性分别达96.4%、90.1%,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,Ha ZDS基因在盛花期表达量最高,不同组织中的表达量舌状花瓣绿色管状花苞片叶片黑色管状花,随着花瓣黄色的加深,基因表达量逐渐增加。推测Ha ZDS基因在转录水平上参与观赏向日葵花色形成的调控。     

盐藻小G蛋白基因(DsRab)的克隆及在高盐胁迫下的表达分析

采用RT-PCR和RACE技术扩增了杜氏盐藻小G蛋白基因cDNA全长序列(GenBank Accession No.JN989548),命名为DsRab,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR方法检测盐胁迫下该基因的表达情况。结果表明,DsRab基因的cDNA全长为1 299 bp,开放阅读框(ORF)为612 bp,编码203个氨基酸,5’非编码区78 bp,3’非编码区609 bp;保守性结构域分析可知编码的小G蛋白有4个GTP/GDP保守结构域,1个效应区、1个羧基端的半胱氨酸结构域和5个Rab亚家族共有的结构域;二级结构预测表明该蛋白有32.02%的α-螺旋,23.65%的伸展片段,44.33%的自由卷曲,三维建模成功;比对分析发现DsRab蛋白与多种生物的Ypt/Rab的氨基酸序列具有较高的同源性。荧光定量PCR结果表明,盐藻在高盐(3.0 mol/L)胁迫下,DsRab基因表达量显著上调,1 h后表达量达到最大值,为正常培养下对照组(0 h)的4.9倍,差异极显著(P<0.01)。     

二色补血草液泡膜H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个V-H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因全长cDNA序列。该基因全长为729bp。其中,开放读码框（ORF）为498bp,编码165个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为16.6kDa,理论等电点为8.62。用实时定量RT-PCR方法进一步研究二色补血草在NaCl、NaHCO3和NaCO3胁迫下的不同时间内该基因表达模式的结果表明,NaCl强烈诱导二色补血草叶组织中LbVHA-C基因的表达,但其根部的表达变化不明显。NaHCO3胁迫下LbVHA-C基因在根部组织的表达受抑制。Na2CO3胁迫24h时的LbVHA-C基因在根和叶部组织中的表达都强烈受抑制,随后在根和叶组织的表达量逐步升高。     

向日葵V-ATPasea3亚基基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从向日葵P50中克隆V-ATPase a3亚基基因c DNA全长,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析不同浓度、不同时间的Na Cl、ABA和PEG模拟干旱胁迫条件下V-ATPase a3亚基基因的表达特征,以及相同胁迫条件下该基因在向日葵不同器官的表达特征。序列分析表明,该基因c DNA全长2 873bp,含5'-UTR 109bp、3'-UTR 295bp及编码区2 469bp,编码822个氨基酸,其编码蛋白质的理论分子质量为204.55k Da,等电点为6.29,Gen Bank登录号为KU315054。该基因编码的蛋白质为疏水性的跨膜蛋白,亚细胞定位预测其在质膜上。向日葵V-ATPase a3亚基与已报道的10种植物的V-ATPase a3亚基的同源蛋白有高度相似的保守区域,在进化上与朝鲜蓟的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,向日葵受到Na Cl、ABA和PEG模拟干旱三种非生物胁迫后,V-ATPase a3亚基基因均上调表达,但表达模式不同,不同器官存在特异性表达差异。研究认为,V-ATPase a3亚基基因响应了向日葵非生物胁迫的应答,为加强对V-ATPase基因的利用奠定基础。     

草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

为研究CADMs（Cell adhesion molecules）在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中发挥的作用,用RT-PCR和RACE方法结合测序分析,在草鱼脑组织中检测到了该基因家族成员cadm2b基因的4条不同的cDNA全长序列。序列比对结果表明这4条全长cDNA在5'端的序列完全相同,在3'端的3个局部区域有不同片段的缺失。因此,可以确定这4条不同的mRNA是cadm2b的不同剪接体。这4条不同的剪接体被分别命名为cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6。cadm2b的cDNA序列全长1669 bp,开放阅读框（ORF）1203 bp,编码400个氨基酸。cadm2bX2的cDNA序列全长2783 bp,开放阅读框长1323 bp,编码440个氨基酸;cadm2bX3的cDNA序列全长2755 bp,开放阅读框1296 bp,编码431个氨基酸;cadm2bX6基因的cDNA序列全长2649 bp,开放阅读框1161 bp,编码386个氨基酸。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这4个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区,但其C端的蛋白结合位点存在差异。CADM2b具有近膜4.1蛋白结合位点和Ⅱ型PDZ蛋白结合位点,CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白结合位点,而CADM2bX6则同时缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的结合位点。实时定量RT-PCR检测结果显示cadm2b剪接突变体是该基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR实验检测结果表明cadm2b基因在草鱼成体脑中高水平表达,在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。这种表达模式提示草鱼中CADM2b主要是由非免疫细胞,而不是由免疫肥大细胞合成分泌的细胞黏附因子,可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。     

雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌△^6 -脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉（Thamnidium elegans）As3．2806△^6 -脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术（RACE）向两端延伸得到1504bp的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的△^6 -脂肪酸脱氧酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSel的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSel中异源表达。通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸（GLA）的含量占酵母总脂肪酸的7．5％。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因（GenBank．AY941161）。     

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。