V1C、G116D、N171H定点突变对黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

[目的]探索V1C、G116D、N171H定点突变对木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性的作用。[方法]生物信息学方法确定木聚糖酶Xyn ZF-2可突变位点,引入Cys、Asp、His;定点突变V1C、G116D、N171H,PCR扩增突变基因xyn CDH,构建大肠杆菌表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白并测定酶活,分析酶学性质。[结果]突变酶Xyn CDH的最适温度由40℃上升到45℃。40℃条件下突变酶Xyn CDH半衰期t40℃1/2由55 min延长到60 min;在45℃条件下,突变酶Xyn CDH的半衰期t45℃1/2由7min提高到15 min。[结论]定点突变V1C、G116D、N171H能增强木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性,为加深木聚糖酶分子改造的研究提供参考。     

C-端引入二硫键对黑曲霉木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

同源比对黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2氨基酸序列,模拟构建木聚糖酶三维结构,确定能够提高酶热稳定性的最佳突变位点。在C-端引入二硫键,突变xyn ZF-2 205位点的色氨酸和52位点的丙氨酸为半胱氨酸,获取突变基因T205C-A52C,表达于大肠杆菌BL21(DE3)。酶学性质比较发现,突变酶Xyn ZFT205C-A52C的最适温度为50℃,比原酶Xyn ZF-2提高了10℃;50℃保温5 min,突变酶相对酶活性为55.36%,原酶相对酶活性为32.62%;原酶与突变酶最适p H均为5.0,但相同p H下突变酶的相对酶活性较原酶高;突变酶的p H稳定区间由原酶的5.0~9.0扩大为3.0~9.0。因此,定点突变T205C和A52C在C-端引入二硫键能提高黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-2热稳定性及p H稳定性。     

木聚糖酶Xyn Ⅱ的D37N突变、表达及酶学性质变化

对来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的木聚糖酶Xyn Ⅱ进行同源建模和序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存在一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关,据此设计了Xyn Ⅱ的D37N定点突变.酵母表达的Xyn ⅡD37N 经纯化后与原酶Xyn Ⅱ(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,Xyn ⅡD37N 的最适pH由4.2升高到5.3,pH稳定范围由3.0～7.5缩减为3.0～5.5,但最适温度和热稳定性基本保持不变.结果证实,木聚糖酶Xyn Ⅱ的第37位Asp与最适pH相关,为进一步的结构与功能研究提供了理论基础.     

定点突变提高里氏木霉木聚糖酶 (XYN II) 的稳定性

通过定点突变的方法,在来源于里氏木霉Trichderma reesei的木聚糖酶XYN II的N-末端两个β折叠片层间添加二硫键,以提高木聚糖酶的稳定性。原酶XYN-OU和突变酶XYN-HA12 (T2C、T28C和S156F) 分别在毕赤酵母中分泌表达,突变酶与原酶纯化后进行酶学性质比较。结果表明：突变酶最适反应温度由50℃提高到60℃;在70℃的半衰期由1 min提高到14 min;最适反应pH为5.0,与原酶保持一致,但是在50℃、30 min条件下的pH稳定范围由4.0~9.0扩展到3.0~10.0。对木聚糖酶分子改良的结果反映出在β片层间添加二硫键可以有效改善酶在较高温度下三维结构的刚性,提高热稳定性。     

基于结构基础的嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌木聚糖酶CbXyn10C的热稳定性分子改良

【背景】作为降解木聚糖的核心酶种,木聚糖酶可以有效促进木质纤维素的消化水解,在动物养殖领域应用广泛。来源于嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorbescii)的GH10家族木聚糖酶Cb Xyn10C最适温度为85℃,在80℃条件下具有良好的热稳定性,具有饲料工业应用潜力。【目的】为满足饲料制粒尤其是水产饲料加工过程的工艺要求,进一步提高木聚糖酶Cb Xyn10C的热稳定性并阐明其耐热机理。【方法】以Cb Xyn10C晶体结构为基础,采用刚性氨基酸引入、疏水作用网络重排2种策略对其热稳定性进行理性设计,获得在100℃条件下比活提高的单点突变体后,通过有益突变位点叠加策略进一步提升酶的热稳定性,最后采用分子动力学模拟技术分析其热稳定性提高的分子机制。【结果】共获得了4个稳定性提高的单点突变体A45P、T69P、F309V和A325P,其中突变体A45P效果最优。随着在A45P基础上另外3个突变位点的叠加,酶的热稳定性在不损失酶活的前提下得到了逐步提升。获得的四点突变体A45P/F309V/A325P/T69P的耐热性最好,其最适反应温度和熔解温度Tm值较野生型...     

定点突变提高木聚糖酶Umxyn10A的热稳定性

木聚糖酶是微生物半纤维素降解体系中的一种关键酶,被广泛地应用在工业中的多个领域。本研究为了提高木聚糖酶Umxyn10A (ABL73-883.1)的热稳定性,将Umxyn10A与GH 10家族4种耐热木聚糖酶进行多序列同源比对以及三维结构的同源建模分析,选定了Umxyn10A第31位氨基酸位点进行定点突变,将氨基酸Ala (A)突变为Phe (F)。分别将Umxyn10A和Umxyn10AA31F在大肠杆菌中进行重组表达,分析2种重组酶的酶学特性,结果发现,Umxyn10AA31F的最适反应温度为85℃,较野生重组酶提高了5℃;在65℃下的半衰期为105 min,较野生重组酶(15 min)提高了6倍;在70℃下突变重组酶的半衰期为15 min,较野生重组酶(5 min)提高了2倍;与此同时突变重组酶的pH耐受区间较原酶也有一定的增大。结果表明,将第31位氨基酸位点Ala突变为Phe能够显著的提高Umxyn10A的热稳定性。     

酸性木聚糖酶XynⅡ活性中心关键氨基酸残基的鉴定

目的:鉴定来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的酸性木聚糖酶XynⅡ活性中心关键氨基酸残基。方法:对XynⅡ进行SWISS-MODEL同源建模和BLAST序列比较,分析XynⅡ中所有可能作为催化残基的保守氨基酸,采用定点突变手段对其进行鉴定研究。结果:只有Glu-79和Glu-170位于酶与底物作用的活性中心,它们分别位于β折叠股B6和B4上,推测Glu-79和Glu-170为XynⅡ活性中心关键氨基酸残基。将Glu-79和Glu-170突变为酸性的Gln,突变酶E79Q,E170Q在大肠杆菌和毕赤酵母中表达后,活性均丧失。结论:79位、170位Glu是木聚糖酶XynⅡ活性中心的关键氨基酸残基,为该酶进一步的结构与功能研究提供了理论基础。     

Bacillus pumilus阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及水解木聚糖的研究

从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达,有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E.coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质,将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明:以燕麦木聚糖为底物,重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50℃,最适p H为6.0。该酶在p H 5.0~10.0和45~55℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比,重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶,水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%,木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖,提高水解效率,产生更多的木寡糖,阿拉伯糖和木糖。     

常压室温等离子体快速诱变绿色糖单孢菌筛选 木聚糖酶高产菌株及其酶学性质研究

[目的]利用常压室温等离子体快速诱变绿色糖单孢菌,筛选耐热耐碱木聚糖酶高产菌株,并对其进行酶学性质分析,确保其适用于生物制浆漂白工艺.[方法]采用刚果红平板水解圈法结合摇瓶发酵胞外酶测定法进行菌株筛选,并通过DNS木聚糖酶活性测定等方法对来源于不同突变株的木聚糖酶进行酶学性质分析对比.[结果]筛选出遗传稳定性良好的两株木聚糖酶高产菌株AT24和AT22-2,以麦草浆为诱导底物的粗酶液中,突变株AT24及AT22-2所产的木聚糖酶活性分别为512.74、552.70U/mL,分别为原始菌株S.v的16和17倍的.来源于突变株AT22-2的木聚糖酶的最适反应pH为9.5,最适反应温度为90℃,在50℃-90℃温度范围内具有良好的热稳定性,在100℃条件下处理30 min剩余酶活仍为68％;突变株AT24所产木聚糖酶的最适反应温度为60℃,最适pH为10.0,在60℃-80℃的高温环境下,突变株AT24所产的木聚糖酶具有良好的热稳定性.[结论]突变株AT22-2所产具有耐碱耐高温性质的木聚糖酶,在应用领域尤其在纸浆造纸行业具有较大的潜在应用价值.     

糖基化对Caldicellulosiruptor sp.F32中内切型木聚糖酶热稳定性的影响

[目的]探讨糖基化对来自Caldicellulosiruptor sp.F32的GH11家族木聚糖酶的影响,揭示其工业应用价值。[方法]在大肠杆菌和毕赤酵母中表达木聚糖酶Xyn A及其催化模块Tm1。通过酶学性质对比,论证糖基化对酶学特征的影响。[结果]毕赤酵母分泌的p-Xyn A和p-Tm1可被糖基化修饰,而大肠杆菌表达的e-Xyn A和e-Tm1无法被修饰。糖基化未明显影响Xyn A的催化效率和热稳定性,但可提高Tm1的催化效率约1.5倍,而且在80℃、85℃下,pTm1的半衰期相对于e-Tm1分别提高了约1.5、2倍。另外,Tm1的热稳定性和酶活均显著高于Xyn A。通过对Tm1同源建模分析,两个糖基化位点(天冬酰胺N23、N189)可能对热稳定性有促进作用。[结论]酵母对Tm1的糖基化修饰可热稳定性和催化效率提高1.5~2倍,相比于Xyn A更适合工业应用。     

通过N端引入芳香族氨基酸提高木聚糖酶的热稳定性

耐热的木聚糖酶具有用于造纸、麻类脱胶和饲料生产等工业领域的巨大潜力,为了提高11家族碱性木聚糖酶Xyn11A-LC的热稳定性,通过理性设计在N-末端引入了芳香族氨基酸(T9Y和D14F)。测定野生型和突变体的性质表明,突变体的最适反应温度和热稳定性均获得了提高。突变体的最适反应温度比野生型提高了5℃。野生型在65℃的Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)中的半衰期为22 min,而突变体在此条件下的半衰期为106 min。圆二色光谱测定结果显示野生型和突变体的Tm分别为55.3℃和67.9℃。因此,通过在N-末端引入芳香族氨基酸可以提高11家族木聚糖酶的热稳定性和在高温下的活性。     

长双歧杆菌N-乙酰氨基己糖1-位激酶的活性位点

【目的】研究长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的N-乙酰氨基己糖1-位激酶(Nacetylhexosamine 1-kinase,Nah K)中对催化活性有影响的位点。【方法】利用点突变试剂盒,获得Nah K的4个位点的共10种单点突变体表达菌株。诱导表达并纯化野生型和突变体酶,用DNS法和NADH偶联的微孔板分光光度法检测野生型及突变体酶的最适p H和最适Mg~(2+)浓度,并测定酶促反应动力学参数。【结果】D208A、D208N、D208E和I24A四种突变体的催化活性几乎丧失。突变体H31A、H31V、F247A和I24V的最适p H由野生型的7.5变为7.0,突变体H31A和F247A的最适Mg~(2+)浓度由野生型的5 mmol/L变为10 mmol/L。反应动力学参数测定结果表明,突变体F247Y对底物Glc NAc/Gal NAc及ATP的催化活性均高于野生型。【结论】通过定点突变,确定了对Nah K催化活性有影响的4个位点,并且获得了一个催化效率提高的突变体(F247Y),为进一步对Nah K进行分子改造奠定了一定基础。     

米根霉α-淀粉酶热稳定性的理性设计

真菌α-淀粉酶被广泛应用于麦芽糖浆生产工业,但其热稳定性普遍较差,在制糖工艺中增加了由于酶活力损失而引起的追加生产成本。在充分研究了热稳定性对于真菌α-淀粉酶应用于工业生产的重要性的基础上,为提高米根霉α-淀粉酶(ROAmy)的热稳定性,基于酶蛋白B-factor分析和分子动力学模拟,利用重叠PCR技术分别对ROAmy中的3个氨基酸残基G128、K269和G393进行了单点突变及组合突变。结果表明,所获得的7个突变体均比原酶具有更好的热稳定性,其中效果最好的为组合突变体G128L/K269L/G393P,其在55℃下的热失活半衰期(t_(1/2))约为原酶的5.63倍。同时,该突变体的最适温度由50℃提高到了65℃,最大反应速率(V_(max))和催化效率(k_(cat)/K_m)分别提高了65.38%和99.86%。通过蛋白结构功能比较分析,发现氢键数目的增多或脯氨酸在特殊位置中的引入可能是突变体热稳定性得到提高的主要因素。     

木聚糖酶XYNB的N46D突变、表达及酶学性质变化

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.将突变酶XYNBN46D在毕赤酵母中表达,表达的XYNBN46D经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明, XYNBN46D的最适pH值由5.2下降到4.2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,热稳定性和最适温度也有一定的提高, 但酶的比活性显著下降.结果证实,木聚糖酶XYNB的第46位Asn与其最适pH值相关.对导致酶学性质改变的可能因素进行了分析,结果为进一步的结构与功能研究提供了资料.     

N13D、S40E点突变提高木聚糖酶XYNB的热稳定性

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性比XYNB分别提高了24.76%和14.46%;突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22%。在其他性质方面突变酶N13D、S40E与野生型酶XYNB基本相似。通过对木聚糖酶XYNB的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。     

杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A~(loop)的H321对其酶学性质的影响

目的:将loop置换杂合β-甘露聚糖酶AuMan5A~(loop)的H321突变回野生型酶AuMan5A对应的Gly,以分析杂合酶的酶学性质与H321的相关性。方法:采用大引物PCR技术将AuMan5A~(loop)基因(Auman5Aloop)编码H321的密码子CAC突变为Gly的GGT,构建突变酶基因Auman5A~(loop/H321G);借助表达质粒pPICZαA将该突变酶基因在Pichia pastoris GS115中实施表达,并分析重组表达产物AuMan5A~(loop) H321G的酶学性质。结果:AuMan5A~(loop/H321G)置换前后的最适温度T_(opt)均为75℃,高于AuMan5A的65℃;AuMan5A~(loop/H321G)在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)为300 min,介于AuMan5A(10 min)和AuMan5A~(loop)(480 min)之间;AuMan5A~(loop/H321G)比活性分别为AuMan5A和AuMan5A~(loop)的12.8和1.43倍;催化效率k_(cat)/K_m为后两者的14.1和1.12倍。结论:通过H321G置换及对3种酶的温度特性、比活性和催化效率的测定及比较,证实了H321对AuMan5A~(loop)的酶学性质有一定的影响。     

枯草杆菌蛋白酶E的蛋白质工程

用定点突变和随机突变的方法,对枯草杆菌碱性蛋白酶E基因进行改造。突变后的基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pBE-2中,在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌DBl04中进行表达,得到突变种的碱性蛋白酶．它们的突变位点分别是(M222A)、(M222A、N118S)、(M222A、N118S、Q103R)、(M222A、N118S、Q103R、D60N)。各突变种酶的性质测定 结果表明．M222A突变使酶抗氧化,N118S突变使酶增加热稳定性,Q103R和D60N突变虽然能增加酶的比活,但使酶的热稳定性大大下降,尤其是D60N突变使酶变得极不稳定。野生型碱性蛋白酶与(M222A)突变种的等电点均为8．92．而M222A,N118S)。(M222A,N118S ,Ql03R)和(M222A,118S．Q103R,D60N)突变酶分别为8.88．9.10和9．17。用Nsuc-AAPF-pNA作为底物时酶反应景适pH值为7.5～9.5,而用酪蛋白底物时最适pH值为10～12。     

云南HPV-16型E6、E7基因的突变分析

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16型(HPV-16)是引起宫颈癌的一种主要高危型病毒,其2个致癌基因E6和E7的核酸序列变异可能会影响其对宿主细胞的致癌性,已有研究表明其序列突变呈现地域差异性。因此,研究不同地域HPV-16这2个基因的变化情况是宫颈癌流行病学调研的主要内容,也可为研究E6和E7的致癌性积累数据。研究以NCBI登录号为NC_001526.2的HPV-16型病毒的序列为参照,采用Neighbor-joining方法对云南地区74例HPV-16样本的E6、E7的DNA序列构建进化树,结果显示:只有亚洲和欧洲变异亚型,而没有发现非洲1、非洲2、亚-美洲和北美洲这4种变异亚型。DNA序列分析显示:E6的碱基突变以T178G(D25E,59.46%)和T350G(L83V,8.11%)为主,E7的碱基突变主要以A647G(N29S,59.46%)和T846C(同义突变,60.81%)为主。发现E6的新突变有A95G(同义突变,1.35%)和A135G(K11R,1.35%);E7的新突变有C625T(L22F,1.35%)、C627T(同义突变,12.16%)、G689A(G43E,1.35%)、T748G(S63A,1.35%)。此外还发现有一个共突变现象:T178G(D25E,59.46%)-A647G(N29S,59.46%)-T843C(同义突变,21.62%)-T846C(同义突变,60.81%)。     

上海地区HIV毒株基因亚型分布及原发基因耐药的分子流行病学研究

本文通过对未经抗病毒治疗患者的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）毒株进行检测,了解上海地区HIV-1的亚型分布及原发耐药基因变异现状。对118例未经治疗的HIV感染者其标本中HIV蛋白酶全长和部分反转录酶基因进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增,经DNA测序后进行系统进化树分析和重组分析,以确定HIV-1基因亚型和重组体,并与斯坦福耐药数据库比对,了解耐药性突变位点。使用斯坦福REGA HIV亚型分型工具和美国国立生物技术信息中心（NCBI）HIV亚型分析工具分析亚型,获得118例患者的HIV基因序列,基因分型分别为CRF01_AE重组体57例(48.3%)、B亚型36例(30.5%)、CRF07_BC 15例 (12.7%)、CRF08_BC 7例(5.9%)、C亚型2例(1.7%),亚型间或重组体间二重重组体(B/CRF01_A E)1例(0.8%)。蛋白酶抑制剂(PI)和反转录酶抑制剂相关的耐药基因突变率达54.2%（64/118）,其中2例（1.7%）发生PI耐药,基因突变位点：M46L、Q58E。5例(4.1%)对反转录酶抑制剂产生耐药,其中对核苷类反转录酶抑制剂（NRTI）和非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTI）的耐药率分别为3例(2.4%)和5例(4.1%)。基因突变位点：NRTI为M41L、D67N、T69I/N/S、K70L、L74V、V75L、V118I、M184V、L210W/F/M/S和T215F;NNRTI为V90I、L100V、K103R/N、V106M/P/I/G、E138G/A、V179E/D/T、Y181C、G190A、H221Y、F227L、K238S和Y318F。结果提示,上海地区HIV毒株以CRF01_AE重组亚型为主,且发现新的重组体,可能出现新重组体流行的趋势。PI和反转录酶抑制剂相关的耐药基因突变率较高,且存在高度原发耐药毒株,应加强HIV-1耐药基因变异监测,科学、合理地给予抗病毒治疗。     

嗜热革节孢GH1 BGL1进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性的影响

糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1 BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335和E437这12个氨基酸残基进行定点突变,将突变酶与野生酶(WT)在毕赤酵母中表达,表达产物纯化后进行酶活性和葡萄糖耐受性测定。与WT相比,所有突变酶活性均有所降低,其中W168H、N335F和W349G几乎丧失活性。突变F180H、D237S、A260N和H307Y的Km低于WT,所有突变的kcat都降低。除L173Q外,其余突变都保持葡萄糖耐受性,在高浓度(400 mmol/L)葡萄糖时,Y179F和D237S酶活受到显著抑制。本研究表明,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性均具有一定影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。