二价金属离子对嵌有线粒体H~+-ATP酶的脂酶体不同层次脂质流动性的影响

本文报道用荧光偏振及顺磁共振两种方法研究Mg~(2+)及其它二价金属离子对嵌有H~+-ATP酶的脂酶体不同层次脂质流动性的影响。 (1)顺磁标记探剂5-、12-、16-氮氧基硬脂酸测定结果表明Mg~(2+)和其它二价金属离子都能降低膜脂双分子层表层的流动性。降低流动性的顺序为Mg~(2+)=Ca~(2+)>Sr~(2+)>Cd~(2+)。较深层脂则无明显变化。 (2)荧光探剂7-、12-(9-蒽酰)硬脂酸及16-(9-蒽酰)棕榈酸的测定结果也表明Mg~(2+)和其它二价金属离子降低了膜脂表层的流动性,尤以Mn~(2+)、Ca~(2+)降低流动性最显著,流动性降低的顺序为;Mn~(2+) Ca>Sr~(2+) Mg~(2+) Cd~(2+)。除Mn~(2+)、Ca~(2+)还能影响膜脂深层的流动性外,其它与对照无明显差异。     

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅱ.酶的性质和调节

头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)生物活性的最适pH为7。测活系统中必须加入Mn~(2+)或Mg~(2+),二者分别作激活离子时得到的酶的参数不同。Mn~(2+)对GS有稳定作用。一些金属离子如Ca~(2+)等强烈地抑制生物活性。GS的最适温度为50℃,对ATP、谷氨酸和NH_4Cl的Km值分别为1.75、2.78和5mmol/L。NH_4Cl的浓度小于10mmol/L时对酶有正协同效应,大于10mmol/L时对酶有负协同效应。GS可被氨阻遏,比活能被硝酸盐促进。一些代谢物对GS有累积反馈抑制作用。发酵过程中加入氨后无“氨休克”现象,高氨条件下的GS不受蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)的作用,所以此酶无腺苷酰化—去腺苷酰化调节。     

Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌产右旋糖酐的影响

肠膜状明串珠菌在其产生的右旋糖酐蔗糖酶的作用下,以蔗糖为原料转化合成右旋糖酐和产生果糖。着重进行了Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐影响的初步探索。对Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长,产果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶,右旋糖酐蔗糖酶作用影响进行了研究。一定浓度的Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长具有促进作用; Mn~(2+)抑制肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产果糖和右旋糖酐,且Mn~(2+)浓度越高,抑制性越强; Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用; Mn~(2+)对右旋糖酐蔗糖酶具有较强的激活作用,激活作用可达158%,最适Mn~(2+)浓度为5. 0 mmol/L。     

卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的酶学性质

【目的】探讨卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的性质。【方法】克隆卷枝毛霉中编码苹果酸酶同工酶V的mel基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His标签纯化获得了高纯度的重组酶BLME1,并进行酶学性质分析。【结果】该重组酶最适pH为8.0,最适温度为33℃,在此条件下酶活达到92.8 U/mg,对底物L-苹果酸和NADP~+的米氏常数K_m值为0.74960±0.06129 mmol/L和0.22070±0.01810 mmol/L,最大反应速度V_(max)分别为72.820±1.077 U/mg和86.110±1.665 U/mg。金属离子Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)可以激活BLME1的活性,而Ca~(2+)、Cu~(2+)对BLME1活性则有抑制作用,中间代谢产物草酰乙酸和α-酮戊二酸也会抑制BLME1的活性,但琥珀酸却对BLME1有激活作用。【结论】本实验调查了卷枝毛霉苹果酸酶同工酶V的最适反应温度和pH、动力学参数,以及各种金属离子和中间代谢产物对酶活力的影响,这为以后深入研究该苹果酸酶的功能提供了理论依据和参考。     

菠菜叶片蔗糖磷酸合成酶的调节

电泳均一的菠菜叶片蔗糖磷酸合成酶的活力受G6P,Mg~(2 ),Mn~(2 )的调节;G6P对此酶的促进作用在F6P浓度较低时表现得比较明显;此酶对Mn~(2 )较对Mg~(2 )敏感,Mg~(2 ),Mn~(2 )对此酶的促进作用可被EDTA解除。底物F6P的饱和曲线为S型,底物UDPG的饱和曲线为双曲线型。NADP是此酶的负效应剂,NADP对F6P表现为混合型抑制,使V_m(F6P)降低和K_m(F6P)增大,3mmol/L NADP使F6P的K_m值从2.5mmol/L上升至3.8mmol/L,但不影响希尔系数,n=1.3。NADP对UDPG表现为K_m不变的非竞争性抑制,K_m(UDPG)=3.8mmol/L。     

热敏型核酸酶在毕赤酵母中的分泌表达及催化特性

核酸酶在生物工程领域有着重要的应用价值。本研究在优化北极虾核酸酶(Shrimp nuclease,SNU)基因序列的基础上,构建SNU的毕赤酵母分泌表达载体SNU-p PICZαA并转化酵母,以高拷贝整合转化子为基础,优化酶表达的条件,并对该酶的催化特性进行分析,结果显示SNU可在毕赤酵母SMD1168H中高效分泌表达,最佳诱导表达条件为:培养基BMMY p H 6.0,甲醇浓度为1%,诱导时间为72 h,诱导后粗酶液比活力为1.4×10~5 U/m L。经过DEAE Sephadex阴离子交换层析可纯化获得高纯度的目标蛋白,每升菌液可纯化15 mg目标蛋白,比活力达到6.291×10~6 U/mg,该酶表观分子量为50 k Da,PNGase F酶切证实该酶存在糖基化现象。二价金属离子Ca~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Mg~(2+)及还原剂DTT、β-ME能显著地提高其水解活性,但Zn~(2+)、Cu~(2+)、SDS、高浓度Na Cl抑制该酶的活性,SNU为Ca~(2+)/Mg~(2+)依赖型核酸酶。70℃处理10 min可使该酶不可逆的失活。     

Mn2+浓度对地衣芽孢杆菌产不同构型聚-γ-谷氨酸机理分析

【目的】分析Mn~(2+)对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)WBL-3产不同比例聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)的机理。【方法】以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)KH-2为对照菌株,克隆表达L-谷氨酸和D-谷氨酸代谢关键酶,分别为谷氨酸消旋酶(GR)、D-丙氨酸转氨酶(D-DDT)和谷氨酰胺合成酶(GS)。通过体外酶活实验与体内转录水平分析,初步探讨Mn~(2+)浓度对不同比例γ-PGA的生成机理。【结果】当Mn~(2+)浓度为0与0.6 mmol/L时,γ-D-PGA所占的比例分别为22%和67%。在0.6 mmol/L Mn~(2+)浓度下,B.licheniformis WBL-3中GR的催化活性(k_(cat)/K_m值)比未添加Mn~(2+)时高,GS只有在Mn~(2+)存在下才具有催化活性。实时荧光定量PCR结果表明,Mn~(2+)提高了GR、D-DDT和GS的转录水平,提高倍数分别为2.16、4.44和1.84倍。【结论】Mn~(2+)激活了GR、D-DDT与GS的表达,促进L-谷氨酸的代谢,使得菌体内D-谷氨酸比例升高,从而提高了γ-D-PGA的比例。     

配体对(Na~++K~+)-ATP酶E_2→E_1转变的影响

 本研究确定了在0℃条件下,(Na~++K~+)-ATP酶纯化制备物与5mmol/L Na~+或Mg~(2+)在5mmol/L咪唑(pH7.4)环境中预保温30分钟,然后进行磷酸化,可以获得最高磷酸化水平,Na~+或Mg~(2+)的K_(0.5)值分别为0.29mmol/L或0.35mmol/L;以ADP代替Na~+和Mg~(2+)与酶预保温,对E_2向E_1转变无任何影响,而与Na~+、Mg~(2+)一起存在时则能加强Na~+及Mg~2的预保温效果。     

火球菌Pyrococcus furious瓣状核酸内切酶1的表达纯化及酶学特征

【目的】克隆表达和纯化火球菌Pyrococcus furious来源的瓣状核酸内切酶1基因pFEN1(PF1414),对该蛋白的活性和酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将pFEN1在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的荧光标记的寡核苷酸片段作为底物,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定pFEN1在体外的酶学特性以及与其他蛋白的相互作用。【结果】pFEN1重组蛋白能在大肠杆菌中进行高效表达;高于100 mmol/L的NaCl会抑制pFEN1的活性;pFEN1的核酸酶活性依赖于金属离子Mg~(2+)或Mn~(2+),且Mn~(2+)的催化效率优于Mg~(2+);来自嗜热古菌的pFEN1是一种耐高温蛋白,最适反应温度为60–65°C;增殖细胞核抗原(PCNA)能促进pFEN1的内切酶活性。【结论】本研究证实pFEN1是一种Mg~(2+)或Mn~(2+)依赖的核酸内切酶,且PCNA能促进该酶的活性。     

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅱ.酶的性质和调节

头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)生物活性的最适pH为7。测活系统中必须加入Mn~(2 )或Mg~(2 ),二者分别作激活离子时得到的酶的参数不同。Mn~(2 )对GS有稳定作用。一些金属离子如Ca~(2 )等强烈地抑制生物活性。GS的最适温度为50℃,对ATP、谷氨酸和NH_4Cl的Km值分别为1.75、2.78和5mmol/L。NH_4Cl的浓度小于10mmol/L时对酶有正协同效应,大于10mmol/L时对酶有负协同效应。GS可被氨阻遏,比活能被硝酸盐促进。一些代谢物对GS有累积反馈抑制作用。发酵过程中加入氨后无“氨休克”现象,高氨条件下的GS不受蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)的作用,所以此酶无腺苷酰化—去腺苷酰化调节。     

NaCl处理对西伯利亚白刺幼苗生长及离子平衡的影响

以1年生西伯利亚白刺水培幼苗为材料,研究了不同浓度NaCl(0、200、400mmol·L~(-1))处理对幼苗生长及不同器官(根、茎、叶)中Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)的吸收、运输与分配的影响,探讨西伯利亚白刺的盐适应机制。结果表明:(1)200mmol·L~(-1) NaCl处理促进了西伯利亚白刺幼苗的生长及叶片肉质化程度,400mmol·L-1 NaCl处理显著抑制其生长。(2)随着NaCl处理浓度的升高,西伯利亚白刺幼苗根、茎、叶中Na~+含量显著增加,且叶中Na~+含量显著高于茎和根中;根系中K~+含量显著增加;根、茎、叶中Ca~(2+)、Mg~(2+)含量在200mmol·L~(-1) NaCl处理下保持平稳或上升,而在400mmol·L-1 NaCl处理下显著下降。(3)各器官中K~+/Na~+、Ca~(2+)/Na~+和Mg~(2+)/Na~+比值总体随NaCl处理浓度的升高呈下降趋势,且根部离子比值始终高于叶片和茎。(4)随着NaCl处理浓度的升高,西伯利亚白刺幼苗根-茎SK,Na显著下降,而根-茎SCa,Na、SMg,Na及茎-叶SK,Na、SCa,Na、SMg,Na逐渐提高。研究发现,西伯利亚白刺的盐适应机制主要是通过植株的补偿生长效应及叶片对Na~+的聚积作用实现的,同时也与根系对K~+的扣留及茎叶对K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)选择性运输能力增强有关。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究 Ⅰ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含DNase、RNase 和蛋白酶活力,无内源DNA。测定了 RNA 聚合酶A和C对α-鹅膏荤碱的敏感性。酶A在α-鹅膏荤碱为400μg/ml时,活性受到抑制,而酶C在该浓度时,几乎不受抑制。(NH_4)_2SO_4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40mM和240mM。无二价金属离子Mn~(2+)或Mg~(2+),酶A和C几乎无活力。两种酶最适Mn~(2+)浓度均为2.5mM,Mg~(2+)浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

Ca~(2+)对植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的抑制作用

低浓度Ca~(2+)明显抑制高粱、马齿苋及大叶伽兰菜叶片PEPCase活性。Ca~(2+)对马齿苋及大叶伽兰菜PEPCase的抑制程度大于对高粱PEPCase的。Ca~(2+)对PEPCase的抑制作用因底物PEP浓度提高而加强,因必需金属离子Mg~(2+)的浓度增加而减弱。提高Mg~(2+)浓度可解除高粱PEPCase的Ca~(2+)抑制作用,但不能完全解除马齿苋PEPCase的抑制作用。G6P、gly可消除Ca~(2+)对高粱PEPCase的抑制作用,但G6P不能消除Ca~(2+)对马齿苋PEPCase的抑制作用。     

褪黑素对盐胁迫下香椿幼苗生长及离子吸收和光合作用的影响

以香椿幼苗为材料,采用水培法研究不同浓度褪黑素(0、50、100、200和400μmol/L)对盐(150 mmol/L NaCl)胁迫下香椿幼苗生长指标、矿质元素离子(Na~+、K~+、Ca~(2+)和Mg~(2+))含量、净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)和胞间CO_2浓度(C_i)等光合作用指标的影响,以探究外源物质褪黑素对盐胁迫下香椿幼苗生长和生理的调控作用。结果表明:(1)在盐胁迫条件下,香椿幼苗的生长受到显著抑制,叶绿素含量和P_n显著降低,叶片和根系中Na~+含量比对照(CK)显著增加,而K~+、Mg~(2+)和Ca~(2+)含量以及离子含量的比值(K~+/Na~+、Mg~(2+)/Na~+和Ca~(2+)/Na~+)则明显下降,且丙二醛含量显著增加。(2)施加适宜浓度褪黑素能显著促进盐胁迫下香椿植株生长,降低其叶片和根系中Na~+含量,提高其K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)含量和离子含量比值以及叶片P_n、T_r、水分利用效率(WUE)和G_s和C_i,但却降低了气孔限制值(L_s)。(3)适宜浓度褪黑素使盐胁迫下香椿植株叶片的丙二醛积累明显下降,叶绿素含量显著上升。研究发现,外施适宜浓度的褪黑素能降低盐胁迫下香椿幼苗叶片和根系内Na~+浓度,增加K~+、Mg~(2+)和Ca~(2+)浓度,调控植物体内细胞的离子平衡状态,增强对营养元素的吸收,提高光合作用效率,从而提高香椿幼苗对盐胁迫的抗性,并以100μmol/L褪黑素处理的效果最佳。     

Ca~(2+)和Mg~(2+)对红薯叶总黄酮提取及抑菌活性的影响

为考察Ca~(2+)和Mg~(2+)对红薯叶总黄酮提取率和抑菌活性的影响。本实验采用单因素实验确定Ca~(2+)浓度、Mg~(2+)浓度、料液比、乙醇浓度、提取时间的最佳因素水平,通过响应面法优化得到引入Ca~(2+)和Mg~(2+)后红薯叶总黄酮的最佳提取工艺,即Ca~(2+)浓度187 mg/L、Mg~(2+)浓度176 mg/L、乙醇浓度71%、料液比1∶40,提取时间为1 h,经验证,该工艺总黄酮提取率为2. 76%,略高于传统的提取工艺。该提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的MIC值分别为62. 5、31. 25、31. 25μg/m L,明显低于不含Ca~(2+)和Mg~(2+)的红薯叶总黄酮提取物(对应MIC值依次为250、125、62. 5μg/m L),由此可见,在提取过程中引入Ca~(2+)和Mg~(2+)可以明显增强红薯叶总黄酮的抑菌活性。     

观赏桃ISSR-PCR反应体系的优化

采用改良CTAB法从观赏桃满天红叶片中提取基因组DNA,通过单因素实验探讨了模板DNA、Mg~(2+)、dNTPs和Taq DNA酶等条件对观赏桃ISSR-PCR扩增结果的影响,建立了ISSR-PCR扩增的最佳体系:2.5μl反应体系中包含10×Buffer 2.5μl,模板DNA 40ng,Mg~(2+)浓度2.5mmol/L,引物浓度04 μmol/L,dNTPs浓度0.4mmol/L,Taq DNA酶0.5U.利用所建立的体系对红叶桃、菊花桃和春艳等13份材料进行检验,其结果表明优化后的体系适合观赏桃的ISSR-PCR反应.     

重组枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的纯化和性质研究

大肠杆菌中表达的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate dehydratase, ALAD),其N端含有组氨酸标签,Ni-NTA 一步纯化至均一.纯化的酶比活为3.6 U/mg蛋白,酶的最适pH为8.0～10.0,Km为0.95 mmol,Vmax为16.7 mmol/h,在55 ℃温浴10 min,酶活保留85 %,2 mmol/L的K+、Zn2+、Mg2+、Li+、Fe3+和Mn2+提高酶活,2 mmol/L的Co2+和Ca2+对酶活没有显著影响,2 mmol/L的Cu2+和1 mmol/L的Hg2+完全抑制酶活.在2 mmol/L的EDTA存在下酶活性丧失,表明酶催化依赖金属离子.100 mmol/L的酮戊酸抑制酶活约50 %.10 mmol/L的2-巯基乙醇时提高酶活3倍,而100 mmol/L的二硫苏糖醇几乎完全抑制酶活.氨基酸修饰表明赖氨酸和半胱氨酸残基可能是酶催化必需的,组氨酸和丝氨酸残基对酶催化不起关键作用.     

专一地切割苜蓿夜蛾核多角体病毒多角体蛋白mRNA的ribozyme的设计与性质

本文针对苜蓿夜蛾Autographa californica核多角体病毒的多角体蛋白mRNA设计并合成了两个ribozyme。体外实验结果表明它们都能准确、高效地切割体外转录得到的mRNA片段。实验表明,在一定的范围内,切割百分率随着温度的升高、时间的延长和ribozyme浓度的提高而增加。Ca~(2+)、Mn~(2+)可以代替Mg~(2+)作为ribozyme切割反应所必需的二价金属离子。     

产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶的异源表达及粗酶性质

赖氨酸脱羧酶,可以催化赖氨酸脱羧生成戊二胺。戊二胺是重要的平台化合物,可以合成新型聚酰胺材料、脂肪族异氰酸酯等新材料。本研究对来自于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶进行异源表达。以pUC18质粒为载体,将来源于产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶基因ldc克隆到大肠杆菌,得到菌株LN18。在添加0.5 mmol/L IPTG的LB培养基中,对LN18进行摇瓶培养,发酵液酶活可达到35 U/g发酵液,从发酵液制备的赖氨酸脱羧酶粗酶蛋白的酶活可以达到30 000 U/g粗蛋白。产酸克雷伯氏菌赖氨酸脱羧粗酶蛋白大小约80 kDa,粗酶的最适温度和pH值分别为55℃和5.5,与文献中报道的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶Cad A在pH 8.0几乎没有酶活不同,产酸克雷伯氏菌的赖氨酸脱羧酶在pH 8.0的酶活达到最优pH下酶活的30%以上。金属离子对酶活有一定的影响,Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)有一定的抑制作用。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。