藤黄微球菌Rpf活性蛋白的制取及其对红球菌VBNC菌体的复苏作用

【目的】克隆藤黄微球菌Micrococcus luteus IAM 14879(=NCIMB 13267)的复苏促进因子Rpf(resuscitation promoting factor)的基因,在大肠杆菌中表达获取基因重组蛋白,考察对近缘高GC革兰氏阳性菌红球菌Rhodococcus sp.DS471活的非可培养VBNC(viable but non-culturable)菌体的复苏促进生长能力。【方法】抽提制备藤黄微球菌的DNA,确定rpf基因引物进行PCR扩增,利用pET15b质粒载体并转化大肠杆菌DE3表达,以SDS-PAGE检验获取纯化重组蛋白;在培养基中添加Rpf,以MPN(most probable number)法计数、评价对VBNC状态菌体的复苏促进生长效果。【结果】基因测序证实获得藤黄微球菌的rpf基因并在大肠杆菌中表达;SDS-PAGE分析表明获得rpf基因的重组蛋白;该蛋白对处于VBNC状态的红球菌具有近100倍的复苏促进生长能力。【结论】成功克隆了藤黄微球菌的rpf基因,在大肠杆菌中获得了表达,表明了Rpf蛋白对处于VBNC状态的红球菌具有复苏促进生长效果。     

结核分枝杆菌RPF样蛋白家族及其功能

上世纪末,Mukamolova等从藤黄微球菌（Micrococcus luteus）发现一种分泌蛋白-复苏促进因子（Rpf）.该因子在皮摩尔浓度下能促进休眠期的藤黄微球菌及其他数种高G＋C含量的革兰氏阳性菌复苏和生长.结核分枝杆菌全基因组发现和该因子同源性较高的5个基因,预测产物都是分泌蛋白,一级结构都含有一个转糖基域.5个基因有一个共同的功能未知的域,3级结构预测该保守结构域和溶菌酶同源.重组表达的Rpf对不同种均有活性.5个rpf在不同生长时期均有表达,但调控有差异.     

结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达

以往在对藤黄微球菌的研究中发现了促进复活因子(RPF),该因子可以有效促进休眠期的多种革兰氏阳性细菌复活和生长。生物信息学分析表明在多种革兰氏阳性细菌的基因组中均存在编码RPF样蛋白的基因。从GeneBank中获得了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、谷氨酸棒杆菌和微链霉菌等革兰氏阳性细菌的多种RPF样蛋白相关信息,通过同源性分析发现这些蛋白均含有一个由75个氨基酸残基构成的高度保守序列,即RPF作用域。进一步对结核分枝杆菌H37Rv株的Rv1009进行了分析,并用PCR法克隆了其编码基因全长,定向克隆至pGEX 4T-2,在大肠杆菌BL21 (DE3)中获得了Rv1009-GST融合蛋白的高效表达,为深入探讨其生物学功能奠定了基础。     

链霉菌看家基因引物的设计与验证

看家基因的扩增与测序是进行多基因系统进化分析首先需要解决的问题。针对链霉菌这一群高(G C)mol%革兰氏阳性细菌,选定4个看家基因:atpD、recA、rpoB和trpB,利用NCBI数据库中已有的2个链霉菌和3个分枝杆菌的全基因组序列,以及另两个链霉菌的recA基因序列,通过软件分析设计了各基因的扩增和测序引物,并优化了扩增反应条件。从所试验的55株链霉菌中,均特异地扩增出了上述4个基因的片段,并成功进行了序列测定,验证了所设计引物的实用性。所归纳的引物设计方法可用于高(G C)mol%革兰氏阳性细菌的其它看家基因,以促进多基因系统进化研究的开展。     

圈卷产色链霉菌分化早期基因——samfR的研究

以链霉菌发育调控启动子PTH4 直接控制的下游部分基因片段为探针 ,在圈卷产色链霉菌中克隆到 1个 4.6kb的DNA片段 ,该片段除含有sawD基因外 ,其中1 .4kb的PvuⅡDNA片段对圈卷产色链霉菌的分化有促进作用 .序列分析及同源性比较表明 ,开放阅读框架 (ORF)由 6 39个核苷酸组成 ,编码 2 1 3个氨基酸的蛋白 ,该蛋白与红球菌 (Rhodococcusgloberulus) 3-羟苯丙基丙酸 ( 3HPP)代谢合成的调控基因hppR所编码的蛋白有 36 %的氨基酸完全相同和 5 2 %的氨基酸类似 ,该基因称之为samfR基因 .基因功能研究表明 ,samfR基因的破坏使圈卷产色链霉菌不能形成气生菌丝和孢子 ,而发育分化停止在基质菌丝阶段 ,出现光秃型的表型 .     

鸟胞内分枝杆菌mmpL11同源基因序列分析及功能预测

以非结核分枝杆菌中的胞分枝杆菌、鸟分枝杆菌两个标准株为研究对象,以耻垢分枝杆菌mc2 155和结核分枝杆菌H37Rv为对照,对其mmpL11同源基因进行序列分析,并对其蛋白质进行结构及功能预测,为后期的抗酸染色阳性菌诊断,药物靶标的筛选提供理论基础。根据同源比对找到两个标准株的mmpL11同源基因;应用expasy工具预测Mmp L11同源蛋白理化性质;蛋白质信号肽预测采用SignalP在线软件进行预测;使用TMHMM在线工具进行拓扑结构预测;利用Interproscan工具对蛋白保守序列和功能进行预测;使用SSpro对蛋白二级结构进行预测。OCU48920蛋白的理化性质分析显示:其氨基酸个数为1 018,分子量为108.4 k D,理论等电点为7.61,疏水指数为0.227;MAP3637c蛋白的理化性质分析显示:其氨基酸个数为1007,分子量为107.2 k D,理论等电点为8.59,疏水指数为0.231。信号肽预测发现两个标准株的Mmp L11均不存在信号肽切割位点,未发现信号肽存在。跨膜预测发现其跨膜次数分别为12和12肽链,N端均在膜内,二级结构以α-螺旋和β-片层为主。保守序列预测发现两个标准株的Mmp L11蛋白均有两个MMPL跨膜结构域,一个固醇敏感多肽区。OCU48920、MAP3637c为H37Rv的Mmp L11同源蛋白,推测其功能同Mmp L11相似,是分枝菌酸的转运蛋白,参与胞内小分子的运输和信号转导。     

合成酮内酯类3—脱氧—3—羰基—红霉内酯B糖多孢红霉菌M的构建

大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域,迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约3.2kb DNA片段,克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226,并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后,制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M（1－8）。ZabsPec Fab质谱鉴定,证实糖多孢红霉菌M1合成了3－脱氧－3－羰基－红霉内酯B,一种新的酮内酯类化合物。     

嗜热链霉菌质粒的研究

从分属于12个种的28株嗜热链霉菌中检测到热灰紫链霉菌(S.thermogriseoviolaceus)T272带有3个质粒(pST1,pST2,pST3),热藤黄链霉菌(S.thermoluteus)T422带有1个质粒(pST4),经电镜观察得到证实,并按经验公式求得其分子量分别为27、8.3、6.9、25.7kb。实验数据表明,T272与利福平抗性有关的基因可能位于质粒pST1;而pST4可能与rRNA甲基化酶合成有关,推测该酶使T422具有红霉素、螺旋霉素、林可霉素抗性。未发现这些质粒与宿主的高温生长特性有关。     

合成酮内酯类3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B糖多孢红霉菌M的构建

大环内酯类抗生素基因工程是近年来研究的一个新领域,迄今已合成了100多种新的聚酮类化合物。以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板,用重叠PCR方法扩增出去除KR6酶域DNA的约32kb DNA片段,克隆于pWHM3载体,构建了同源重组质粒pWHM2201。PEG介导原生质体转化法将pWHM2201转入糖多孢红霉菌A226,并整合于染色体红霉素合成基因位点。整合体在R3M斜面上生长两代后,制备原生质体涂R3M平皿。利用PCR鉴定筛选出8株KR6敲除的突变体糖多孢红霉菌M(1-8)。ZabsPec Fab质谱鉴定,证实糖多孢红霉菌M1合成了3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,一种新的酮内酯类化合物。 〖HJ0     

一株海洋链霉菌MMHS020的抗菌活性代谢产物

【背景】海洋微生物因其生存环境的多样性与独特性,已成为天然产物研究的重要来源。【目的】以一株太平洋海泥来源链霉菌MMHS020为出发菌株,筛选可促进其产生丰富代谢产物的发酵条件,挖掘菌株在抗菌抗肿瘤方面的潜力。【方法】采用单菌株多次级代谢产物策略对MMHS020菌株进行培养诱导,使其产生更丰富的活性代谢产物。双层平板法测定发酵产物对6种指示菌的抑菌活性。以硅胶柱层析、葡聚糖凝胶层析和制备层析等方法对代谢产物进行分离纯化,再通过质谱技术和~1H-NMR和~(13)C-NMR对化合物进行结构解析。【结果】链霉菌属MMHS020菌株可在较高浓度盐离子环境中产生丰富的抑菌活性代谢产物,显示出对枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌和藤黄微球菌等多种指示菌的抑制活性。从发酵产物中分离鉴定了3个化合物,分别是诺卡胺素(1)、麦角甾醇(2)和星形孢菌素(3)。其中星形孢菌素表现出白色念珠菌的抑制活性,而诺卡胺素则对其他几个指示菌表现出较强的抑制活性。【结论】海洋链霉菌MMHS020菌株可代谢产生丰富多样的生物活性物质,具有开发成为新型抑菌生物制剂的潜力。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达

以ILTV基因组为模板 ,利用PCR特异扩增出gB基因 ,定向克隆到中间质粒载体pY_α ,构建了中间质粒pY_α_gB。然后以中间质粒pY_α_gB为模板 ,扩增出含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的hsp_α_gB片段 ,回收补平后与穿梭表达载体pRR3平端连接 ,从而构建大肠杆菌_分枝杆菌穿梭表达质粒pR_α_gB。再将其电转化至耻垢分枝杆菌M .smegmatismc2 15 5 ,ELISA检测表明重组菌株M .smegmatismc2 15 5 (pR_α_gB)的表达产物具有很好的反应原性。Westernblot检测说明gB基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。鸡胚中和试验结果表明该重组菌株可以中和 1个剂量EID50 的ILTV强毒 ,能够保护SPF鸡胚抵抗强毒攻击     

菜粉蝶osiris基因家族鉴定与发育动态

osiris基因家族是昆虫特异性基因,迄今尚未在昆虫纲以外的物种中发现同源基因。本研究利用菜粉蝶转录组数据,鉴定了菜粉蝶16个osiris基因家族成员,分属11个亚家族。通过与菜粉蝶基因组比对,发现菜粉蝶osiris基因均为断裂基因,外显子数量为3-15个;通过结构域分析,发现菜粉蝶Osiris完整编码蛋白含有信号肽和一个未知功能结构域DUF1676,且多数Osiris蛋白含跨膜结构域。系统发育分析表明,osiris基因家族成员与其他昆虫种类相应成员更似直系同源,而非种内基因扩张,再次验证了osiris基因是在昆虫物种分化之前就已形成的多基因家族。发育转录组基因表达分析表明,osiris家族不同成员表达量在不同发育阶段趋势几乎完全一致,多在菜粉蝶1龄幼虫和5龄幼虫高表达,卵期、蛹期与成虫期低表达,预示着osiris基因家族不同成员转录调控机制的相似性与发育的相关性。     

深圳地区结核分枝杆菌耐利福平株rpoB基因突变分布

目的:调查深圳地区结核分枝杆菌耐利福平(RFP)株rpoB基因突变的分布情况,建立结核分枝杆菌耐药基因快速检测的方法.方法:对55株结核分枝杆菌临床分离株的rpoB基因280个碱基(包括其核心区75个碱基)应用PCR-直接测序法(PCR-DS)测定序列,其中耐利福平株51株,敏感株4株.结果:4株敏感株无突变,92.2%(47/51)耐利福平临床分离株存在rpoB基因突变.基因突变导致531位氨基酸突变率为41.2%(21/51);导致526位氨基酸突变率为29.4%(15/51);导致516位氨基酸突变率为13.7%(7/51).联合突变发生率为2.0%(1/51).未检测到发生缺失或插入碱基突变的菌株.结论:深圳地区结核分枝杆菌耐利福平株发生rpoB基因突变最常见的是531位丝氨酸、526位组氨酸和516位天冬氨酸的基因突变,三者突变率之和为84.3%(43/51).PCR-DS方法可快速测定结核分枝杆菌RFP耐药基因突变.     

红鳍东方鲀GPI基因对急性低盐胁迫的响应机制

为了获得红鳍东方鲀Takifugu rubripes葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose-6-Phosphate Isomerase, GPI)的基因信息及其表达特性, 研究采用RT-PCR和实时荧光定量PCR (qPCR) 技术进行了GPI基因的克隆、组织表达分析及其在急性低盐胁迫下的基因响应研究。结果显示, 所获得的红鳍东方鲀GPI基因序列长1736 bp, 包含一个完整的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)。ORF由1662个核苷酸组成, 编码553个氨基酸; 预测的氨基酸序列中有2个糖异构域(Sugar Isomerase Domains), 不存在信号肽和跨膜结构域。多序列比对结果表明物种间GPI具有较高的保守性。qPCR结果表明: GPI基因mRNA在红鳍东方鲀鳃、肌肉、脑、肠、肝及肾等组织中均有表达, 其中肌肉中表达量最高。在不同盐度胁迫下, 在鳃中, 各低盐组GPI mRNA相对表达量均呈现先升高后降低又回升的趋势; 在肾中, 各低盐组GPI mRNA相对表达量变化趋势各有不同。由此推测, GPI基因在红鳍东方鲀对急性低盐胁迫的响应中发挥一定作用。     

青蒿植物内生链霉菌中的质粒pCQ4与噬菌体ΦCQ4

【目的】在青蒿植物的内生链霉菌W75中检测到一个大的环型质粒pCQ4。克隆、测序、分析和功能研究pCQ4。【方法】Southern杂交确定质粒的酶切图谱,利用接合转移和同源重组方法将质粒克隆到了大肠杆菌BAC衍生的载体上,并进行鸟枪测序和分析。【结果】获得了全长为84833 bp的pCQ4序列,预测编码129个基因,其中成簇的40个基因与其它噬菌体的基因同源。实验证明含有质粒pCQ4的菌株能够低频率释放噬菌体ФCQ4,并可以侵染消除了pCQ4的W75X孢子和形成噬菌斑。在透射电镜下观察到噬菌体颗粒,脉冲场凝胶电泳显示ФCQ4为线型DNA。pCQ4与已发表的链霉菌质粒-噬菌体pZL12比对,编码噬菌体的主要结构蛋白的基因是相似的。【结论】链霉菌大的质粒pCQ4也可以转化为噬菌体ФCQ4,其噬菌体相关的基因簇可能是可转移的单元。     

植物内生链霉菌Streptomyces sp. SAT1的基因组测序和比较基因组分析

【背景】一直以来,链霉菌都是活性物质的主要生产者,近年来随着抗生素滥用引起的环境和微生物抗药性问题越发严重,挖掘高效生物防治因子和新型抗生素成为了解决以上问题的重要手段。【目的】通过获得植物内生链霉菌SAT1全基因组序列和次级代谢基因簇信息,利用比较基因组学和泛基因组学分析SAT1菌株的特殊性以及与其他链霉菌的共性,为阐明SAT1抑菌和内生机制提供理论基础,为揭示链霉菌的生态功能提供可靠数据。【方法】通过三代测序平台PacBio Sequel完成SAT1基因组测序,利用生物信息学技术进行注释和功能基因分类;分别利用RAxML和PGAP软件进行系统发育树的构建和泛基因组分析;次级代谢基因簇的预测和分析通过antiSMASH网站完成。【结果】获得SAT1菌株的全基因组完成图,该菌线性染色体长度约7.47 Mb,包含有4个质粒,GC含量近73%,共预测到7 550个蛋白编码基因,含有37个次级代谢基因簇,分属29个类型,其中默诺霉素基因簇与加纳链霉菌具有较高相似性。42株代表链霉菌中,单个菌株次级代谢基因簇数量为20-55个,主要类型为PKS类、Terpene类和Nrps类,而且含有大量杂合基因簇,各个菌株中特有基因数目较为庞大。【结论】链霉菌SAT1菌株在基因组特点以及次级代谢基因簇的数量和类型上与其余41株链霉菌具有一定的共性,其中潮霉素B基因簇和默诺霉素基因簇合成的相关物质可能与SAT1抑菌活性密切相关。42株链霉菌中次级代谢基因簇数量的多少与基因组大小成正相关,同时大量杂合基因簇以及庞大的特有基因数目的存在说明链霉菌在长期进化过程中存在了很高程度的水平基因转移现象,可能具有重要的生态功能。     

放线菌线型复制子新的生物学功能及其应用

原核生物的染色体和质粒DNA一般为环型结构。在过去的几十年里 ,人们以不同的材料为研究对象建立了原核生物环型染色体和环型质粒生物学功能的模式体系。近年来 ,在链霉菌属 (Streptomyces)中发现 1 2～ 1 70 0kb的线型质粒[1 ] 和约 80 0 0kb的线型染色体[2 ] ,有的巨大线型质粒上还带有完整的抗生素生物合成基因簇[1 ] 。与链霉菌属同属于放线菌目 (Actinomycetales)的诺卡氏菌属 (Nocardia)和红球菌属(Rhodococcus)中也发现了线型染色体和线型质粒 ,并揭示了降解多种工业上有毒化合物的基因常由线型质粒所携带[3,4 ] 。功能研究表明 ,…     

结核分枝杆菌磷脂酰肌醇甘露糖苷的研究进展

磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidyl-myo-inositol mannoside,PIM)在结核分枝杆菌细胞膜内外含量丰富,靠磷脂酰肌醇(phosphatidyl-myo-inositol,PI)锚定在细胞膜上,并含有1-6个甘露糖和最多4个酰链。PIM不仅是结核分枝杆菌重要的组成物质,也是合成脂甘露聚糖(lipomannan,LM)和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)的结构基础。本文就PIM的合成途径、相关酶、与脂蛋白的关系,及PIM在细菌生理和免疫调节中的作用作一简要综述。     

红平红球菌絮凝基因提取及絮凝剂对血红素肽-铁絮凝特性

优化了红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)絮凝基因(NOC-1)的提取条件,探讨了该菌种发酵产生的微生物絮凝荆(MBF)对猪血红蛋白酶解的主要产物-血红素肽铁的絮凝特性.结果表明:采用溶菌酶与CTAB相结合方法,在水浴温度为65℃,时间为20 min条件下,提取絮凝基因,获得了清晰平整明亮的DNA条带,无明显弥散,DNA提取量多且断裂少,利用PCR扩增出了产絮凝基因(NOC-1)16S rRNA,测定并分析了产絮凝基因片段的1400 bp碱基组成.该MBF对猪血红蛋白酶解主要产物,即血红素肽铁絮凝特性与溶液的pH、温度、絮凝方式等有关,当猪血红蛋白酶解溶液pH值为6.0,絮凝温度45℃,结合超声波处理,MBF对血红素肽铁的絮凝率达到最佳,且絮凝沉降规律为拥挤沉淀,絮凝杌理为该菌种产生的MBF为粘多糖,分子上的活性基团(羧基、羟基、氨基等)借助离子键、氢键和范德华力,吸附血红素肽铁形成微粒,并通过架桥方式将2个或更多的微粒交联在一起从而导致絮凝.     

结核分枝杆菌Rv0733 6His抗原羊驼单域重链抗体的筛选与鉴定

单域重链抗体是目前中和胞内病原体抗原的重要分子之一,研究以结核分枝杆菌Rv0733-6His融合抗原为靶标,对羊驼非免疫单域重链抗体库进行了3轮淘洗,通过ELISA和测序方法,从1024个克隆中筛选出10个独立单域重链抗体序列,继而用原核表达并鉴定了1株Rv0733-VHH-Fe-6His抗体。免疫印迹和免疫荧光结果均显示Rv0733-VHH—Fe-6His抗体可以特异性地结合Rv0733抗原。提示Rv0733-VHH抗体可能具备结合胞内菌相关抗原的潜力。