抑制E.coli的SOS应答对恩诺沙星抗药性的影响

通过敲除SOS应答启动蛋白基因rec A,探讨SOS应答对E.coli恩诺沙星抗药性的影响,并体外评价Rec A抑制剂和恩诺沙星联用对细菌协同抑制作用的影响.利用Red重组系统,构建E.coli ATCC 25922的rec A缺失菌株E.coli ATCC 25922/?rec A;在恩诺沙星压力下,利用荧光定量PCR测定SOS应答系统相关基因rec A和umu C表达量的变化.用微量肉汤稀释法测定恩诺沙星等常用抗生素对两个菌株的MIC变化;利用梯度平板法测定恩诺沙星对两个菌株抗药性变异的影响;合成Rec A抑制剂,并评估其与恩诺沙星联合抑制E.coli生长及其抗药性的作用.结果表明,E.coli ATCC 25922/?rec A菌株对恩诺沙星的最低抑菌浓度值降低至原始菌株的1/8;经药物处理后,在梯度平板上,rec A缺失菌株较野生型不易产生抗药性;荧光定量PCR表明,rec A缺失菌株或在Rec A抑制剂作用下,SOS应答系统受到一定的抑制.敲除rec A,使菌株对恩诺沙星的抗药性和抗药率均明显降低;Rec A抑制剂在一定程度上能抑制SOS应答,起到协同抑菌作用.     

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)lexA基因的克隆与原核表达

LexA是调节SOS反应的阻遏蛋白,而且与细菌耐药性的形成密切相关。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因lexA,并对lexA基因进行了生物信息学分析;构建了lexA基因的原核表达载体PGEX-lexA,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达成功,还对LexA蛋白表达的诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行了优化。结果表明,lexA基因的开放阅读框为621 bp,编码206个氨基酸,LexA蛋白理论分子量为22.68 kD;重组蛋白表达的最优条件为37℃、0.04 mmol/L IPTG诱导6 h。     

鸭疫里默氏杆菌RecA作为一种内参蛋白的评价

由于缺少适合的内参蛋白,所以用Western blot的方法来研究鸭疫里默氏杆菌蛋白表达的调节尚未见报道。以鸭疫里默氏杆菌基因组为模板,PCR扩增含有组氨酸标签His-tag的rec A基因和截段的rec AP基因,并分别将其克隆于原核表达载体p ET32a。将重组质粒转化到表达菌Rosetta中,经1mmol/L的IPTG诱导进行蛋白质表达。用组氨酸标签亲和试剂镍-琼脂糖进行重组蛋白质的纯化。用纯化的重组蛋白对4周龄的昆明鼠进行免疫,制备多克隆抗体。Western blot实验表明,截段表达的Rec AP的多克隆抗体血清比全长Rec A蛋白的多克隆抗体血清与鸭疫里默氏杆菌总蛋白反应更特异;在铁离子限制性环境和血红素丰富环境中培养的鸭疫里默氏杆菌的Rec A蛋白表达量一致。因此,鸭疫里默氏杆菌的Rec A蛋白可以在铁离子和血红素代谢等研究中作为Western blot的内参蛋白。     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达条件的 优化及反应活性

目的探讨小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)N蛋白原核表达、条件优化及反应活性。方法参照GenBank中PPRV (Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a (+)-N,转化至BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析。在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定最佳表达条件。结果 PPRV N蛋白(64.4kD)成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别。N蛋白主要以包涵体存在,其最佳诱导条件:诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0mmol/L、诱导时间16h。结论原核表达的PPRV N蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料。     

毛白杨NBS型基因PtDRG01原核表达研究

为了分析毛白杨NBS型抗病基因PtDRG01(EF157840)编码蛋白的特性,研究构建了该基因的原核表达载体pGEX-Pt01,并导入大肠杆菌XA90,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证明,该特异蛋白的分子量约为79kD。对原核表达体系以及融合蛋白的表达特性进行优化与分析表明:最佳诱导表达条件为1mmol/L IPTG在37℃下诱导4h,所表达的融合蛋白为胞内分泌的可溶性蛋白。利用谷胱苷肽-琼脂糖亲和层析柱纯化获得了电泳纯级的目标蛋白,为PtDRG01基因编码蛋白的功能鉴定研究奠定了基础。     

乙肝e抗原在大肠杆菌中的高效表达和优化

目的:探讨乙型肝炎病毒e抗原基因在大肠杆菌中进行高效融合表达,并对表达条件进行优化和影响因素的分析.方法:从乙肝患者阳性血清中提取DNA,设计引物扩增目的基因,按常规方法克隆入pET-GST载体谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导目的基因片段的表达,经超声处理后SDS-PAGE电泳.对表达条件进行正交试验优化,并分析其影响因素的大小.结果:HBeAg以包涵体形式表达出来,其表达的GST融合蛋白的分子质量大约为44KD.最佳的表达条件为温度为30℃,IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为2h.其影响因素大小依次为诱导温度＞诱导时闻＞IPTG浓度.结论:乙肝e抗原基因在大肠杆茵中获得了高效表达.     

Barnase在大肠杆菌中的分泌表达和诱导条件优化

从解淀粉芽孢杆菌中PCR分别扩增解淀粉芽孢杆菌核糖核酸酶barnase基因及其抑制剂barstar基因,采用将barnase基因置于barstar基因保护下的克隆策略,以pET-22b（＋）质粒为基础,构建大肠杆菌分泌型表达质粒．IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS-PAGE分析并从诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间三方面初步优化诱导表达条件．     

小鼠HSP60基因的克隆与表达条件的优化

目的:克隆小鼠热休克蛋白60(HSP60)基因,在大肠杆菌中表达,并进一步对其表达条件进行优化.方法:采用RTPCR技术克隆出非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠HSP60的cDNA序列.构建重组表达载体pET28a- HSP60,以其转化大肠杆菌感受态细胞BL21( DE3),在不同的菌体浓度、不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、不同诱导时间以及不同温度条件下诱导,检测重组蛋白的表达情况.结果:获得一个含有1 721bp的cDNA的片段,重组蛋白HSP60在E.coli BL -21 (DE3)中的最佳表达条件是菌体密度A600nm为0.6,诱导时间为5h,诱导物(IPTG)浓度为4mmol/L,诱导温度为35℃,重组蛋白大小约为60kD.结论:成功克隆了小鼠HSP60基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,为重组蛋白的分离纯化及进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

长春花金属硫蛋白基因原核表达载体的构建及表达研究

将从长春花中克隆的金属硫蛋白基因（GenBank登录号：DQ016341）构建到高效原核表达载体pGEX-6P-1,并命名为pGEX-6P-1-CrMT,并对GST-CrMT融合蛋白的表达进行诱导和条件优化。对不同的诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,随诱导时间增长GST-CrMT融合蛋白表达量提高,22℃,24 h和37℃,240 min均能诱导GST-CrMT融合蛋白的最大量表达,在0.8 mmol·L^-1 IPTG浓度下可以有效诱导GST-CrMT融合蛋白的表达。     

集胞藻PCC 6803蛋白SpPhaB和SpPhaE的原核表达及结晶条件筛选

【目的】克隆蓝藻集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的编码基因并构建原核表达载体,优化培养条件以提高在大肠杆菌中可溶蛋白的表达量,筛选SpPhaB结晶条件,为PHB家族蛋白的结构与功能研究提供基础。【方法】克隆集胞藻PCC 6803 PHB合成途径的phaB、phaE基因,将phaB、phaE基因构建到表达载体pET28a中,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,提高在大肠杆菌BL21(DE3)中SpPhaB和SpPhaE可溶蛋白的表达产量,经Ni柱亲和层析纯化分别获得His-SpPhaB和His-SpPhaE蛋白,进一步筛选SpPhaB结晶条件。【结果】构建了pET28a-SpPhaB和pET28a-SpPhaE表达载体;优化获得SpPhaB可溶蛋白的最佳表达条件为：诱导温度37 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导时间7 h;SpPhaE的可溶性蛋白最佳表达条件为：诱导温度25 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间7 h,并获得了SpPhaB的结晶条件。【结论】构建了具有高效表达可溶的集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的原核表达系统,并筛选优化了SpPhaB的结晶条件,为研究SpPhaB蛋白的结构及功能奠定了基础。     

Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶可溶性表达及产酶条件优化

【目的】克隆Arthrobacter ureafaciens CZ31丙氨酸脱氢酶的编码基因(alanine dehydrogenase),转化至Escherichia coli Rosetta(DE3)中构建可溶性表达alanine dehydrogenase(ald)的工程菌CZR07并优化产酶条件。【方法】提取A.ureafaciens CZ31菌株的全基因组DNA,设计引物扩增出ald基因,与pET-28a连接后导入E.coli Rosetta中表达并纯化重组蛋白,以单因素实验结果为依据,响应面法优化发酵条件。【结果】ald全长为1119 bp,编码含372个氨基酸残基的蛋白质,分子量约为40 kDa,酶活为2.65 U/mg。响应面分析温度、诱导时间及诱导剂浓度的影响强度为IPTG浓度温度温度×IPTG浓度温度×诱导时间IPTG浓度×诱导时间诱导时间。CZR07摇瓶发酵最佳条件为温度22°C、IPTG 0.7 mmol/L、诱导时间7 h,此条件下重组酶酶活达到15.23 U/mg,与响应面优化的预测值相似,较优化前提高5.75倍。【结论】克隆并实现了CZ31中ald基因的可溶性表达,采用BBD法优化产酶的诱导条件,获得显著的优化效果,为其他工程菌株产酶条件优化提供借鉴。     

小麦Fe超氧歧化酶基因的原核表达分析

采用RT-PCR技术分离小麦Fe超氧歧化酶基因(FeSOD)的ORF全长cDNA,然后构建其原核表达载体,并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行优化,以期获得较大量的重组蛋白。结果表明:实验获得了小麦FeSOD基因的ORF全长（600 bp）,ORF全长与原核表达载体pET-Dute1相连接构建了原核表达载体pET-FeSOD,将pET-FeSOD导入宿主菌Rosetta(DE3)中,经SDS-PAGE电泳结果显示,可以高效表达融合蛋白且表达的蛋白均主要以包涵体的形式存在;重组质粒表达出25.8 kD的融合蛋白,除去载体pET-Duet1自身表达的3.0 kD蛋白后,与FeSOD编码的约为22.8 kD蛋白的大小一致;对诱导表达条件的优化结果显示,融合蛋白 pET-FeSOD最佳的诱导表达条件为:0.5 mmol/L的IPTG浓度,37 ℃诱导5 h。该研究结果为进一步深入研究该基因的特性与功能奠定了基础。     

粘质沙雷氏菌PL-06磷脂酶A1基因大肠杆菌优化表达

以粘质沙雷氏菌PL-06基因组为模板扩增得到磷脂酶A1基因plaA和含有辅助蛋白的磷脂酶A1基因plaB.plaA和plaB基因与pET-28a(+)连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)表达,得到基因工程菌AP28和BP28.AP28最佳的诱导表达条件为诱导初始OD600值0.5,IPTG浓度为0.2mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为4h,优化后磷脂酶A1蛋白表达水平从32％上升至46％,包涵体复性的磷脂酶A1酶活从10.8U/ml上升到12U/ml,相对于BP28工程菌,目的蛋白的表达对宿主细胞毒性小,而且得到的蛋白容易纯化.因此通过优化磷脂酶A1基因plaA的诱导条件,使磷脂酶A1以大量的包涵体形式表达,从而得到较高活性的磷脂酶A1并避免其对宿主细胞的毒性是可行的,而且可以得到大量纯化的磷脂酶A1蛋白,方便下一步的研究.     

人热休克蛋白70的原核高效表达

将人热休克蛋白基因hsp70片段克隆到高效原核表达载体pMAL-c2X中,酶切鉴定并进行DNA测序。将该重组表达载体转化大肠杆菌DH50α,用IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测,并以凝胶薄层扫描分析表达水平。结果表明,成功地构建了含人hsp70基因的表达载体pMAL-c2X／hsp70,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为110000并具有抗原活性的融合蛋白;改变诱导温度和时间,目的蛋白表达总量及可溶性部分所占比例不同。对人hsp70基因的克隆、表达,并对其进行表达条件的优化,为研究HSP70的结构、功能与临床应用提供了必要条件。     

小麦TaMBD2原核表达载体的构建和诱导表达

构建了小麦甲基结合域蛋白基因TaMBD2的原核表达载体pGEX-TaMBD2,并在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株中优化了融合蛋白GST-TaMBD2的诱导表达条件.结果表明,用0.3、0.5和1.0 mm01.L-1的IPTG诱导后,融合蛋白GST-TaMBD2均能有效表达,以1.0mmol·L-1IPTG诱导的效果最好;从诱导表达的时间来看,3种浓度IPTG诱导1 h后融合蛋白均开始表达,且表达量随着诱导时间的延长而逐渐增加,但在诱导6 h后的表达量增加幅度不大,因此确定诱导融合蛋白GST-TaMBD2表达的最佳IPTG浓度为1.0 mm01.L-1诱导时间为6 h.     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

黄瓜过敏性诱导反应蛋白基因(CsHIR1)原核表达及其多克隆抗体制备

该试验用黄瓜霜霉菌侵染黄瓜幼苗,并通过PCR方法克隆其过敏性诱导反应蛋白(HIR)的基因CsHIR1,构建原核表达载体pET28a-CsHIR1,实现在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的高效表达;对诱导表达的时间和IPTG的浓度进行了优化;利用钴离子螯合层析纯化了重组蛋白并制备高效价多克隆抗血清。结果表明:该黄瓜过敏性反应诱导蛋白以包涵体的形式表达,最佳诱导时间和IPTG浓度分别为4h和0.5mmol·L-1;经纯化,得到高纯度的分子量为34kD重组蛋白CsHIR1。Western blotting显示CsHIR1的抗体具有较好的特异性。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步研究CsHIR1基因在黄瓜中的功能奠定了基础。     

木薯MeNINV4基因在原核细胞中的表达及优化

转化酶是植物中蔗糖降解过程的关键酶之一,可催化蔗糖不可逆地分解为葡萄糖和果糖,在植物生长发育、平衡碳水化合物及对逆境胁迫的响应等方面具有重要的作用。本研究利用从木薯中克隆到碱性/中性转化酶MeNINV4基因,将其重组构建到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组载体MeNINV4-pGEX-6p-1,并对其融合蛋白表达的IPTG诱导浓度、起始菌液浓度、诱导温度和诱导时间条件进行优化。研究结果发现:GST-MeNINV4融合蛋白的表达量在一定范围内随着IPTG诱导浓度、起始菌液浓度和IPTG添加时间的增加而增加。重组菌在OD_(600)为1.0左右,IPTG浓度为0.6 mmol/L,在37℃条件下诱导5 h后,重组蛋白的表达量达到最大值。本研究通过诱导目的蛋白在原核细胞中的表达并且优化表达条件,使目的蛋白在原核细胞中的表达量显著增加,为进一步研究目的蛋白的结构、功能及酶学特性等生物学功能提供理论依据。     

FASN基因的原核表达及生物信息学分析

脂肪酸合成酶(FASN)在生物体内起着重要的作用,主要参与恶性肿瘤的数量调控。本研究旨在构建pET28a-FASN原核表达载体,并表达重组His-FASN蛋白,对该基因进行结构与功能的生物信息学分析。设计FASN基因特异性引物,通过PCR扩增获得的目的基因与原核表达载体pET28a连接,经IPTG诱导表达His-FASN蛋白。获得基因片段大小为1 320 bp,编码440个氨基酸;成功构建至pET28a原核表达载体,通过优化表达,确定在温度为35℃、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间为6 h的条件下融合蛋白表达量较高,获得蛋白大小约为53 kD;生物信息学分析结果表明FASN基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,不存在信号肽及跨膜区,可成为蛋白激酶磷酸化位点有12个Ser、5个Thr、3个Tyr。此外,从蛋白相互作用网络中发现,相互作用的蛋白包括主要酰基辅酶A合成酶长链家族成员及乙酰辅酶A羧化酶家族成员,为开发抑制剂药物提供了理论依据。