不同年龄大鼠血清对骨髓间充质干细胞衰老影响的实验研究

制备成年(8～12周龄)和老年(64～72周龄)SD大鼠血清,实验随机分为两组:年轻血清组和老年血清组,分别采用成年和老年SD大鼠血清培养成年MSCs 36小时后,衰老相关β-半乳糖苷酶和活性氧染色观察细胞衰老,MTT法检测细胞增殖,AO/EB法和Hoechst 33342染色法观察细胞凋亡及存活情况。免疫细胞化学和Western blot法检测衰老相关蛋白γ-H2A.X、p53表达,RT-PCR法观察p53、p21 mRNA表达。结果发现,与年轻血清组相比,老年血清组MSCs衰老细胞数明显增加((96.2±24.1)/500细胞vS(30.8±8.2)/500细胞,P<0.01)、增殖能力减弱,凋亡率升高,γ-H2A.X、p53蛋白表达水平升高,p53、p21 mRNA表达升高。这些结果说明、老年SD大鼠血清可促进MSCs发生衰老变化,并抑制MSCs增殖及存活能力,这一作用可能与DNA损伤反应和p53/p21信号通路有关。     

D-半乳糖诱导衰老小鼠睾丸结构与功能变化及其氧化应激相关机制

目的建立D-半乳糖(D-gal)致小鼠衰老模型,探讨睾丸结构与功能变化及相关机制。方法 C57BL/6J小鼠随机分为衰老组和对照组。衰老组小鼠皮下注射D-gal;对照组等时等量注射生理盐水。模型复制完成第2d,采集小鼠内眦静脉血测定血清睾酮水平;取小鼠睾丸测定睾丸指数;石蜡切片HE染色观察睾丸组织形态学;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测生精细胞衰老;TUNEL法检测生精细胞凋亡;制备睾丸组织匀浆上清,ELISA检测TNF-α、IL-1β、和IL-6的水平;硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量;酶学法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性;ABTS法检测总抗氧化能力(TAC);Western blotting检测衰老相关蛋白p21与p53表达水平。结果衰老模型组小鼠血清睾酮水平显著下降,睾丸脏器指数无明显差异,生精小管结构紊乱,生精细胞病理损伤明显,SA-β-Gal染色阳性的生精细胞百分率上升,细胞凋亡指数上升,睾丸匀浆上清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著上升,SOD活性、TAC能力显著降低,MDA含量上升,睾丸组织中衰老相关蛋白:p21与p53表达水平显著提高。结论 D-gal建立的衰老动物模型可见睾丸形态结构与功能出现衰老的生物学表现,其机制可能与氧化应激损伤及p21/p53通路激活有关。     

腺病毒介导的p33ING1b过表达显著促进衰老细胞的DNA损伤修复

p33^ING1b是一个较晚发现的肿瘤抑制基因ING1的主要表达形式,自从被成功克隆以后得到了广泛的研究,已有的研究表明,p33^ING1b参与了细胞的生长抑制、凋亡、染色质重塑、DNA损伤修复、肿瘤抑制和细胞衰老等。但是它在细胞衰老过程中的作用特别是对衰老细胞DNA损伤修复的影响还没有被地阐明,在本研究中,我们首先用2BS细胞构建了细胞衰老模型,通过RT-PCR和Western blot技术证实p33^ING1b在衰老细胞中的表达水平是下调的,然后通过构建和包装包含p33^ING1b基因的腺病毒,将p33^ING1b导入年轻和衰老细胞中并使其过表达,用HCR（host cell reactivation）方法检测年轻细胞和衰老细胞DNA损伤修复能力。我们的实验首次表明,相对于年轻细胞,p33^ING1b的过表达使衰老细胞的DNA的损伤修复能力显著增加,这说明p33^ING1b在衰老细胞中的表达下调与衰老细胞DNA损伤修复能力的下降有关,也进一步证实了p33^ING1b在细胞衰老过程中起着十分重要的作用。     

衰老或肿瘤: 端粒酶和p53的相互作用

端粒酶和p53两者在肿瘤和衰老的发生发展过程中都起着关键的作用。在人类大多数的肿瘤中都发现了这一现象: p53基因发生突变和端粒酶的重新激活。端粒酶和p53基因的治疗逐渐成为肿瘤治疗的重要手段之一。文章论述了端粒酶或p53基因敲除的不同组合的小鼠模型(mTR-/-p53+/+; mTR-/-P53-/-)的衰老与肿瘤表型, 对端粒功能异常可抑制或促进肿瘤发生的辩证作用作一综述, 以期理解p53与端粒酶在衰老与肿瘤发生中的辩证相互作用, 寻求一种治疗肿瘤的新思路。     

p53与细胞周期调控

p53蛋白首先在SV-40转染的小鼠细胞中发现,继之在不同类型的转化细胞系中也被检测到。进一步研究证明它还存在于正常细胞和组织中,但与转化细胞相比其含量要低得多。 1988年Levine和Oren等报道了第一个被鉴定的p53突变型p53 Vall 35。以后,人们在转化细胞中检测到各种类型的p53突变型。为了有效地研究p53蛋白,已发展了很多识别p53蛋白的单克隆抗体,其中有的具有种     

EZH2在衰老细胞中表达下调引起Netrin-1表达增加进而促进交感神经轴突生长

交感神经在一些疾病动物模型和老年小鼠模型组织中呈现发芽生长和密度增加的趋势。这提示,交感神经与衰老密切相关。本研究采用免疫组织化学检测老年小鼠肝、肺、脾组织和人结肠腺瘤组织衰老模型中交感神经标记蛋白酪氨酸羟化酶（TH）的表达情况。结果证实,衰老组织中的交感神经密度显著增加。然而,目前对衰老组织的这种生物学改变机制尚不明确。本研究以人成纤维细胞系2BS为实验材料,经转录组测序发现,分泌性轴突导向因子导蛋白-1在衰老细胞中上调表达。ELISA和实时定量PCR结果显示,在博来霉素、离子射线、癌蛋白RasV12过表达所诱导的早衰及复制性衰老的2BS细胞中,导蛋白-1的蛋白质和mRNA表达量均比年轻对照组高。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是调控衰老细胞分泌蛋白质表达的重要途径。为明确导蛋白-1在衰老细胞的上调表达是否与DDR相关,使用小分子化合物抑制DDR的重要效应分子ATM（ataxia telangiectasia mutated）和CHK2（checkpoint kinase 2）在博来霉素诱导的衰老2BS细胞中的活性。ELISA和实时定量PCR结果显示,与博来霉素诱导衰老组相比,阻断衰老细胞中的DDR活性未引起导蛋白-1表达水平的改变。提示导蛋白-1在衰老细胞中的表达不依赖于DDR途径。Western印迹检测发现组蛋白甲基转移酶EZH2在衰老细胞中的蛋白质表达明显少于年轻细胞;实时定量PCR结果表明使用小分子化合物抑制EZH2在年轻细胞中的活性引起导蛋白-1表达增加;CHIP实验检测发现,EZH2对年轻细胞的导蛋白-1启动子区DNA片段富集显著而在衰老细胞未见富集。以上结果提示EZH2在衰老细胞中的下调表达是导蛋白-1表达增加的重要原因。大鼠DRG与衰老细胞共培养结果证实,衰老细胞对交感神经具有导向作用,并且该现象依赖于导蛋白-1的分泌。根据以上结果得出结论,导蛋白-1在衰老细胞中的上调表达不依赖于DDR途径而与EZH2的下调表达相关,衰老细胞通过分泌导蛋白-1促进交感神经轴突定向生长。本研究为深入探讨衰老相关疾病的发生机制以及防治提供了新线索,具有一定的科学意义和潜在的转化应用价值。     

莪术醇诱导人肝癌HepG2细胞衰老及其机制研究

为进一步探讨莪术醇的诱导细胞衰老的机制,该研究采用荧光定量PCR技术对莪术醇处理后细胞中81个细胞衰老相关基因差异表达谱进行分析,结果发现TP53及其下游基因p16Ink4a、p21Waf1/Cip1和p27Kip1等的表达水平显著升高,伴随ABL1、ALDH1A3、CHEK2、HRAS、PTEN等多个衰老信号通路启动与效应关联基因的转录显著增强,而CyclinA2、IGFBP3、SIRT1以及TERT等细胞周期进程与衰老信号通路的负性调控基因的表达水平则显著降低。Western印迹检测结果显示,p53及其下游周期素依赖性蛋白激酶抑制物(CKI)分子p21WAF1和p16INK4水平升高,CyclinA2水平降低,与PCR结果一致,并伴野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)水平显著增高,提示莪术醇可能通过激活p53信号通路诱导HepG2细胞衰老。该研究进一步发现莪术醇能够诱导HepG2细胞发生衰老表型改变,伴G0/G1期周期阻滞。     

p53过表达抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性

NKX3.1是前列腺特异表达的同源盒基因,在前列腺癌的发生发展中起重要作用,而在前列腺癌进展中常会发生p53的基因突变.为研究两者之间的关系,构建NKX-3.1启动子(1 040bp)-荧光素酶报告基因重组质粒（pGL3-1040）及其缺失突变体,瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP.通过荧光素酶表达活性分析,检测p53过表达对NKX3.1启动子活性的影响.结果表明：p53在LNCaP细胞中过表达可明显抑制NKX3.1启动子活性;RT-PCR及Western印迹检测p53过表达对NKX3.1表达的影响.结果表明,p53过表达可以明显抑制同源盒基因NKX3.1的表达.通过TRANSFAC软件分析,在NKX3.1基因上游-526至-507区存在一个p53反应元件的5′核心序列.缺失pGL3-1040中的p53反应元件核心序列并不能消除p53对NKX3.1启动子的抑制作用,表明p53不是通过p53反应元件直接抑制NKX3.1启动子活性.进一步通过5′缺失突变分析,发现NKX3.1启动子-140～+8 bp区仍受p53负调控.此148 bp区域中含有一个Sp1和一个CREB元件,瞬时共转染Sp1表达载体或CREB表达载体的结果表明,p53并不是通过与Sp1或CREB相互作用对NKX3.1启动子发挥抑制作用的.上述结果表明,p53过表达可以抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性,下调NKX3.1基因的转录,其调控机制有待进一步研究.     

蒙花苷消除衰老骨髓间充质干细胞的衰老表型发挥抗衰老作用

目的:探讨蒙花苷(Linarin,LR)是否可以消除衰老骨髓间充质干细胞(BMSC)的衰老表型发挥抗衰老作用。方法:取4周龄80 g-100 g的雄性SD大鼠大腿骨髓腔内的骨髓间充质干细胞,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养至三代,使用D-gal诱导骨髓间充质干细胞衰老,使用SA-β-gal染色、活性氧检测、蛋白免疫印迹验证骨髓间充质干细胞细胞衰老状态,通过蛋白免疫印迹检测衰老BMSC与正常BMSC中细胞保护性蛋白sirt1、sirt6及衰老相关蛋白p16、p21、p53的表达水平。之后,我们通过不同浓度LR处理衰老骨髓间充质干细胞。最后,通过蛋白印迹分析检测未处理组与LR处理组衰老相关蛋白表达情况。观察蒙花苷能否可以消除衰老的大鼠骨髓间充质干细胞衰老表型。结果:衰老的骨髓间充质干细胞细胞保护性蛋白sirt1、sirt6降低及衰老相关蛋白p16、p21、p53明显增高,衰老细胞中与DNA损伤相关的细胞核内蛋白γ-H2AX表达明显增加。而蒙花苷处理后,衰老细胞组衰老相关蛋白p16、p21、p53明显降低,γ-H2AX蛋白阳性细胞明显减少。结论:蒙花苷可以剂量依赖性的消除衰老的大鼠骨髓间充质干细胞的衰老表型发挥抗衰老作用。     

DMBA、垂体移植诱发性乳腺瘤内172^Arg—Leu突变型p53的特性及其与基因重排和扩增关系的研究

p53最早发现于SV40转化的细胞系,后来几乎在不同类型的细胞内均检测到这种蛋白质。野生型P58是一种有效的肿瘤抑制因子,但突变体p53可与ras－肿瘤原因协同转化体外的腺代细胞,而且在肿瘤发生时常伴随着p53基因的突变。乳腺瘤内,p53基因的突变率为40％,并可见到某些肿瘤基因参与癌症的形成过程,暗示p53基因结构和功能和改变可能与这些基因的重排和扩增有关。本实验选择4种不同年龄的172^Arg-Leu突变型p53转基因小鼠为受试动物,将同系动物的垂体腺植入小鼠的肾脏后,再以致癌剂DMBA处理,以使动物乳腺内的p53基因表达和诱导小鼠乳腺癌形成。从乳腺癌小鼠分别摘取乳腺组织,提取DNA和RNA,以H－ras、PCNA、CylinD1、p53基因的DNA片段作为特异性核酸探针,进行Southerm Blotting和Northern Blotting分析,以检测在突变体P53表达的情况下,PCNA、H-ras、CyinDl等基因在体内的变化规律,实验发现,在4组不同的受试动物中,其乳腺癌细胞的PCNA和H－ras两种基因发生了基因重排,特征是其DNA标本中分别出现了一条很强的额外杂交带,但对照动物乳腺该类基因以及被检测的肿瘤基因中均未发现结构上有任何改变。这表明,仅管内源性p53和突变体p53的高效表达抑制或延缓肿瘤的发生,但不能从根本上阻止PCNA和H－ras基因的重排。肿瘤基因的拷贝数及其表达的定量测定结果证明,虽然CyclinDl和H-ras基因在所有检测的小鼠癌组织和正常乳腺细胞均有扩增,但扩增的量极低,很难构为成肿瘤形成的主要因素。其他基因,如：MDM、PCNA等,也未见到明显改变。由于p53基因在转化细胞和肿瘤组织内的存在方式与基因扩增密切相关,乳腺癌小鼠体内的突变型p53的高效表达可能对基因扩增起到了抑制作用。最终,在一定程度上推迟了转基因小鼠的肿瘤形成过程。此外,致癌剂DMBA可诱发小鼠乳腺癌形成。其主要机制是使H－ras基因的第61位密码子发生突变。本实验证明,DMBA虽使垂体移植转基因小鼠发生了乳腺癌,但其作用点并非常见的第61位密码子,而是使H－ras基因发生重排,并使PCNA基因结构也发生同样变化。这种现象不仅是DMBA致癌方式上的新发现,而且表明该致癌剂的这种生物学效应可能与突变体p53的功能有关。     

辐射诱导细胞衰老的机制研究进展

辐射诱导细胞衰老属于胁迫诱导的早熟性衰老。研究表明在外界应激条件下,衰老的细胞会出现肿胀、增殖减弱、周期受阻、β-半乳糖苷酶活性增强、p53-p21和p16-RB信号通路以及调控衰老的miRNAs被激活等特点。本文综述了辐射诱导细胞衰老的过程,并着重介绍了细胞衰老的两条信号通路p53-p21和p16-RB以及miRNAs对细胞的调控,为进一步的基础研究提供理论参考。     

外源基因转染导致小鼠体细胞过快衰老 及p16INK4a表达水平变化

对小鼠胎儿成纤维细胞进行外源基因转染时发现, 外源基因转染后的小鼠体细胞染色体端粒的长度以每代47 bp碱基缩短; 在转染后的衰老细胞中, 或细胞随着增龄, p16^INK4a 5′-调控区DNA甲基化程度逐渐降低; 利用RT-PCR与Northern blot证明, 衰老细胞与年轻细胞中的p16^INK4a基因的表达水平存在显著差异, 传代45代的细胞和外源基因转染后的衰老细胞p16^INK4a基因的表达水平大约是原代细胞的12~16倍, 而原代细胞与20代细胞间的差异很小。外源基因转染后的衰老细胞核移植后能支持克隆胚胎的体外早期发育。     

细胞周期抑制因子p19ARF对人二倍体细胞衰老的影响

为了探讨细胞周期抑制因子p19ARF对人二倍体细胞复制性衰老的影响, 构建了重组p19ARF真核表达载体, 并通过脂质体的介导将p19ARF基因转染到人二倍体成纤维细胞WI-38中过表达, 观察其对WI-38细胞衰老的影响. 结果发现与对照细胞相比, 在p19ARF基因导入后, 细胞中p53和p21的表达水平明显上调, 细胞传代数减少10~12代, 生长速率降低, 细胞周期阻滞于G₁期, 衰老标志物SA-β-gal染色阳性率上升, 线粒体膜电位下降, 细胞形态呈衰老细胞样变化, 这些结果表明p19ARF高表达可促进人二倍体细胞的衰老进程.     

p53调控肿瘤与衰老平衡的研究进展

衰老和肿瘤一直是科学研究的两个重要课题,健康长寿的生活已是人们追求的目标,但是各种因素致使肿瘤的死亡率、患病率日益提升。值得注意的是,衰老和肿瘤这两个看似截然相反的生物学后果之间存在着共享的分子机制,从这些共享机制中找到平衡点,有利于人们提高生活质量、延长寿命。p53在这个过程中有着积极的作用,对大象和小鼠的研究证明高表达且受控制的p53会提高机体对于肿瘤的耐受性,同时还不会导致过早衰老、寿命缩短现象的发生。文章总结了p53在衰老和肿瘤中的调节作用。     

miR-138转录可下调p33ING1在衰老细胞中的表达

p33ING1参与了多种生物学过程,包括细胞生长抑制、凋亡、DNA损伤修复、染色质重塑等．近来研究显示,p33在细胞衰老过程中表达降低,这可能与衰老细胞的抗凋亡有关．但p33在衰老细胞中表达下调的分子机理仍不清楚．我们发现,在衰老细胞中miR-138表达升高与p33基因的表达降低密切相关．以下实验结果支持如此结论：(1)与年轻细胞相比,带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性在衰老细胞中降低;突变3′UTR上的miR-138结合位点可升高报告载体荧光素酶在衰老细胞中的活性;(2)在衰老细胞中miR-138的表达升高;(3)在年轻细胞中,过表达miR-138不仅可抑制带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性,而且下调细胞内p33ING1基因mRNA和蛋白水平.与此相反,抑制miR-138活性可升高带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性,并且上调细胞内p33ING1基因mRNA和蛋白水平．这些结果表明,p33ING1基因是miR-138的靶基因;在衰老过程中,miR-138表达升高, 由此导致该基因的表达降低．     

EGCG对衰老小鼠脑组织NF-κB蛋白表达的影响

本研究旨在探讨EGCG的抗衰老作用及对小鼠脑组织NF-κB蛋白表达的影响。首先通过颈背部皮下注射D-半乳糖诱导建立小鼠衰老模型,并对衰老程度进行鉴定;其次,利用EGCG处理衰老小鼠,以超氧化物歧化酶(SOD)活性和β-半乳糖苷酶活性确定EGCG的抗衰老作用;最后,进一步利用蛋白免疫印迹方法检测EGCG对脑组织衰老相关信号分子NF-κB-P65和IκBα(Y42)蛋白表达的影响。研究结果表明:成功建立了小鼠衰老模型,并发现小鼠衰老后出现记忆能力下降等行为学变化;外周血SOD活性下降;脑组织IκBα表达下调,NF-κB蛋白表达被激活。而EGCG处理后,血清SOD活性恢复,IκBα表达呈上调趋势,NF-κB蛋白表达被抑制。因此,本研究发现EGCG具有明显抗衰老作用,其机制可能通过抑制NF-κB的表达而阻碍了细胞衰老的进程。该研究结果为EGCG相关的抗衰老保健品开发提供了一个新的方向。     

转录因子AP-2beta和p53蛋白相互作用的研究

转录因子p53与AP-2基因家族成员AP-2beta发生突变后,均会导致个体出现相应的疾病。本文首先利用两个重组质粒p CMV-HA-p53和p Myc-AP-2beta,转染永生化的胚胎肾细胞HEK293(野生型),在细胞中表达相应蛋白质。通过免疫共沉淀实验证明AP-2beta和p53蛋白在体内可以相互作用。并将梯度增加的p MycAP-2beta质粒及等量p CMV-HA-p53质粒转染到HEK293细胞,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明AP-2beta能正向调控p53蛋白的表达。为了进一步探讨AP-2beta与p53的作用机制,利用蛋白质合成抑制剂CHX(cycloheximide)处理转染了AP-2beta与p53表达质粒的细胞,实验结果说明,AP-2beta能增加p53蛋白的稳定性来调控p53的表达。     

表皮生长因子对人二倍体成纤维细胞p21~(WAF-1)基因表达的双向性影响

p2 1 WAF-1又称 sdi- 1 ,是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 ( CDK)的抑制物基因 ,与细胞增殖调控及细胞衰老密切相关 .本研究为了解正常细胞中 p2 1 WAF-1对生长因子的反应性 ,以及其在细胞衰老时的表现 .我们以不同代龄的人胚肺二倍体成纤维细胞 ( 2 BS细胞株 )为实验对象 ,通过 Northern杂交术 ,观察表皮生长因子 ( EGF)对年轻 (低代龄 )细胞与衰老 (高代龄 )细胞 p2 1 WAF-1基因表达的影响 .结果显示 :p2 1 WAF-1在衰老 2 BS细胞中高表达 .EGF对年轻细胞 p2 1 WAF-1的表达有诱导作用 ,对衰老细胞有轻微诱导作用 ,在刺激后 3h左右达高峰 ,3～ 6h逐渐回落 ,并持续下降 .作用后 1 2h,其表达水平反而远低于作用前 .此作用在年轻细胞较为明显 .由此可见 :( 1 ) EGF对人二倍体成纤维细胞 p2 1 WAF-1的表达有双向性影响 ,先是一过性诱导 ,随后转为阻抑 ;( 2 )衰老细胞 p2 1 WAF-1对EGF的反应性有所降低     

NF-κB、p53和bax在顺铂所致肾损伤中的作用

目的探讨NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)和顺铂治疗对Lewis肺癌小鼠肾脏组织中p53和bax表达的影响。方法给小鼠皮下接种Lewis肺癌细胞用顺铂和/或PDTC治疗,15 d后处死小鼠。取肾脏并制成切片,应用免疫组织化学技术检测p53和bax蛋白的表达。结果对照组和PDTC组小鼠肾脏未检测到p53和bax表达;顺铂治疗小鼠肾小管上皮细胞表达p53和bax;合用PDTC治疗组小鼠p53和表达水平较单用顺铂治疗组明显减低。结论合用PDTC下调顺铂诱导的p53和bax表达上调,减少肾细胞凋亡。     

食管鳞癌p53、c-erbB-2蛋白表达研究

为探讨p53、c-erbB-2蛋白表达与食管鳞癌生物学行为的关系,应用免疫组化LSAB法研究181例食管鳞癌中p53、c-erbB-2蛋白的表达。结果发现,正常食管粘膜均无p53、c-erbB-2蛋白的表达。47％食管鳞癌出现p53表达,p53阳性病例癌旁非典型增生上皮出现p53表达,p53阴性病例癌旁非典型增生上皮亦为阴性。p53阳性表达率与患年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级,临床TNM分期无关,且与预后无关。51.4%食管鳞癌呈现c-erbB-2蛋白表达,癌旁非典型增生上皮无c-erbB-2表达。c-erbB-2阳性率与肿瘤组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及肝转移有关,c-erbB-2阳性表达预后较差。结果提示,p53表达在食管鳞癌发生中起重要作用;c-erbB-2表达在食管鳞癌浸润转移中起重要作用。同时进行p53、c-erbB-2蛋白免疫组化检测,有助于对食管鳞癌进行早期诊断,监测病情和判断预后。