西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组来源的高比活α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及酶学性质

【背景】α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶是一类重要的半纤维素酶,能协同其他半纤维素酶降解木聚糖,在食品、医药、生物质能转化中具有应用价值。【目的】挖掘新型α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,对其进行异源表达、纯化并研究其酶学性质。【方法】从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中扩增α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达,并进行酶学性质研究。【结果】从粪便微生物宏基因组中扩增得到α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶基因AbfNC2b_38,并获得重组α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶AbfNC2b_38,其分子量为57.04 kDa。AbfNC2b_38的最适作用条件为55 ℃、pH 6.0,K_m和V_max分别为(6.48±0.73) mmol/L和(1 248.0±114.6) U/mg,与其他宏基因组来源的α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶相比具有最高比活300.81 U/mg。AbfNC2b_38具有较好的乙醇和NaCl耐受性,30%乙醇下耐受1 h保持68%的活性;25% NaCl中耐受1 h,相对酶活仍保持在约70%。与木聚糖酶协同降解山毛榉木聚糖时,协同率最高为1.21。【结论】从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中获得新型α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶基因AbfNC2b_38并成功异源表达。AbfNC2b_38具有较好的乙醇和NaCl耐受性,能与木聚糖酶协同作用提高木聚糖的降解效率,在饲料、食品加工等领域具有潜在的应用价值。     

阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan)的开发利用

详细介绍了从稻糠中提取的阿拉伯木聚糖的组成、生化性质、药学作用及其在临床治疗和保健中的应用。     

糖化过程中阿拉伯木聚糖溶解及内切木聚糖酶随机进攻预测模型的建立

建立了糖化过程中阿拉伯木聚糖溶解及内切木聚糖酶随机进攻的预测模型,希望通过此模型能预测在不同初始条件和参数设置下糖化过程中阿拉伯木聚糖的浓度,以减少其在酿造过程中的负面作用。结果显示,此模型预测麦汁中阿拉伯木聚糖浓度的误差在-9.5%到+13.6%之间。工业验证模型的误差要大于实验室条件下的误差,分别为16.8%和17.9%。仿真结果表明,麦汁中阿拉伯木聚糖的浓度随糖化初始温度的升高而增加,而延长糖化初始时间能降低阿拉伯木聚糖的含量。并且麦芽中内切木聚糖酶活对麦汁中阿拉伯木聚糖的浓度的影响要远远小于麦芽中阿拉伯木聚糖的初始值。     

阿拉伯糖苷酶的研究进展

半纤维素是一类取之不尽而又亟待开发利用的碳水化合物。阿拉伯糖苷酶是降解从而利用半纤维素的一个重要酶 ,有关阿拉伯糖苷酶及其基因的研究在国际上得到了广泛而深入的开展。主要就阿拉伯糖苷酶的分类、特性、基因克隆表达及其应用作一综述。     

阿拉伯木聚糖（Arabinoxylans）治疗肥胖的研究进展

阿拉伯木聚糖是一种从小麦麦麸中提取的膳食纤维,可从调节炎症因子、脂肪因子等多方面发挥治疗肥胖的作用。本文综述阿拉伯木聚糖治疗肥胖的研究进展。     

重组阿拉伯糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达及其活性分析

假密环菌是一种果树腐病菌,具有较强的分解代谢纤维素的能力。本文根据已克隆出的阿拉伯糖苷酶基因序列（Accession Number AJ620046）设计引物从假密环菌的mRNA中克隆出阿拉伯糖苷酶的ORF片段,构建重组质粒pPIC9-AF,与组氨酸标签融合,电转化毕赤酵母菌GS115并进行诱导表达。所得到的重组阿拉伯糖苷酶在30-35℃时有较高的酶活,最适反应活性pH值在6.0-8.0之间,而在pH4.0－8.0范围内酶活基本保持在80%以上,比大多已报道的阿拉伯糖苷酶最适pH范围宽。本研究工作对于高效表达重组阿拉伯糖苷酶以及对其进一步的酶学性质研究提供了一个良好的基础。     

极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究

采用PCR从海栖热袍菌(Thermotoga maritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因,以pET20b为表达质粒,与其C末端6个组氨酸标签序列融合,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为90～95℃和pH 5.0～5.5,在pH 4.2～8.2之间酶活力稳定,95℃的半衰期为4h;SDSPAGE测得酶的分子量为56.57 kD,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯阿拉伯呋喃糖苷（pNPAF）有专一性水解作用,其动力学参数Km值为018mmol/L, Vmax为139μmol/min·mg。     

小麦阿拉伯木聚糖的益生功能及对肠道微生态的调节

病原体的耐药性日渐增大,替代抗生素的益生元成为近年来研究的热点问题。小麦阿拉伯木聚糖（AX）及水解产物阿拉伯低聚木糖（AXOS）作为一种新型益生元,对人和动物肠道益生菌有特异性增殖效果。此外,与菊粉等益生元相比,降解后的小麦AX显著提高小鼠结肠和盲肠短链脂肪酸的含量及其抗肿瘤免疫活性。最新研究表明,添加GH11木聚糖酶（50mg EP/kg）能够溶解和降解麦麸AX,并产生可通过盲肠微生物群发酵的低平均聚合度（avDP值为4~8）的AXOS,丁酸水平增加2mmol（P<0.05）,产丁酸的细菌属柔嫩梭菌和肠单胞球菌显著增加,而拟杆菌的水平显著降低,导致微生物群移位并对体外跨上皮耐药性有益。本文主要介绍近年来关于小麦AX、AXOS益生功能及对肠道微生态的研究,为小麦产品及饲粮的有效利用与开发提供科学依据。     

里氏木霉GH61家族糖苷酶的高效表达及酶学特性研究

【目的】GH61家族糖苷水解酶具有葡聚糖氧化酶活性,通过对葡聚糖链的随机氧化而破坏木质纤维素的结晶结构,从而使木质纤维素容易被纤维素酶降解。重组表达、纯化获得里氏木霉的GH61家族糖苷水解酶(TrGH61,原名为EGⅣ),并研究其在纤维素酶水解木质纤维素中的作用。【方法】通过Overlap PCR将里氏木霉丙酮酸脱羧酶的启动子、纤维二糖水解酶cbh1的信号肽、EGⅣ基因和PDC终止子依次连接构建了里氏木霉的表达盒,通过该表达盒使TrGH61蛋白基因整合到里氏木霉的基因组DNA上进行同源表达。研究表达产物TrGH61的水解活性、与纤维素酶水解协同效应,以及TrGH61作为金属氧化酶的特性研究。【结果】在PDC启动子的作用下,TrGH61得到高效表达,摇瓶培养的表达量达到2.33 g/L。TrGH61有微弱的内切葡萄糖苷酶活性,比活力为0.02 IU/mg,但能显著提高纤维素酶水解稻草粉的活性,协同度最高可达1.998。低浓度的金属离子Cu2+、Co2+和还原性电子供体还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸、焦性没食子酸均能显著促进其水解效应。TrGH61能够降低稻草粉纤维素聚合度和结晶度。【结论】通过PDC启动子可以实现TrGH61蛋白高效组成型表达,TrGH61作为纤维素酶活性促进因子,通过破坏纤维素结晶结构作用机制协同增强纤维素酶水解木质纤维素。     

木聚糖酶异源表达的研究进展

木聚糖(xylan)在自然界中的含量极其丰富,在农作物和农林剩余物中大量存在。随着能源资源问题的日益凸显,对木聚糖的应用和研究越来越受到重视。木聚糖酶(xylanase)是可以将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一类水解酶,近年来,为了实现木聚糖酶的高产、高酶活表达,科研工作者做了大量的研究工作,就木聚糖酶异源表达(heterologous expression)的研究进展进行综述。     

鸟肠球菌(Enterococcus avium)中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】前期工作中筛选出一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,经分子生物学方法鉴定为鸟肠球菌(Enterococcus avium)。α-L-鼠李糖苷酶能够从天然类黄酮化合物中特异性切割末端鼠李糖,在食品生产、医药加工和化工等方面具有极大的开发前景和应用价值。【目的】克隆、表达鸟肠球菌中α-L-鼠李糖苷酶基因,进一步对重组蛋白的酶学性质进行研究。【方法】以鸟肠球菌(Enterococcus avium)strain 352基因组中推定的α-L-鼠李糖苷酶基因序列为基础,设计特异性引物扩增其编码区序列。以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒,将重组蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达。使用镍亲和层析纯化重组蛋白,以p NPR为底物测定重组蛋白的酶学性质。【结果】重组蛋白Ea Rha1分子量大小约为130 k Da。以p NPR为底物,Ea Rha1最适p H是7.0,最适温度为50℃,在p H 5.0-8.0稳定性较好,在40℃以下能保持较高酶活。金属离子对Ea Rha1有不同程度的促进或抑制作用。甲醇对Ea Rha1有抑制作用,并且抑制作用随着甲醇浓度的增大而增强。酶动力学常数K_max和V_max分别为0.35 mmol/L和4.2μmol/(mg·min)(R²=0.999)。Ea Rha1能催化水解新橙皮苷、柚皮苷和芦丁。【结论】通过对重组蛋白Ea Rha1酶学性质的研究,确定了该蛋白对黄酮类化合物的水解特性,为黄酮类化合物的生物转化奠定了理论基础。     

卡介苗荚膜阿拉伯甘露聚糖的提纯鉴定及其免疫调节功能的初步研究

确定卡介苗(BCG)中荚膜中糖成分阿拉伯甘露聚糖(AM)的功能。

本研究从我国目前普遍使用的BCG中, 利用氯仿甲醇抽提方法分离纯化荚膜AM, 经AM单克隆抗体鉴定后, 腹腔注射BCG致敏小鼠, 体内外评价AM的免疫调节功能。

AM能在小鼠体内增强BCG诱导的迟发型超敏反应(P < 0.01), 体外免疫指标检测发现AM提高小鼠脾细胞Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达水平(P < 0.05)。

BCG的荚膜AM是潜在的保护性抗原, 并为优化BCG提供理论依据。

     

结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的提纯及活性初步鉴定

目的:提取纯化结核分枝杆菌(MTB)脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)。方法:MTB菌体彻底破碎后,去脂,去蛋白,上清液经苯酚萃取,酒精沉淀,得到LAM;以提取的LAM作为包被抗原检测血清中的LAM抗体。结果和结论:提取到LAM抗原,免疫印迹表明,LAM迁移范围相对分子质量为25×103~40×103,主要集中在35×103处。在64例肺结核患者中,有43例LAM-ELISA检测阳性(敏感性为67.19%);在67例健康志愿者中,有64例LAM-ELISA检测阴性(特异性为95.52%)。     

盐穗木HcUKPP原核表达及重组菌非生物胁迫耐受性研究

该研究采用RT-PCR技术,从盐穗木cDNA文库中克隆获得未知功能多肽HcUKPP基因,构建了大肠杆菌Escherichia coli BL21∷pET30a-HcUKPP重组菌株,并检测了重组菌株在不同非生物胁迫下的耐受性。结果显示:HcUKPP基因开放阅读框为243bp,融合His的HcUKPP蛋白的分子量约为15kD。在37℃条件下,不同浓度的异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h后His-HcUKPP融合蛋白均可表达,且E.coli BL21∷pET30aHcUKPP重组菌在不同浓度NaCl(100~900mmol/L)、聚乙二醇(2.5%~20%,PEG 6000)和甲基紫精(25~200μmol/L)胁迫处理下,其生长均具有明显优势。尤其是在500mmol/L NaCl、10%PEG 6000和75μmol/L甲基紫精胁迫12h后,重组大肠杆菌BL21呈现出极显著的优势,分别达到了对照菌的1.81、1.47和3.48倍。研究表明,盐穗木HcUKPP可以显著提高重组大肠杆菌对不同非生物胁迫的耐受性,证明HcUKPP是一类新发现的能够响应非生物胁迫的多肽。     

灰色链霉菌中乙酰木聚糖酯酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

根据Gen Bank数据库中已报道的灰色链霉菌(Streptomyces griseus)全基因组序列,分析得到假定的乙酰木聚糖酯酶基因序列并设计引物;利用分子克隆的方法得到该菌株基因组中乙酰木聚糖酯酶基因,并构建原核表达载体p ET28a-Sgraxe,经IPTG诱导表达重组Sgr Axe,Ni-NTA亲和层析法纯化该蛋白。结果显示,克隆得到乙酰木聚糖酯酶基因axe,其序列全长1 008 bp,编码336个氨基酸。SDS-PAGE检测带有p ET28a-Sgraxe转化菌株诱导表达产物相对分子量约为37 k D,与理论值相符。纯化的重组Sgr Axe酶学性质表明,该酶最适反应温度为50℃,最适p H8.0,热稳定性较强,p H作用范围广;金属离子对酶均表现为抑制作用,尤其是Zn2+严重抑制酶活力;重组酶特征的分析揭示了其在工业中潜在的应用价值。     

香蕉果实成熟软化时果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的变化

阿拉伯糖是果实软化过程中变化最明显的细胞壁糖残基之一,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是导致细胞壁多糖中阿拉伯糖残基降解的主要糖苷酶。为阐明该酶在香蕉果实成熟软化中的作用,实验对香蕉贮藏过程中果皮和果肉中该酶活性以及果实硬度、呼吸强度和乙烯释放量的变化进行了研究。结果表明:α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在果实初期的变化很小,到果实硬度开始急剧下降时达到最大,增加量达10倍以上,且果肉中的酶活性大于果皮中;乙烯吸收剂处理延缓了香蕉果实呼吸和乙烯高峰的出现时间,降低了果实硬度、果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性变化的速度和幅度。以上结果表明α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶起诱导香蕉果实成熟的作用,在果实的软化中起着十分重要的作用,且其活性受乙烯的调节。     

一株极端嗜热木聚糖分解细菌的分离及特性

从四川康定热温泉中分离出一株厌氧、极端嗜热的木聚糖分解细菌、该菌株革兰氏染色阴性 ,不运动 ,不形成芽孢 ,细胞呈杆状 ,单个或成对排列 ,宽 0. 7～ 1.0μm ,长 2 .0～ 5 .0μm .在木聚糖琼脂滚管上 75℃培养 3 d以后的菌落呈圆形、凸状、边缘整齐、透明、不产色素、发酵木聚糖产生二氧化碳、氢、乳酸、乙酸及微量乙醇 .     

一种来源于大菱鲆的热敏型尿嘧啶DNA糖苷酶的克隆表达及酶学性质鉴定

目的:尿嘧啶DNA糖苷酶UDGase是一种广泛应用于q PCR、二代测序等领域的工具酶,由于其应用特性,只有热敏性UDGase才具有较大开发利用潜力。目前全球热敏性UDGase工具酶仅有2个物种来源,均有专利保护且价格昂贵,亟待开发新来源且具有优良热敏特性的UDGase。方法:根据前人研究及序列分析推测大菱鲆(Scophthalmus maximus)具有热敏性UDGase。经验证,大菱鲆肝脏匀浆呈现UDGase活性。从大菱鲆肝脏匀浆克隆得到大菱鲆UDGase基因SmUDGase,并使用大肠杆菌工程菌株实现重组表达,分离纯化后进行活力表征检测。结果:序列比对结果表明,SmUDGase基因克隆成功。重组表达并经亲和层析、离子交换层析分离纯化,获得纯酶纯度约95%,产率1. 51mg/L,比活力2 295. 08U/mg。Sm UDGase具有热敏性,在40℃时酶活即开始迅速降低。其他酶学性质,如pH适应范围、金属离子依赖性和对抑制剂的敏感性均与当前商业化UDGase一致。结论:成功克隆并鉴定来自大菱鲆的新来源SmUDGase,该酶具有热敏感性,酶学特性接近目前商业化UDGase。并探索该酶的重组表达和纯化工艺,所得纯酶基本达到商业化生产水平,为该类型生物工具酶的开发提供了理论参考和技术储备。     

玉米芯木聚糖硫酸酯抗凝血活性及其机制的研究

采用活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和凝血酶原时间(PT)检测了玉米芯木聚糖硫酸酯(wisX-SB)的抗凝活性,结果表明wisX-SB能明显延长APTT和TT,而不影响PT,提示wisX-SB是通过内源性和/或共同途径发挥抗凝血作用的。采用发色底物法及纤维蛋白原转化实验分别考察了wisX-SB对凝血酶及纤维蛋白原的作用,结果提示wisX-SB的抗凝机制包括:直接抑制纤维蛋白原的转化;通过增强抗凝血酶III(AT-III)的活性,抑制凝血酶活性,从而达到抗凝目的。较低浓度时以前者为主,较高浓度下两者皆起作用。     

酶法水解超级稻秸秆木聚糖制备低聚木糖的工艺研究

本文以超级稻秸秆为原料,碱溶液抽提法得到粗木聚糖,然后酶水解,制备低聚木糖。对酶解条件进行了优化,并采用高效液相色谱法对木聚糖酶解液主要组分进行了分析。结果表明,正交试验优化的最佳酶解条件为温度50℃、pH5. 0、加酶量4%,在该试验条件下低聚木糖得率为13. 5%。酶解液组分分析发现,其主要组分为木二糖和木三糖,只有少量的单糖,该结果有利于后续低聚木糖的纯化,符合低聚木糖制备的要求。