黑龙江林蛙ferritin H基因克隆及其在细菌侵染下的表达变化分析

铁蛋白广泛存在于生物体内,能够使细胞内的铁元素含量保持相对稳定且能参与机体免疫反应。近年来因细菌侵染,黑龙江林蛙(Rana amurensis)种群数量出现下降趋势,本研究探究铁蛋白基因在细菌感染的林蛙中的表达模式,期望可以为黑龙江林蛙抗细菌感染的机制研究提供参考。本研究首先采用PCR技术扩增黑龙江林蛙铁蛋白H亚基基因的编码区序列并对其进行生物信息学分析;再应用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测黑龙江林蛙被嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染后,铁蛋白H亚基基因在其肝、脾、肾、皮肤以及肌肉组织中的转录水平变化情况;最后采用免疫荧光检测技术,分析嗜水气单胞菌侵染后,黑龙江林蛙铁蛋白H亚基蛋白表达情况。结果表明,该基因编码区长度534 bp,编码177个氨基酸;对该基因氨基酸序列进行分析,其与欧洲林蛙(R. temporaria)相应基因同源性最高,达到98.37%;RT-qPCR结果显示,铁蛋白H亚基基因在黑龙江林蛙组织中广泛存在,在嗜水气单胞菌侵染后,铁蛋白H亚基mRNA在黑龙江林蛙肝、脾、肾、皮肤以及肌肉组织中的表达均显著上调(P < 0.01)。免疫荧光检测结果发现,在感染嗜水气单胞菌后,铁蛋白H亚基蛋白在黑龙江林蛙肝和肌肉组织的胞质中均有不同程度表达。综上结果表明,黑龙江林蛙铁蛋白H亚基基因会通过上调表达来响应细菌性感染,由此推测该基因参与了黑龙江林蛙的细菌性免疫应答。     

三角帆蚌BPI/LBP基因cDNA的分子特征及表达分析

杀菌通透性增加蛋白/脂多糖结合蛋白(bactericidal permeability-increasing protein/LPS-binding protein,BPI/LBP)在生物体的免疫应答过程中发挥着重要作用,但是在三角帆蚌中未见其相关的研究。我们采用RACE法获得三角帆蚌BPI/LBP基因c DNA全长(Gen Bank KX363568),该基因序列全长为1 793 bp,5'非编码区(untranslated region,UTR)和3'UTR分别为65 bp和219 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 509 bp,共编码氨基酸502个。氨基酸序列包括BPI1和BPI2两个结构域,同源性分析其与一些已知物种的BPI/LBP基因氨基酸发现各物种间具有相似的结构域,属于典型的BPI/LBP基因。q RT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析结果表明BPI/LBP基因表达于血液、肠、肾脏、外套膜、肝、腮、闭壳肌、性腺和斧足9个正常组织,表达量最高的是血液,最低的是肝脏。利用嗜水气单胞菌诱导后检测发现,血液、外套膜变化趋势最为明显,均呈现出先升高再降低的趋势,在3 h或12 h达到最大值,之后开始逐渐下降并趋于稳定,我们推测BPI/LBP基因在三角帆蚌的免疫反应中发挥着重要的作用。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白W 基因的表达及其免疫原性分析

从患暴发性败血病的草鱼病灶处分离鉴定了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)Wp3菌株。以其基因组DNA为模板扩增外膜蛋白W基因(OmpW),该基因全长为865 bp,开放式阅读框(ORF)为615 bp,与标准株ATCC7966的OmpW基因的同源性为99.8%。根据ORF序列设计引物扩增OmpW成熟肽编码序列并将其插入到表达载体pQE30中,转化大肠杆菌,经诱导可表达分子量为24.7 kD的带His标签的融合外膜蛋白His-W。用此融合蛋白免疫草鱼,所得草鱼血清经ELISA分析显示呈现阳性反应,说明重组蛋白能诱导产生抗体。采用实时荧光定量PCR分析草鱼头肾组织IgM基因表达水平的变化,结果显示免疫组IgM的表达量均明显高于空白组,其中低浓度免疫组(2μg/g)与空白对照组的差异显著(P<0.05),说明融合蛋白可使草鱼产生良好的免疫应答并上调抗体基因表达、产生高效抗体。保护性实验显示,不同免疫剂量均可使免疫组获得较高保护率(57%?86%)。结果显示,重组嗜水气单胞菌外膜蛋白W可作为草鱼嗜水气单胞菌基因工程亚单位疫苗。     

三角帆蚌KuSPI基因的克隆及表达分析

Kuntiz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kuntiz-type serine proteinase inhibitor,KuSPI)又称胰腺胰蛋白酶抑制剂,能够和相应的蛋白酶互作来调控生物体内的级联反应。本研究通过RACE克隆得到三角帆蚌KuSPI cDNA全序列共624 bp,包含38 bp和148 bp的5'和3'端UTR,ORF(open reading frame)438 bp,编码氨基酸145个,分子量为16 397.5 u,KuSPI氨基酸序列的同源性分析后发现其包含1个典型Kuntiz结构域,属于典型的KuSPI基因。qRT-PCR检测表明:KuSPI基因在闭壳肌、外套膜、肠、斧足、肝、血液、鳃、性腺和肾脏中均有表达,在外套膜中最高。利用嗜水气单胞菌进行诱导后发现,KuSPI基因在外套膜中表达量变化最大,呈现明显的先升高再降低趋势。外套膜是三角帆蚌先天免疫的首道防线,我们推测Ku SPI基因在其免疫反应中起到重要作用。     

中华鳖STING基因的克隆及功能分析

为了研究干扰素基因刺激因子STING在中华鳖(Pelodiscus sinensis)先天免疫中的作用, 克隆了中华鳖STING基因(PsSTING)的cDNA序列, 其全长为2145 bp, 包含1152 bp的开放阅读框, 编码383个氨基酸。氨基酸序列比对发现, PsSTING蛋白N端含有4个跨膜区和2个RXR内质网滞留基序, C端有1个解旋酶结构域。qRT-PCR结果显示, PsSTING在中华鳖心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、小肠、胃、皮肤、肌肉和血细胞等组织中均能表达, 其中在脾脏中的表达量最高, 其次是肝脏、小肠和肺, 而在血细胞中的表达量最低; 用嗜水气单胞菌、LPS和poly(I:C)刺激后, PsSTING基因呈现出先上调后下调的趋势, 在刺激12h 时显著高于对照组(P＜0.05), 24h达到最高值, 在48h后逐渐恢复到初始水平, 其蛋白表达量在脾脏和小肠中明显增加。体内RNA干扰后, 小肠中PsSTING的表达量显著下调(P＜0.05), IFN信号通路中TBK1、IRF3、IRF7、STAT6和IFN-β等基因表达水平显著下调(P＜0.05)。在HEK293T细胞中过表达PsSTING基因, 能够显著激活pIFN-β-luc的启动子。研究结果表明PsSTING基因参与调控了中华鳖的先天免疫反应。     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。     

河川沙塘鳢TLR2基因的克隆及表达分析

本研究以河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)为研究对象,采用RACE、实时荧光定量PCR等技术,首次对该鱼的TLR2基因进行了克隆和表达模式分析。主要研究结果如下:TLR2基因的c DNA全长序列为3 473 bp,包括2 631 bp开放阅读框(ORF)、75 bp的5'UTR区和767 bp的3'UTR区,并且具有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和26 bp的poly A尾巴,推测该序列编码876个氨基酸。蛋白结构预测表明TLR2蛋白的TIR结构域和LRR基序符合TLR家族的共同特征,其蛋白分子也存在多个功能位点。系统树中河川沙塘鳢与所有鱼类聚类为独立的分支,与鲈形目亲缘关系最近。应用RT-PCR法检测健康河川沙塘鳢鱼体中TLR2基因的m RNA组织表达差异情况。结果显示,TLR2基因在检测的12种组织中均有表达,在肝、肾、肠、血液和胃中都有较高的表达水平。人工感染嗜水气单胞菌后,对河川沙塘鳢3种主要免疫组织(脾、肾、肝)中进行不同时段表达量变化的检测,结果表明,TLR2基因在脾中感染后4 h表达水平发生下降,随后的24~48 h又上升,48 h时达到顶峰,72~96 h维持在略低于24 h水平上。在肾中,感染后表达水平持续上升,且24~96 h间保持相对稳定的表达水平。在肝组织中,感染后一直呈现上升趋势,72 h时达到顶峰,其他时段表达水平相差不大。可见TLR2在河川沙塘鳢抵御外源微生物侵染的先天免疫中发挥重要作用。     

棉花类LRR抗病蛋白(GhLRR-RL)基因的克隆及表达分析

从棉花胚株的cDNA－AFLP片段中,选取一个与拟南芥类LRR抗病原因（LRR－RL）序列相似的片段,用RACE方法延伸其3′和5′未知序列,得到一个棉花类LRR抗病蛋白的全长cDNA序列（GenBank登录号：AY040532）。该cDNA长1259bp,包含一个987bp的开放阅读框,具有Poly（A）加尾信号。推测蛋白质包含329个氨基酸,其中大部分是LRR区,其序列符合膜外LRR的共有序列LXXLXXLXXLXLXXNXGXIPXX。序列和结构比例分析表明：该棉花LRR－RL蛋白与拟南芥的两个类LRR抗病蛋白高度同源,而与植物的其他LRR蛋白结构不同,推测LRR－RL蛋白属于一类新的LRR蛋白。斑点杂交和3′RACE扩增表明,棉花LRR－RL基因具有组成性表达的特点。     

嗜水气单胞菌溶血素基因克隆与序列分析

[目的]对嗜水气单胞菌溶血素基因(HlyA)进行克隆、序列分析和蛋白三级结构预测。[方法]根据嗜水气单胞菌溶血素基因(HlyA)设计特异性引物,采用PCR方法扩增并亚克隆至pMD18-T载体中,进行DNA测序分析。[结果]获得Hly A基因片段大小为1 022 bp,推导编码297个氨基酸,其中1-30aa区域为信号肽序列,7-196aa区域为溶血素-N端结构域(PF12563),222-297aa区域为杀白细胞素结构域(PF07968)。HlyA蛋白三级结构与模板(PDB:1XEZ_A)相似性达41.76%,主要由β折叠、转角构成,与拉马钱德兰图方法检测Hly A蛋白空间结构基本一致。[结论]该研究有助于理解嗜水气单胞菌Hly A基因功能及其溶血机制。     

文蛤SRBI基因克隆及其在不同壳色群体中的差异表达

为了研究SRBI基因的结构、功能以及在贝类壳色形成中的作用, 利用SMART RACE技术克隆得到文蛤(Meretrix meretrix) SRBI (Mm-SRBI)基因的全长序列, 并对其内含子特征及不同组织、不同壳色群体外套膜中的表达差异进行了分析。结果表明: Mm-SRBI基因cDNA全长1676 bp, 开放阅读框1515 bp, 编码504个氨基酸, 结构域预测发现有一个CD36结构域; 氨基酸序列比对发现, 与华贵栉孔扇贝的同源性最高(55%), 与其他物种的相似性在34%—40%, 表明该基因变异较大; 在Mm-SRBI基因中扩增出12个内含子, 均存在于开放阅读框中, 且都遵循GT-AG原则; 荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明, Mm-SRBI在闭壳肌、外套膜、斧足、鳃、内脏团和水管6个组织均有表达, 其中在外套膜中表达量显著高于其他组织(P<0.01), 这可能与外套膜中类胡萝卜素含量较高有关; 不同壳色群体外套膜中基因表达分析表明,Mm-SRBI在黑斑和红壳文蛤中的表达量显著高于白壳文蛤(P<0.05)。实验结果为文蛤壳色形成研究奠定了基础。     

大黄鱼Follistatin基因克隆及表达分析

卵泡抑素(follistatin,FST)是转化生长因子β(Transforming growth factor-β)超家族成员之一,在动物肌肉生长中起重要作用。采用RT-PCR、RACE和常规PCR技术克隆了大黄鱼FST基因。获得的基因序列长3195 bp,其中5’非编码区96 bp,3’非编码区47 bp,含5个外显子及4个内含子。该基因开放阅读框972 bp,编码323个氨基酸,其中信号肽31个氨基酸,成熟肽292个氨基酸。Blast结果表明,大黄鱼FST基因与金鲷FST基因的核苷酸及蛋白序列同源性最高,分别达到96%和99%。FST基因在大黄鱼脑、眼、鳃、肾等多个组织中表达,其中鳃组织的表达量最高,脾组织中表达最低。检测水温19℃、25℃、30℃时大黄鱼不同组织FST基因表达量,眼和肌肉组织中FST基因表达量变化显著,推测FST基因可能在鱼类生长发育中发挥重要作用。     

三角帆蚌钙网蛋白基因cDNA的全长克隆与表达分析

采用同源克隆策略和RACE技术,从三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）外套膜组织中成功克隆得到钙网蛋白（Calreticulin,CRT）基因的全长cDNA序列,共1838 bp,开放阅读框为1257 bp,编码418个氨基酸,5'端非编码区为75 bp,3'端非编码区为506 bp,基因序列提交GenBank的登录号为JX416227。生物信息学分析表明,三角帆蚌钙网蛋白基因具有一段信号肽序列、两条典型的钙网蛋白家族标签序列KHEQNIDCGGGY和IMFGPDICG、三个保守的N-、P-和C-端功能域及内质网前导序列HDEL。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与海洋双壳类紧密聚在一起,且与蚯蚓等环节动物亲缘关系较近,聚为一支,然后依次与虾类、昆虫、鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。经荧光定量PCR检测,钙网蛋白基因在三角帆蚌的外套膜、闭壳肌、斧足、鳃、肝脏、性腺、心脏、肠等8个组织中均有表达,其中在外套膜、鳃和斧足等与贝类钙代谢相关的组织中表达量较高预示其可能参与三角帆蚌的钙代谢。不同Ca2+浓度处理试验的结果表明,随着水体中Ca2+浓度逐渐升高,三角帆蚌钙网蛋白基因在外套膜中的表达水平呈先上升后下降的趋势,并在60 mg/L时达 到最高峰,表明适宜的Ca2+浓度可促进钙网蛋白基因表达,而过高的Ca2+浓度则会抑制其表达。同时在60 mg/L Ca2+浓度条件下,对三角帆蚌外套膜进行不同时间的表达试验,结果表明钙网蛋白基因的表达量随时间推移先上升,并于48h达到最大表达量,而后逐渐下降。上述结果为进一步深入研究钙网蛋白基因的功能及其调控机理奠定基础。       

文蛤Smad1/5基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探讨Smad1/5基因在贝类生长发育中的调控作用, 利用RACE技术克隆获得文蛤Smad1/5(Mm-Smad1/5)基因的cDNA全长序列, 对其生物信息学、不同组织和不同发育时期时空表达特征进行分析, 并利用直接测序法分析了外显子区域SNP位点与生长性状的相关性。结果表明: Mm-Smad1/5的cDNA全长序列为1832 bp, 开放阅读框1380 bp, 编码459个氨基酸; 氨基酸多序列比对显示, Mm-Smad1/5蛋白与太平洋牡蛎Smad5、大西洋舟螺Smad1的一致性分别为83.7%和80.2%, 与人、鸡、非洲爪蟾等脊椎动物Smad1、Smad5氨基酸序列的一致性达到70.5%以上, 说明该基因具有较高的保守性; 结构域预测发现, Mm-Smad1/5含有Smads蛋白家族特有MH1、MH2两个高度保守结构域。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明, Mm-Smad1/5基因在成体6个组织均有表达, 尤其在斧足、外套膜中表达量显著高于其他组织(P<0.05);Mm-Smad1/5基因在各发育时期广泛表达, 从原肠胚期开始大量表达, 一直持续到壳顶幼虫期, 而从眼点幼虫大量下降, 稚贝时期又有所上升。Mm-Smad1/5基因外显子区域SNP位点相关分析表明, 共发现了9个SNP位点, 其中936 G>T位点与文蛤的生长性状显著相关(P<0.05)。Mm-Smad1/5基因在文蛤生长发育中发挥重要调控作用, 可作为高产良种选育的候选基因, 而生长关联SNP位点分析将为文蛤分子标记辅助育种研究奠定重要基础。     

中华鳖转铁蛋白基因序列特征及表达研究

转铁蛋白是呼吸链的关键因子, 参与体液和免疫系统的调节, 具有抗菌抗病毒等功能。研究从嗜水气单胞菌诱导的中华鳖肝脏SMART cDNA文库中, 分离克隆了中华鳖转铁蛋白基因cDNA和gDNA全序列, 对其序列特征、组织表达及原核表达进行了分析研究。结果显示, 中华鳖转铁蛋白对应全长cDNA的基因组DNA全长为19100 bp, 由17个外显子和16个内含子组成; cDNA全长为2359 bp, 开放阅读框为 2094 bp, 编码697个氨基酸; 转铁蛋白的分子量为76.6 kD, 包含2个糖基化位点, 存在4个二硫键形成区域的缺失, 两个同源结构域的相似性为37%, 信号肽位于第119位点。荧光定量PCR结果显示, 正常组中华鳖转铁蛋白基因在肝脏中的表达量最大; 以嗜水气单胞菌刺激后, 其在心、肝、脾和肾脏组织中的表达, 均有一个上调后减少的趋势。此外, 实验还进行了重组转铁蛋白原核表达和Western blot 检测鉴定, 为深入研究中华鳖转铁蛋白功能的提供了基础数据。       

斧文蛤金属硫蛋白基因的克隆与表达分析

金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒、维持金属元素代谢平衡以及清除自由基等生理功能。为了解斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）的分子生物学特征及其在重金属Cd2+胁迫下的响应机制,本文采用RACE技术从斧文蛤（Meretrix lamarckii）总RNA反转录产物中获得了636 bp的Ml-MT cDNA基因序列。该序列包含65 bp的5非编码区（UTR）和340 bp的3非编码区（UTR）以及231 bp的开放阅读框（ORF）,可编码76个氨基酸;其中半胱氨酸占27%,不含芳香族氨基酸,含16个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构,预测的分子量约为7.704 kD,理论等电点7.138。MT氨基酸序列比对分析表明:斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）与丽文蛤（Meretrix lusoria）的相似性高达88%,与文蛤（Meretrix meretrix）的同源性为87%。实时荧光定量（qRT-PCR）检测MT在斧文蛤5种组织中均有表达,但存在组织特异性,其中内脏团表达量最高,其次依次为鳃丝、闭壳肌、外套膜、斧足。在Cd2+（0.13 mg/L）胁迫0、6h、12h、24h、48h、72h和96h下,斧文蛤内脏团MT呈现出不同程度的上调表达,具体表现为高-低-高-低的波浪式变化,除6h以外,其他时间点均与对照组存在极显著差异（P0.01）。本研究表明:MT基因在维护机体正常生理功能及斧文蛤抵御重金属Cd2+胁迫过程中发挥着重要的分子调控作用。     

三角帆蚌SOX2基因的分子鉴定及表达分析

SOX基因家族是一系列在性别分化、胚胎发育、细胞多功能性的维持等方面具有重要作用的转录因子,在高等脊椎动物中研究比较深入,但在淡水珍珠蚌中却很少见。本研究利用RACE法克隆获得了三角帆蚌SOX2基因的序列,其cDNA全长为1 840 bp,开放阅读框为672 bp,编码氨基酸223个。该基因具有SOX基因家族典型的HMG-box蛋白结构域,与其他物种对比发现,保守性极高。实时荧光定量PCR组织表达结果显示,在斧足中表达量最高,在肝脏中最低,同时发现雌雄性腺之间存在极显著性差异,雌性性腺表达量明显高于雄性性腺;性腺在早期胚胎中表达量明显高于其他时期,推测SOX2基因参与了三角帆蚌的性别分化和胚胎发育过程。     

柞蚕Septin基因的克隆及表达分析

Septin蛋白参与了细胞分裂、细胞内物质转运、细胞周期调控及细胞凋亡等生理反应,并且发现与肿瘤发生、神经功能障碍和病原物侵染的过程直接相关。研究克隆了柞蚕septin基因全长,序列分析表明septin基因全长1904 bp,开放阅读框长度为1137 bp,编码378个氨基酸。多重序列比对分析表明柞蚕septin与家蚕及黑脉金斑蝶septin相似性最高,聚为一类。实时定量PCR结果表明柞蚕septin基因在各个组织中都有表达,但在血细胞中表达量最高,其次是表皮,而在丝腺中表达量最低。通过构建原核表达载体,柞蚕septin蛋白在大肠杆菌中成功诱导表达。     

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

锦鲤Hepcidin基因的克隆及其组织特异性表达分析（英文）

【目的】克隆锦鲤Hepcidin全长c DNA序列(k-hepc),并获得此基因在鱼体内的表达模式。【方法】利用RT-PCR和RACE PCR的方法,从锦鲤肝脏中克隆锦鲤Hepcidin的全长c DNA,进行序列测定和分析;锦鲤经肌肉注射维氏气单胞菌0、4、8、12、24和48 h后,分别取其肝、脾、肾、肠、脑、心、肌肉和鳃组织,采用实时荧光定量PCR的方法,以β-actin为内参基因,检测k-hepc基因的表达量。【结果】锦鲤抗菌肽(Gen Bank登录号KC795559)全长755 bp,编码序列276 bp,编码91个氨基酸,包括信号肽、原肽和成熟肽,成熟肽C端含有8个半胱氨酸,可形成4个分子内二硫键。与已报道的普通鲤鱼Hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类Hepcidin氨基酸序列的一致性为29%-93%。在本研究所检测的正常锦鲤的组织中,k-hepc均有表达,其中在肝组织中表达量最高,鳃组织中表达量最低。经维氏气单胞菌感染后,k-hepc在肝和心组织中的表达量明显增加,在其余组织中变化不显著。【结论】k-hepc编码的蛋白是Hepcidin家族的成员之一。锦鲤Hepcidin的表达主要受内在调节因素影响。     

锦鲤Hepcidin基因的克隆及其组织特异性表达分析

【目的】克隆锦鲤hepcidin全长cDNA序列(k-hepc),并获得此基因在鱼体内的表达模式。【方法】利用RT-PCR和RACE PCR的方法,从锦鲤肝脏中克隆锦鲤hepcidin的全长cDNA,进行序列测定和分析;锦鲤经肌肉注射维氏气单胞菌0、4、8、12、24和48 h后,分别取其肝、脾、肾、肠、脑、心、肌肉和鳃组织,采用实时荧光定量PCR的方法,以β-actin为内参基因,检测k-hepc基因的表达量。【结果】锦鲤抗菌肽(GenBank登录号KC795559)全长755 bp,编码序列276 bp,编码91个氨基酸,包括信号肽、原肽和成熟肽,成熟肽C端含有8个半胱氨酸,可形成4个分子内二硫键。与已报道的普通鲤鱼hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类hepcidin氨基酸序列的一致性为29%?93%。在本研究所检测的正常锦鲤的组织中,k-hepc均有表达,其中在肝组织中表达量最高,鳃组织中表达量最低。经维氏气单胞菌感染后,k-hepc在肝和心组织中的表达量明显增加,在其余组织中变化不显著。【结论】k-hepc编码的蛋白是Hepcidin家族的成员之一。锦鲤Hepcidin的表达主要受内在调节因素影响。