尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)NCCRP-1在多种组织中表达的免疫组化研究

非特异性细胞毒性细胞(non-specific cytotoxic cell,NCC)是硬骨鱼中一类淋巴细胞,在非特异性免疫中通过上调炎症反应释放细胞因子发挥重要的作用,是哺乳动物中NK细胞的等价物。鱼类NCC在体内多个组织器官中均有分布,其细胞毒性是自发的,可杀死多种靶细胞,例如同种异源或异种异源肿瘤细胞,寄生性原生动物和被病原侵染的细胞。NCCRP-1是NCC上的一种标志性受体。本研究对尼罗罗非鱼的脑,头肾,肝脏和脾脏进行切片,对NCCRP-1进行染色,通过免疫组化分析得知NCC在这些组织中的分布情况。另外采用Percoll非连续密度梯度法分离纯化得到头肾NCC,采用免疫组化染色和FITC标签标记,与组织中的染色结果分布相同。相较于qPCR等技术,本研究更直观地观察NCC在组织中的分布特点,为深入研究NCC的功能奠定了基础。     

罗非鱼原核表达基因研究进展

罗非鱼作为世界范围广泛养殖的经济鱼类,其营养价值特别高,是当前淡水养殖业的重要鱼类养殖品种之一.原核表达是利用基因克隆技术,把外源基因与特定表达载体结合,然后转入表达菌株,使基因在体外得以表达的一种技术.该技术可将特定基因翻译成蛋白质,为特定基因的蛋白水平研究提供基础材料.目前,随着罗非鱼养殖业的扩大,对罗非鱼的研究也...     

人TRAP1基因的克隆、原核表达及表达条件优化

应用RT-PCR技术,从人白血病多药耐药细胞株K562/ADR中扩增出肿瘤坏死因子受体相关蛋白l(tumor necrosis factor receptor-associated protein1,TRAP1)基因的cDNA.选择Nde I和Xho I分别作为上下游引物的酶切位点,将TRAP1基因克隆到带有6×His标签的pET-28a(+)的载体上.重组质粒转化大肠杆菌DH5α中,涂布于含卡那霉素的LB琼脂培养基上,经双酶切鉴定后的阳性克隆送去测序.测序成功的重组质粒pET28a(+)-TRAP1转化大肠杆茵BL21 (DE3)中,在IPTG的诱导下,成功表达重组蛋白TRAP1.通过改变诱导温度、诱导时机、IPTG浓度及诱导时间,找出最佳表达条件,使重组蛋白TRAP1表达量最高.结果表明,在39℃条件下,0D600达到0.8时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白的表达量最高.该研究为纯化出TRAP1蛋白,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础.     

尼罗罗非鱼Ikaros基因的克隆及表达分析

为揭示尼罗罗非鱼Ikaros基因结构特征及其在抗病原感染中的免疫调控机制, 实验采用RT-PCR和RACE方法克隆了尼罗罗非鱼Ikaros的cDNA序列以及利用PCR和染色体步移技术克隆了Ikaros的基因组DNA序列, 通过荧光定量PCR分析了Ikaros mRNA的组织分布及其对无乳链球菌感染的响应。结果表明, 克隆的尼罗罗非鱼Ikaros基因组DNA为20454 bp, 包括7个内含子和8个外显子, 经可变剪接可形成6种不同的mRNA剪接异构体, 其编码的氨基酸序列均具有Ikaros家族典型的锌指结构域且与硬骨鱼类Ikaros氨基酸序列同源性较高(70.6%—93.7%)。Ikaros基因在尼罗罗非鱼各组织中均有表达, 在血液中的表达量最高, 其次为胸腺、脾脏和头肾。人工感染无乳链球菌后, 血液、胸腺、脾脏、头肾中Ikaros基因的相对表达量均显著上调, 并在48h达到峰值, 这表明Ikaros基因参与调控尼罗罗非鱼抵御无乳链球菌的免疫应答反应。研究可为进一步探索Ikaros基因在罗非鱼抗病原感染中的作用机制奠定理论基础。     

猪SsBHMT基因的原核表达及条件优化

甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）是一种甲基代谢酶,催化甜菜碱转甲基到高半胱氨酸生成甲硫氨酸。对含有pET30a-SsBHMT重组质粒的菌株进行诱导表达分析,通过对菌株、IPTG诱导浓度、时间等诱导表达条件进行优化,结果表明：该目的蛋白主要以包涵体的形式出现;经过条件优化,目的蛋白表达量在上清和沉淀中均有所增加,但仍主要以包涵体的形式存在;大肠杆菌菌株ER2566为适合目的蛋白表达的菌株;在37℃,IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为10 h的条件下,目的蛋白表达量最多。研究结果为进一步蛋白纯化与抗体制备奠定了基础。     

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL（BLCAP）SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32（a）中,从而构建原核表达重组质粒pET-32（a）-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化回收,并采用SDS—PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32（a）-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

尼罗罗非鱼Ly75基因的克隆、原核表达和多克隆抗体制备

[目的]获得尼罗罗非鱼淋巴细胞抗原75(OnLy75)基因的cDNA序列和多克隆抗体。[方法]采用RACE技术克隆OnLy75基因的cDNA全序列,通过DNAMAN、MEGA等软件分析其序列特征;构建OnLy75的原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核诱导表达;将纯化后的OnLy75重组蛋白免疫新西兰大耳白兔,并通过Western Blot技术检测多克隆抗体的效果。[结果]OnLy75的cDNA序列全长为6 632 bp,开放阅读框5 199 bp,编码1 732个氨基酸。其OnLy75重组蛋白主要存在于包涵体中;将重组蛋白纯化后免疫新西兰大耳白兔,成功获得了兔抗OnLy75多克隆抗体。用该多抗对尼罗罗非鱼不同器官进行Western Blot内源性检测,结果显示该蛋白在精巢中有丰富的表达。[结论]兔抗OnLy75多克隆抗体的成功制备,为进一步深入研究OnLy75在尼罗罗非鱼组织中的定位及功能研究提供了工具。     

尼罗罗非鱼ZAP-70蛋白的原核表达、纯化及其多抗制备

[目的]构建尼罗罗非鱼ZAP-70原核表达载体,纯化其重组蛋白并制备多克隆抗体。[方法]采用无缝克隆技术构建尼罗罗非鱼ZAP-70重组表达载体,并转入大肠杆菌B21中诱导表达,将表达的ZAP-70蛋白免疫日本大耳兔得到多克隆抗体,采用Western Blotting和ELISA技术鉴定抗体的特异性和效价。[结果]成功构建原核表达重组质粒p ET-B2m-ZAP-70,诱导表达的重组蛋白分子量约为39 k Da,主要以包涵体的形式表达;获得效价为1∶512 000的多克隆抗血清,WB检测显示该抗体能够特异性的识别所表达的ZAP-70重组蛋白。[结论]尼罗罗非鱼ZAP-70重组质粒在大肠杆菌B21中高效表达,分子量约为39 k Da,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步探索ZAP-70在尼罗罗非鱼免疫系统中的功能奠定了基础。     

CAT1基因在尼罗罗非鱼肌肉和肝的节律性表达研究

为了探究碱性氨基酸转运载体(CAT1)基因在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)饥饿0、7 d肌肉和肝的昼夜表达规律,实验分别在尼罗罗非鱼饥饿0,7 d 06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00和24:00、第2天03:00、06:00,分别对应区时(Zone time, ZT) ZT0、ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24采样,采样在一昼夜内完成。每组随机取3尾鱼进行解剖,取其肌肉和肝样品分析。结果表明:CAT1基因在正常投喂的尼罗罗非鱼肌肉表达具有显著性时间差异(p0.05),呈现昼低夜高的节律性振荡(p0.3),达到峰值的时间为ZT 0.72。饥饿7 d后,虽然在各时间点上CAT1基因表达有显著性差异(p0.05),但无昼夜节律性(p0.3);CAT1基因表达为在光周期先升后降,在暗周期先降后升,峰值相位在光照阶段,为ZT 7.44。在尼罗罗非鱼肝中,CAT1基因在正常投喂时表达具有显著性时间差异(p.05),呈现节律性振荡(p0.3),CAT1基因表达为在光周期先降后升,在暗周期则先升后降,峰值相位在黑暗阶段,达到峰值的时间为ZT 16.56。饥饿7 d后,在各时间点上CAT1基因表达无显著性时间差异(p0.05),且表达无昼夜节律性(p0.3);CAT1基因表达为在光周期先降后升,在暗周期则先升后降,峰值相位在黑暗阶段,为ZT 21.60。以上结果说明CAT1基因在尼罗罗非鱼肌肉和肝表达的昼夜节律不同。     

尼罗罗非鱼Crtam基因的克隆鉴定与mRNA表达分析

Crtam作为NK细胞和CD8+T细胞的活化标志物,已被证实在哺乳动物中参与多种免疫途径,但在罗非鱼中的作用未知.本研究克隆鉴定了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) Crtam cDNA全长(命名为On-Cr-tam),对该基因进行生物信息学分析,并运用荧光定量PCR对无乳链球菌刺激后On-Crt...     

大肠杆菌yfiF基因原核表达系统构建、表达条件优化及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因yfi F的原核表达系统,对诱导表达条件进行优化,并纯化表达的可溶性Yfi F融合蛋白。[方法]使用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,对IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化,并使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白。[结果]构建了p ET16b-yfi F重组质粒,IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1时加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h。裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白纯化后浓度为209μg/ml。[结论]成功构建了yfi F的原核表达系统,优化了诱导表达条件,可溶性Yfi F融合蛋白得到纯化。     

尼罗罗非鱼NITR基因的克隆鉴定与组织表达分析

从尼罗罗非鱼脾脏组织中克隆获得新型免疫受体(NITR,Novel immune-type receptor)基因的编码区序列(Gen Bank登录号:KX989509;命名为On-NITR),该基因c DNA全长1 119 bp,ORF为1 026 bp,可编码341个氨基酸,理论分子量为37.38k D,等电点为8.28。通过NCBI BLAST比对发现罗非鱼NITR与其他已报道的物种NITR氨基酸序列相似度为27%-46%。氨基酸序列分析显示:On-NITR具有1个信号肽区域、2个胞外Ig-domain区、1个跨膜结构域,以及1个胞质尾区,该胞质尾区含有NITR典型的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和一个ITIM类似基序itim,且具有较高的保守性。荧光定量PCR分析显示,On-NITR在健康尼罗罗非鱼组织中均有表达,在肠道、皮肤、肝脏表达水平较高,在胸腺、鳃、脾脏、心脏、脑组织中的表达量较低,在头肾组织中的表达量最低。     

拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件的优化

旨在优化拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达条件。克隆拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因成熟肽片段,与p ET-28a表达载体连接后,转入到大肠杆菌BL21(DE3)中,通过优化条件进行诱导表达。结果显示,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.2 mmol/L、37℃条件下培养4 h后表达量最大,分子大小与预期值相符。融合蛋白主要以包涵体形式高效表达,通过His Trap HP柱子使其得到进一步纯化。Western blot分析表明,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合。说明通过优化表达条件,获得拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因原核表达表达产物。     

尼罗罗非鱼PKCθ蛋白和Spartin蛋白的原核表达、抗体制备及其组织表达

为了研究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)蛋白激酶C theta(PKCθ)和Spartin的蛋白表达情况,本实验在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达和提纯了尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin的重组蛋白,并利用日本大耳兔(Oryctolagus cuniculus)制备了相应的多克隆抗体。用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性,并检测其在罗非鱼肝、脾、肠和肌肉组织中的表达情况。结果表明,实验成功构建了原核表达载体p ET-B2m-PKCθ和pET-B2m-Spartin,实现了重组蛋白的原核表达和纯化。PKCθ重组蛋白主要存在于包涵体中,分子量约为56 ku;Spartin重组蛋白分子量约为30 ku,以包涵体蛋白的形式存在。获得的多克隆抗体效价均高达1︰512 000,Western Blot检测结果表明,制备的抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PKCθ和Spartin多种异构体;PKCθ蛋白在罗非鱼肝、脾、肠与肌肉组织中均有表达;Spartin蛋白在罗非鱼的肝、脾和肠组织中不表达,在肌肉组织中表达。研究表明,尼罗罗非...     

尼罗罗非鱼CD80基因的分子克隆与mRNA表达分析

CD80是T细胞活化和增殖过程中不可缺少的膜抗原,为T细胞的增殖分化提供必要的共刺激信号,在特异性细胞免疫过程中具有重要作用。本研究从罗非鱼脾脏组织中克隆获得CD80基因的编码区序列(Gen Bank登录号:KU884324;命名为On-CD80),该基因全长810 bp,可编码269个氨基酸,理论分子量为29.83 k D,等电点为5.97。氨基酸序列分析显示On-CD80具有2个保守的免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain),5'端有一个典型的信号肽序列,3'端具有1个跨膜结构域。系统进化树中罗非鱼与伯氏朴丽鱼CD80蛋白聚为一支,显示了较高的同源性。荧光定量PCR分析显示,On-CD80在健康尼罗罗非鱼组织中均有表达,且在脾脏组织中表达量最高。经灭活的无乳链球菌免疫后,On-CD80在肾脏、脾脏、胸腺、肠道、鳃、脑组织中的表达量均显著上调,且表现出较为明显的时间依赖性表达模式,肠道、鳃和脑分别在8 h、24 h出现表达高峰,并于48 h、96 h再次出现表达高峰。脾脏和肾脏、胸腺的On-CD80表达则分别是在48 h、72 h达到表达高峰。综上所述,On-CD80表达能被无乳链球菌所诱导,提示该分子可能参与罗非鱼的抗菌免疫应答,该结果为进一步研究On-CD80在罗非鱼感染无乳链球菌过程中的作用奠定了一定的基础。     

烟草SKP1基因的原核表达

为获取大量高纯度的枯斑三生烟SKP1蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-SKP1质粒为模板, PCR扩增枯斑三生烟的SKP1基因的cDNA编码区,经酶切后构建表达载体pET23b-SKP1,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并考察不同的IPTG诱导终浓度、表达时间和表达温度对目的蛋白His-SKP1表达量的影响.SDS-PAGE分析结果表明:最佳表达条件为不加诱导剂的情况下,37℃表达8 h.     

尼罗罗非鱼spo11基因的克隆表达及RU486处理对其表达的影响

正Spol1[SPOl1 meiotic protein covalently bound to DSB homolog(S.cerevisiae)]是减数分裂染色体重组过程中的重要蛋白,参与DNA双链断裂复合物(Double-Strand breaks,DSBs)的形成。目前已经从几种脊椎动物中克隆出了spol1基因,表明Spol1可能在所有真核生物减数分裂过程中都具有保守的功能[1,2]。最新研究表明,日本鳗鲡(Anguilla japonica)spol1基因仅在精子发生过程前期的精母细胞有表达,而在卵黄发生早期却没有检测到spol1的表达[2]。尽管研究者们普遍认为spol1是检测减数分裂的分子标记,但该基因在硬骨鱼类的表达模式并非完全保守,也未见关于spol1在硬骨鱼类个体发生过程     

茶树CsCOR1基因的原核表达

将来自茶树的冷诱导基因CsCORI与pGEX-6p-1质粒上的谷胱甘肤-S-转移酶(GST)融合,构建为融合表达载体,最终实现了在0.8 mmol/L IPTC诱导下的原核表达,获得了36 kD的可溶性融合蛋白,为对CsCOR1基因功能的进一步研究奠定基础.     

应用RAPD技术分析奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼的基因多态性

以随机扩增多态DNA技术(RAPD）分析了奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼两个养殖群体的群体内及群体间遗传关系,并探讨了该技术在种群鉴定中的应用。RAPD引物筛选结果表明,所测试的20个随机引物中(Table 1),除一个引物未扩增出任何片段外,其余19个引物均扩增出1～11个大小不等的片段,长度大部分在500—3000bp之间,共扩增出220个片段,平均每个引物产生55个片段。两群体间共有片段70条,大部分引物的扩增产物具有种间多态性,种群间相似系数为0.727。以筛选的引物对两种群不同个体(Fig．1,Table 2)及种群混合样品(Fig.2,Table 3)进行RAPD分析。结果表明,不同引物在扩增图谱上表现很大差异：奥利亚罗非鱼不同个体间表现为一致的扩增图谱,种内相似系数达1000,显示了其种群内遗传变异的缺乏;尼罗罗非鱼种内相似系数为0．827,个体间存在不同程度的多态性;两个种群间的相似系数分别为0．767和0.742,表明种间有较高的同源性,遗传距离为0．235,略低于国外的报道．此外,两个养殖群体间的扩增图谱比较也暗示了遗传渐渗现象的存在。实验表明,RAPD标记可以作为一种可靠的遗传标记,用于不同鱼类种群的鉴定,RAPD分析方法是一种快速,简便且行之有鼓的鉴定鱼类种群的方法。     

GSK4112对尼罗罗非鱼肝脏Nr1d1和Ulk1b基因昼夜节律性表达的影响

为了探究GSK4112对生物钟以及自噬基因在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏的昼夜表达规律的作用.本试验分别对尼罗罗非鱼注射等量生理盐水和GSK4112,并在注射24h后的06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00、24:00时以及翌日03:00、06:00时采样...