重组人促红细胞生成素纯化工艺的优化

采用堆积床生物反应器,用无血清培养基培养分泌重组人促红细胞生成素（rhEPO）的工程细胞株ZK9703.所收集的上清,采用阴离子交换层析－反相层析－分子筛层析三步纯化工艺路线,分别用Q－Sepharose XL-C4-S-200（方法Ⅰ）和DEAE Sepharose FF-Source-S-200(方法Ⅱ）纯化3批产品,所得EPO纯度达98％以上,体外比活性大于1.3^10^5IU/mg。方法Ⅰ、方法Ⅱ纯化过程的EPO体外活性回收率分别为23.56%和28.57%。本纯化方法Ⅱ工艺纯化日程短,分离效果好,EPO体内、体外活性回收率较高,更适合于大规模生产重组人促红细胞生成素。     

一种新型高糖基化免疫融合蛋白NESP-Fc的研制

新红细胞生成刺激蛋白(NESP),是重组人红细胞生长素(rh EPO)的一种高糖基化类似物,它含有5个N端糖链和比rhEPO高2倍的唾液酸残基,具有较好的代谢稳定性和3倍于rhEPO的半衰期。在新红细胞生成刺激蛋白(NESP)的基础上,通过NESP的cDNA与人IgG2的铰链区与CH2和CH3的cDNA连接,形成了融合蛋白NESP-Fc,来达到提高NESP半衰期的目的。表达载体的构建、融合蛋白的表达纯化和初步的功能性试验等一系列研究证实,所表达的融合蛋白主要以二聚体形式存在;NESP-Fc能明显促进UT-7细胞的生长和小鼠体内网织红细胞的增殖;在大鼠体内的研究发现其半衰期高达56h;小试规模重组蛋白的表达量在1.4g/L左右。这些研究为该融合蛋白最终实现临床应用和产业化打下了良好的基础。     

促红细胞生成素(EPO)

一、产品概述 促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)主要是在肾脏中产生的一种造血激素,是具有166个氨基酸残基,分子量为35000的糖蛋白。 EPO对原红细胞集落生成细胞CFU-E或其早幼阶段的BFU-E起作用,具有促进向红细胞前体细胞--网状红细胞,原红细胞的分化,并生成红细胞的作用。     

促红细胞生成素在酿酒酵母中的表达

促红细胞生成素(EPO)是一种特异刺激红系祖细胞向功能成熟的红细胞增殖分化的造血生长因子。重组人EPO(rhEPO)应用于临床治疗多种红细胞减少症取得了确切疗效。 酿酒酵母是迄今研究最为深入的真核生物之一,其遗传背景清楚,由此衍生的各种载体宿主菌表达系统较大肠杆菌载体宿主表达系统有更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力;因其较哺乳动物细胞系统     

促红细胞生成素的纯化

促红细胞生成素(Erythropoitm,EPO)是一种糖蛋白激素,正常条件下在血浆中浓度很低,当贫血或缺氧时,血浆中EPO浓度显著增加,并分泌到尿液里、EPO具有促进红系祖细胞的增殖、分化和成熟的作用,正是这一特性使它在某些贫血治疗中有着重要价值。为了研究EPO性状及临床应用,获得大量纯品EPO非常重要,1977年Miyake等人首先经过7步纯化从再障性贫血患者尿中获得毫克量级尿EPO(urme EPO,uEPO)。天然EPO源于正常人及患者尿液、血浆和胎盘浸出液。八十年代后朗编码人EPO基因被克隆,重组人EPO(recombinant human EPO,rhEPO)在哺乳动物细胞中成功表达,大大丰富了EPO来源,减小了纯化难度,使获得大量EPO纯品用于临     

促红细胞生成素的最新研究进展及临床应用

促红细胞生成素(EPO)是调节红细胞产生的主要细胞因子,EPO具有促进红细胞生成、抗炎反应、增强免疫等多种功效,但EPO作为多功效细胞因子,有多重器官靶向位点,也为广泛临床应用的提供理论支撑。目前,针对EPO的产生及细胞内的信号转导机制也提出了更全新的认知。本文在EPO临床应用广泛性及产生、转导机制上进行概述。     

花斑裸鲤Epo和Epor基因克隆及其低氧诱导的mRNA表达

促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白激素,在动物低氧适应中发挥着重要作用。本研究采用RT-PCR方法克隆了花斑裸鲤(Gymncypris eckloni)Epo和Epor基因的编码序列,并开展了分子进化和低氧诱导表达研究。结果表明,花斑裸鲤Epo基因编码序列长度为552 bp,编码183个氨基酸;Epor基因编码序列长度为1 590 bp,编码529个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示,花斑裸鲤促红细胞生成素(EPO)和促红细胞生成素受体(EPOR)与鲤科其他鱼类均有较高的同源性,表明在进化过程中具有较强保守性,同时花斑裸鲤Epo和Epor基因均未经历正向选择。在重度低氧[溶解氧为(0.3±0.1)mg/L]和中度低氧[溶解氧为(3.0±0.1)mg/L]胁迫下,花斑裸鲤部分关键组织如红肌、脑组织中Epo m RNA表达量急剧升高,表明促红细胞生成素(EPO)可能在花斑裸鲤运动、神经营养和神经保护方面发挥了重要作用,是对低氧环境适应的一种调节机制。     

重组促红细胞生成素(rHu-EPO)及其应用

19世纪,法国生理学家 Paul Verte 发现低氧可以刺激血红细胞生长。1950年美国 Reissman 证实了体内存在一种能刺激血红细胞的物质,称为红细胞生成素(EPO)。1985年,美国的 Fritsch 等成功地从成百上千的基因中发现了能产生 EPO 的一种,运用遗传工程,得以从动物细胞中产生对人类 EPO 负责的基因,从而使大量生产 rHuEPO 成为可能。EPO 是由肾脏分泌的一种重要激素,它具有促进骨髓中红细胞系列的增殖、分化、成熟和释放作用,以及维持血中细胞数和血红蛋白量的稳定状态慢性肾功能衰竭(CRF)的贫血与许多因素有关,这些因素包括:促红细胞生成素(EPO)生成减少、血中存在红细胞生成抑制因子(Inhibitors of Erythropoicsis,IE)、红细胞寿命缩     

改进培养基配方对提高EPO产量的作用

研究了用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产促红细胞生成素(EPO)的配方．改进配方前生产3批EPO,培养液样品的平均活性为4236．7IU／ml;改进配方后生产3批EPO,培养液样品的平均活性为6846．4IU／ml．后者比前者高出61．6％,即EPO产量提高达到61．6％．     

黑素转铁蛋白在家兔网织红细胞膜上的表达及其在铁摄取中的作用

目的：研究黑素转铁蛋白（p97）在家兔网织红细胞膜上的表达及其在非转铁蛋白结合铁摄取中的作用。方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS＝PAGE）和放射性同位素法（^59Fe）。结果：①网织红细胞孵育液浓缩后,经SDS－PAGE测定,在分子量97kD位置上可见一条明显的蛋白带;用磷脂酚肌醇磷脂酶C（PI－PLC）300mu/ml预处理网织红细胞后,孵育液浓缩再经SDS－PAGE测定,在分子量97kD处仍有一条明显的蛋白带,且其平均OD值高于未经处理的网织红细胞;而成熟的红细胞在此处却没有明显的蛋白带。②单纯用PI－PLC作用于网织红细胞,其铁摄取无明显变化（P＞0.05）。③去除内源性转铁蛋白后,再用PI－PLC作用网织红细胞,则胸浆内铁及整合到血红素中的铁均较未经处理的网织红细胞明显降低（P＜0.05）。结论：p97可能存在于家兔网织红细胞膜上,且在摄取非转铁蛋白结合铁的过程中可能发挥作用。     

rhEPO-L-Fc融合蛋白的表达、生物活性和初步药动学分析

为了延长人促红细胞生成素(hEPO)体内半衰期以达到更好的药效,制备通过柔性接头相连接的重组人红细胞生成素-IgG1 Fc融合蛋白(rhEPO-L-Fc),并对其生物学活性和体内药动学进行初步研究.利用PCR技术构建rhEPO-L-Fc融合基因,克隆至表达载体pOptiVEC-TOPO ,在二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-)表达.Protein A亲合层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、质谱、Western blotting鉴定表达产物,细胞增殖实验检测融合蛋白的体外活性,动物实验检测融合蛋白的体内活性和半衰期.成功构建pOptiVEC-TOPO -rhEPO-L-Fc重组子,实现了在CHO细胞表达,纯化后的rhEPO-L-Fc融合蛋白经鉴定,其分子量和特异性均与理论值相符,能刺激体外培养的EPO依赖型细胞生长,ED50为2 ng/mL,且明显增加大鼠外周血网织红细胞数,体内消除半衰期达到27 h.rhEPO-L-Fc融合蛋白能延长hEPO体内半衰期,为其临床研究奠定了基础.     

重组人促红细胞生成素研究成果通过专家鉴定

重组人促红细胞生成素(EPO)是调节和维持红细胞生理循环的重要激素,对慢性肾性贫血有特效,并有可能在癌症、血液系统恶变、AIDS病等疾病所致的贫血治疗中开拓广泛的临床应用领域。目前国内使用的EPO制剂基本上全部从美国Amgen公司进口,为此每年要支付巨额外汇。我国促红细胞生成素的研究起步较晚,第二军医大学分子遗传学教研室在上海市科委的支持下,从1991年开始进行重组人促红细胞生成素高表达CHO细胞株     

EPO治疗慢性肾衰患者对铁调素、FDP及红细胞免疫的影响

为了探讨促红细胞生成素(EPO)治疗慢性肾衰患者对铁调素、纤维蛋白原降解产物(FDP)及红细胞免疫水平的影响。选取我院2014年1月至2016年1月间收治的30例规律使用EPO治疗的肾功能不全肾衰期患者作为研究对象进行自身对照研究,患者使用EPO治疗12周,分别于治疗前、治疗后检测并比较血清铁调素、FDP、红细胞免疫水平等指标。研究显示,相较于治疗前,30例患者接受治疗后血清中的RBC、Hb、TRF、PA、血清铁和RBC-C3b RR比例均发生显著性提高,差异具有统计学意义(p0.05);而hs-CRP、FDP、铁调素水平以及RBC-ICR比例发生显著性降低,差异具有统计学意义(p0.05);但血清中Scr水平无明显变化,差异不具有统计学意义(p0.05)。因此,EPO治疗慢性肾衰患者能通过调节血清铁调素水平纠正肾性贫血,同时改善患者的红细胞免疫功能及营养状态。     

AMPK激活剂下调爆发性肝炎小鼠肝内组织因子表达北大核心CSCD

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)是重要的代谢调节酶及炎症调控新靶点。以往研究显示,AMPK激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸转甲酰酶(5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside,AICAR)可通过抑制炎症反应减轻脂多糖/右旋半乳糖胺(lipopolysaccharide/D-galactosamine,LPS/D-gal)诱导的爆发性肝炎。由于炎症可通过激活凝血反应加重组织损伤,本研究旨在以炎症诱导凝血反应为切入点探讨AICAR保肝效应的机制。腹腔注射LPS/D-gal建立爆发性肝炎小鼠模型,用Western blot检测肝内组织因子(tissue factor,TF)、缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)以及细胞核内核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)p65蛋白表达,用实时定量PCR检测肝细胞促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)m RNA表达,用试剂盒检测肝组织乳酸(lactic acid,LA)水平。结果显示,LPS/D-gal可促进小鼠肝细胞内TF蛋白表达,提高细胞核内NF-κB p65水平,上调HIF-1α蛋白及EPO m RNA表达,并提高肝组织LA水平;而AICAR干预后,以上指标均明显下调。以上结果提示,AICAR可通过抑制NF-κB活性下调TF表达及凝血活性,从而减轻肝组织缺氧及代谢紊乱,这可能是AICAR减轻LPS/D-gal诱导的爆发性肝炎的新机制。     

促红细胞生成素在低氧预适应中的神经保护作用

促红细胞生成素(EPO)是体内一种重要的糖蛋白激素,主要由胎肝和成人的肾脏产生。EPO的表达除受到转录因子的调控之外,还受到表观遗传学的调控。研究发现,EPO及其受体(EPOR)在中枢神经系统中广泛表达,提示其对中枢系统具有神经保护作用。低氧预适应是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护机制,它可以促进EPO表达,减轻低氧/缺血引起的神经元损伤。EPO主要通过激活一系列信号转导通路及多种可能的机制发挥神经保护作用。     

热习服对大鼠肾脏促红细胞生成素的影响

目的:探讨热习服对大鼠肾脏促红细胞生成素的影响.方法:雄性SD大鼠21只,按体重配对随机分为对照组、单次高温暴露组(高温组)和热习服组,每组7只,各组在各自的实验条件下进行10天,对照组大鼠第11天留取肾脏组织标本;高温组和热习服组第11天进行相同条件的标准热负荷实验后留取肾脏组织标本.采用用酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定肾脏组织中促红细胞生成素(Epo)含量,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测肾脏促红细胞生成素mRNA的表达,Western blot技术检测肾脏组织中促红细胞生成素蛋白表达水平的变化.结果:高温组与热习服大鼠肾脏促红细胞生成素水平明显高于对照大鼠(p＜0.05).热习服与高温组大鼠肾脏促红细胞生成素水平无明显差别.经RT-PCR检测,与对照组相比,高温组肾组织Epo mRNA表达显著增强(P＜0.05),而热习服组较高温组明显降低(P＜0.05),但仍然明显高于对照组的水平.Western blot实验中对照大鼠、高温组与热习服大鼠肾脏组织均有明显的Epo蛋白表达.与对照组相比,高温组Epo表达显著增强(P＜0.01),而热习服组较高温组明显降低(P＜0.05),但高于对照组的水平.结论:热习服后大鼠肾脏组织中促红细胞生成素含量明显升高,大鼠肾脏组织中促红细胞生成素mRNA与蛋白的表达均明显增强.提示热习服能显著提高肾脏Epo的表达水平,热习服后红细胞代谢变化可能与Epo水平提高有关.     

人促红细胞生成素cDNA逆转录病毒载体的构建及在NIH3T3和CHO细胞中的表达

贫血是慢性肾衰病人常见的症状,其发生的主要原因之一是由于肾脏表达促红细胞生成素(EPO)的量减少。输入基因工程重组的人EPO可以有效地改善病人的症状。由于在体内只有完全糖基化的EPO才有生理活性,所以目前临床所用EPO均来自工程化的哺乳动物细胞,价格昂贵。随着基因治疗研究的进展,人们设想可以采用基因治疗的方法,在体内表达一些有治疗作用的蛋白质,有可能解决目前蛋白     

人红细胞生成素基因在小鼠体内的转移与表达

将人的红细胞生成素(EPO)基因克隆在CMV启动子的下游,构建EPO表达质粒,在BHK₂₁细胞中表达成功后,将该质粒经脂质体包埋,再导入到小鼠的骨骼肌内,在体内亦获得了表达,一个月时小鼠血浆中人红细胞生成素的表达量高达1 340 ng/L,这为贫血病人的基因治疗提供了科学依据.     

促红细胞生成素通过提高Sca-1+干细胞的功能参与小鼠心肌梗死的修复(英文)

心肌梗死(myocardial infarction, MI)是目前全球主要的死亡病因之一。随着临床治疗水平的提高,MI急性期的死亡率已显著下降,但其对心肌重构及心功能的长远影响仍无法有效防治。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种糖蛋白细胞因子,具有促进造血、抗凋亡和促血管生成的作用。研究表明EPO在心脏缺血损伤、心力衰竭等心血管疾病中发挥心肌保护作用,机制与促进心脏祖细胞活化有关。本研究旨在探讨EPO是否可通过增强Sca-1⁺干细胞的活性促进MI的修复。通过直接注射法将达贝泊汀-α (darbepoetin alpha,一种长效EPO类似物,EPO_anlg)注射到成年小鼠MI的交界区,观测MI面积、心脏重构及功能、心肌细胞凋亡及微血管密度变化。用磁性分选技术从新生和成年小鼠心脏中分离Lin^-Sca-1⁺干细胞,分别用于克隆形成能力及EPO效应的测定。结果显示,和单纯的MI组相比,在体应用EPOanlg可显著降低MI面积、心肌细胞凋亡率,减轻左室腔的扩张,同时提高心功能、增...     

重组细胞株CHO-105C3无血清培养及人促红细胞生成素的表达

促红细胞生成素(EPO)是人体红系造血的特异性调节因子,它具有促进红系祖细胞生长、分化发育的功能。许多资料表明,肾脏是EPO的主要来源,严重肾功能紊乱患者,血浆中