应用酵母双杂交系统筛选橡胶延长因子REF的互作蛋白

利用酵母双杂交系统,以橡胶树(Hevea brasiliensis)橡胶延长因子基因REF的开放阅读框(ORF)构建无自激活性的诱饵表达载体pBD-GAL4-REF,并筛选以pAD-GAL4-2.1载体构建的橡胶树胶乳cDNA文库,对阳性克隆的cDNA插入片段进行测序及生物学功能分析。通过酵母双杂交筛选,共获得5种可能与REF互作的候选蛋白质,它们分别为与诱饵蛋白REF高度同源的REF家族成员、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)、激发子响应蛋白和泛素耦联酶E2,这表明橡胶延长因子REF除了与自身高度同源蛋白质可能存在相互作用之外,还可能与TCTP和激发子响应蛋白等其它蛋白质发生相互作用。这些结果有助于揭示橡胶粒子的生物学功能。     

水稻转录因子OsBP-73靶基因的初步筛选

OsBP-73是用酵母单杂交系统,以水稻蜡质基因(Wx)的顺式作用元件为诱饵,从水稻cDNA表达文库中筛选获得的转录因子。本文以OsBP-73基因为例介绍了用"下拉"(pull-down)方法筛选转录因子靶基因的一般步骤。将含有该基因DNA结合功能域的cDNA片段构建到原核表达载体上,并在大肠杆菌中诱导表达获得其蛋白p73。用纯化后的p73蛋白通过"下拉"实验对OsBP-73靶基因进行初步筛选,获得了22个阳性克隆,为进一步研究转录因子OsBP-73参与的水稻转录调控网络提供依据。     

利用酵母双杂交技术筛选与AtbZIP1相互作用的蛋白质

碱性亮氨酸拉链bZIP类转录因子在植物的生长发育、光形态建成、光信号传导及非生物胁迫反应中发挥重要的作用.为研究AtbZIP1基因的作用机理,本研究首先验证了该基因的自激活转录活性,通过缺失突变确定了该转录因子的转录激活结构域;以AtbZIP1缺失突变体AtbZ3为诱饵蛋白,采用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System(Clonetch),共筛选获得5个与诱饵蛋白相互作用的蛋白质;并通过AbA(Aureobasidin A)抗生素标记基因,His营养缺陷和LacZ蓝白斑检测验证了阳性克隆.亚细胞定位分析发现,AtbZIP1蛋白除了定位于细胞核外,还定位于叶绿体细胞.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究AtbZIP1蛋白的未知生物学功能提供重要信息.     

棉花锌指蛋白GhZFP1相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

GhZFP1蛋白是从盐胁迫棉花幼苗cDNA文库中分离的一种CCCH型锌指蛋白.初步的生物学功能研究表明,过量表达该基因的转基因烟草耐盐性和抗病性显著提高.为深入研究GhZFP1蛋白的作用机制,构建pGBKT7-m1诱饵表达载体,利用酵母双杂交系统从盐胁迫诱导棉花cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白.通过阳性克隆的表型确定、PCR和限制性内切酶检测以及测序和生物信息学分析,获得9个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白.双分子荧光互补实验证明,GhZFP1与GZIRD19A确实存在互作关系.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究GhZFP1锌指蛋白的未知生物学功能提供重要信息.     

巴西橡胶树胶乳中DUF1262结构域蛋白结构与基因表达分析

为了揭示天然橡胶生物合成酶互作蛋白结构及其在天然橡胶生物合成过程中的功能。本研究以橡胶树胶乳橡胶粒子总蛋白为研究对象,采用免疫共沉淀实验技术以天然橡胶合成关键酶顺式-异戊二烯基转移酶（CPT）抗体从胶乳中捕获了1个含DUF1262结构域的未知功能蛋白。生物信息学分析表明橡胶树基因组中包含50个编码含DUF1262结构域蛋白的基因序列;蛋白质相互作用网络分析表明DUF1262结构域蛋白可能参与调节信号转导或转录调控等过程;荧光定量PCR结果表明编码该蛋白基因的转录本在根、叶、花、枝和胶乳等组织中广泛分布,但在胶乳中表达较低,在树皮表达较高;水杨酸、脱落酸、过氧化氢及干旱处理可增强该基因在叶片中的转录水平。本研究证明DUF1262参与橡胶树逆境反应等生理过程,为揭示胶乳生物合成调控机制提供新线索。     

巴西橡胶树HbSIP2互作蛋白的筛选和鉴定

可溶性无机焦磷酸酶在天然橡胶生物合成中具有重要的调控作用,HbSIP2是胶乳中关键的可溶性无机焦磷酸酶基因。为了深入了解HbSIP2调控橡胶生物合成的机理,本研究对HbSIP2互作蛋白进行了筛选和鉴定。结果表明:诱饵载体p GBKT7-Hb SIP2无自激活活性,且对酵母无毒性作用,可以用于酵母文库筛选。将诱饵载体与橡胶树胶乳cDNA文库进行杂交,初步筛选获得20个与HbSIP2互作的蛋白。进一步通过双分子荧光互补实验证实,Hb SIP2能够与橡胶延伸因子发生蛋白互作。本研究结果为HbSIP2调控橡胶生物合成的机理研究提供了重要的理论依据。     

银杏MADS-box基因家族的表达及系统发育分析

MADS-box基因是真核生物中一类编码转录调控因子的基因家族,在植物花器官发育中发挥重要的调控作用。为了探究MADS-box家族基因在银杏花发育中的功能,本文对银杏花芽分化4个时期的样品进行转录组测序,筛选其中的MADS-box家族基因,利用生物信息学方法对筛选到的基因进行表达模式、蛋白结构、细胞定位和系统进化分析。结果显示:共得到15个银杏MADS-box家族基因。表达分析表明,目标基因根据表达模式可以分为3种类型。分析目标基因的编码序列显示,15个银杏MADS-box蛋白的主要构件均为α-螺旋和无规则卷曲;亚细胞定位预测主要在细胞核内;所有表达产物均包含MADS结构域。聚类分析显示,银杏MADSbox基因家族可分为6个亚类。银杏MADS-box基因家族中的new Gb2734、Gb38883、Gb28587和Gb33168可能在银杏开花调控中发挥重要作用;Gb16301可能是银杏花器官的发育过程中的关键基因。     

采用酵母双杂交系统筛选橡胶树HbTCTP1互作蛋白

翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)是一种在生物体中普遍存在和结构上高度保守的多功能蛋白。本研究以橡胶树Hb TCTP1基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)作为诱饵,采用酵母双杂交系统构建筛选Hb TCTP1互作蛋白的诱饵表达载体p BD-GAL4-Hb TCTP1,并在p ADGAL4-2.1质粒构建的橡胶树胶乳cDNA文库中筛选Hb TCTP1互作蛋白。将获得的两个与Hb TCTP1互作的阳性克隆进行测序,比对NCBI非丰富蛋白数据库发现:它们分别是橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)和60S核糖体L44蛋白(60S ribosomal protein L44,RPL44)。本研究结果对进一步揭示Hb TCTP1在橡胶树中的作用具有重要意义。     

巴西橡胶树一个AP2／EREBP转录因子的克隆及表达分析

本文采用RACE技术从巴西橡胶树中鉴定出一个AP2／EREBP转录因子。该转录因子全长cDNANl225bp,最长开放阅读框699bp,预测编码蛋白包含232个氨基酸;序列比对分析发现,该转录因子具有一段保守的AP2／EREBP结构域,与拟南芥Soloist（At4g13040）具有较高的相似性,将该基因命名HbSoloist。半定量胙PcR分析结果表明,HbSoloist在巴西橡胶树的胶乳、叶片、树皮和花中均有表达。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳HbSoloist表达量明显下降。研究发HbSoloist表达受乙烯利、茉莉酸和低温处理调控,表明HbSoloist基因可能在巴西橡胶树乙烯、茉莉酸和低温反应中发挥作用。     

酵母双杂交系统筛选新橡胶延长因子HbREF3互作蛋白

橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)等橡胶粒子蛋白可能通过相互作用形成蛋白复合体在橡胶生物合成发挥作用。为鉴定REF家族中一新成员Hb REF3的互作蛋白,以橡胶树Hb REF3基因的c DNA序列为基础,分别构建了筛选Hb REF3相互作用蛋白的3种诱饵载体p GBKT7-Hb REF3-F(含全长ORF序列)及p GBKT7-Hb REF3-N(含N端序列)和p GBKT7-Hb REF3-C(含C端序列),并分别转化到Y2H Gold酵母菌株中,进行诱饵表达载体的自激活性与毒性检测。实验证明,3种诱饵载体转化的酵母菌能在SD/-Trp平板上正常生长,而在SD/-Trp/-His/-Ade平板上不能生长,因此,诱饵载体本身没有自激活性,它们的表达产物也没有毒性,不影响转化酵母菌Y2H的生长,满足作为诱饵质粒的条件,并用于橡胶树胶乳c DNA酵母表达文库的筛选。结果表明,用Hb REF3基因的全长ORF编码产物作诱饵,没有筛选到任何候选互作蛋白,而用Hb REF3的N端和C端区域分别作诱饵,均筛选到了可能与Hb REF3具有相互作用的候选蛋白,其中包括REF家族的其他成员和膜联蛋白D4等。     

MADS-box转录因子的相互作用及对果实发育和成熟的调控

MADS-box基因编码的蛋白是一类数目庞大的转录因子家族, 通过与其他转录因子相互作用形成同源或异源二聚体, 调控着整个植株的生长发育。文章对近年来MADS-box转录因子的相互作用及对果实发育和成熟的调控作用的研究进展进行了综述, 为了解MADS-box转录因子的作用方式和作用机理及深入研究MADS-box基因对调控果实发育和成熟的作用提供参考。     

MADS-box基因对花的发育及开花早晚的影响

介绍了植物中MADS-box基因和MADS-box蛋白转录因子的组成,MADS-box基因是一类序列特异的多基因家族,所编码的蛋白即为MADS-box转录因子,它是以二聚体化的形式通过其保守结构域与特定的DNA序列相结合来调控基因的表达.主要介绍了ABC模型及MADS-box基因与花的发育,并介绍了可促进开花的4种MADS-box基因-AGL20、AGL24、CO和SOC1及抑制开花的另外4种MADS-box基因-FLC、FLM、FRI和SVP,最后提出前景和展望.     

采用酵母双杂交法筛选HbMyb1相互作用蛋白

HbMyb1是橡胶树死皮病相关基因,为了进一步研究HbMyb1的功能,采用酵母双杂交方法,从胶乳cDNA文库中筛选出10个与HbMyb1发生相互作用的蛋白,包括已知的橡胶延伸因子和橡胶小粒子蛋白等,其中4个分别与3-羟酰基-ACP-脱氢酶、NAD-依赖的山梨糖醇脱氢酶、氧化还原酶、假定的富含亮氨酸重复蛋白具有同源性的蛋白,其余4个为未知蛋白。     

与TaFRA蛋白相互作用候选蛋白的筛选

F-box蛋白是E3泛素连接酶SCF复合体的重要亚基, 通过底物蛋白的特异识别发挥功能。TaFRA是在盐胁迫差异表达片段基础上通过RACE方法获得的一个基因, 编码F-box蛋白。文章利用TaFRA基因构建诱饵表达载体, 直接用cDNA+pGAD+pBD共转化酵母双杂交的方法筛选相互作用的候选蛋白。通过对阳性克隆的鉴定和测序分析, 共获得44个与TaFRA相互作用的候选蛋白, 其中32个为已知蛋白, 包括硫氧还蛋白、金属硫蛋白、ATP合成酶及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等多种逆境胁迫反应蛋白及转录因子蛋白, 说明TaFRA与胁迫反应相关, 可能通过对上述蛋白编码基因的调控参与了植物的胁迫反应过程, 为进一步阐明TaFRA的功能及作用机制奠定了理论基础。     

橡胶树胶乳4个HbRab基因的克隆和表达分析

克隆了橡胶树胶乳中表达的4个Rab基因的全长cDNA,命名为HbRab5-HbRab8。它们编码22～24kDa的蛋白,均具有小G蛋白家族共有的GTP／GDP结合保守结构域,分别属于植物Rab家族的F、D、A和B亚家族成员。组织表达分析显示,除HbRab69外,其他3个HbRab6基因均在胶乳中表达丰度最高。在胶乳中,伤害处理显著下调HbRab6表达而上调HbRab7表达：乙烯和水杨酸处理下调HbRab6和HbRab8的表达,甲基茉莉酸处理上调HbRab5、HbRab7、HbRab8的表达,细胞分裂素上调HbRab5的表达。本文结果为橡胶树胶乳再生相关Rab基因的筛选与功能阐述奠定了基础。     

早幼粒细胞白血病基因结构域诱饵载体的构建及鉴定

目的研究早幼粒细胞白血病基因（promyelocytic leukemia,PML）中含环指／B—BOX结构与含coiled—coil结构的两个结构域的功能,构建含其结构域序列的诱饵表达载体,为进一步应用酵母双杂交系统筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础。方法PCR扩增PML的两个结构域序列,克隆人诱饵载体pG—BKT7中,经测序鉴定后,将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性,渗漏和自激活作用,同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。结果成功扩增了PML两个结构域的基因片段,并正确克隆入pGBKT7中。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,其中一个诱饵蛋白BD—PML—B无毒性,但具有渗漏和自激活作用,另一个诱饵蛋白BD—PML—C无毒性,渗漏和自激活作用,蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白。结论含环指／B—BOX的结构域具有转录因子活性,全长PML的转录活性与之有关;成功构建了含coiled—coil结构的PML结合域的酵母诱饵表达载体,为运用酵母双杂交技术筛选与之作用的蛋白并探讨其功能奠定了基础。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻组蛋白去乙酰化酶HDA705的互作蛋白

为了解水稻(Oryza sativa)组蛋白去乙酰化酶HDA705的生物学功能,构建了HDA705酵母双杂交诱饵表达载体与双杂交文库,并筛选了与HDA705相互作用的蛋白。结果表明,HDA705的诱饵载体无自激活活性且对酵母无毒性作用,文库的滴度也适合常规的酵母双杂交文库筛选。通过对酵母双杂交文库的筛选,共获得了164个阳性克隆,经DNA测序分析,这些克隆编码47个可能与HDA705相互作用的蛋白,其中包括3个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的(辅)转录因子、6个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有R3H结构域的蛋白以及22种酶类等。这为进一步研究HDA705的生物学功能提供了重要的线索。     

大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒（WDSV）逆转录病毒周期蛋白（OrfA）相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤(WDS)在秋季发生春季萎缩的季节性生长特点与大眼狮鲈鱼皮肤肿瘤病毒 (WDSV) 辅助基因的表达有关. 其中辅助基因orfA的表达产物OrfA蛋白可能是1个潜在的肿瘤相关因子, OrfA与细胞周期蛋白cyclin A和cyclin D同源,也被称为逆转录病毒周期蛋白（retroviral-cyclin）.为了深入研究OrfA的作用和功能,我们构建了诱饵表达载体pGBKT7-orfA,采用酵母双杂交技术,从HeLa cDNA文库中筛选与其相互的蛋白因子. 通过2轮高强度压力的筛选、β-半乳糖苷酶活性验证、回转验证以及测序分析,最终获得了1个与OrfA相互作用的转录因子E2F5. OrfA C端78个氨基酸的多肽或者缺失C端78个氨基酸的OrfA突变体均不能在酵母双杂交系统中与E2F5相互作用. 这些发现为进一步研究OrfA在肿瘤萎缩中的功能奠定了基础.     

云南栘[木衣]MADS-box基因家族鉴定与表达分析

MADS-box基因家族是一类重要的转录因子家族,在调控植物的生长发育、信号传导等过程中发挥着重要作用。为研究云南栘[木衣][Docynia delavayi(Franch.)Schneid.]MADS-box基因家族的特征及其在种子不同萌发时期的表达情况,本研究以云南栘[木衣]不同萌发时期的种苗为材料,在转录组测序的基础上利用生物信息学方法从云南栘[木衣]转录组数据库中筛选MADS-box转录因子,分析其理化性质、蛋白保守基序、系统进化及表达模式,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)实验验证云南栘[木衣]MADS-box基因家族成员在种子不同萌发时期的表达情况。在云南栘[木衣]转录组数据中共鉴定出81个MADS-box转录因子,其编码的氨基酸序列分子量分布范围在6211.34–173512.77 Da之间,等电点介于5.21−10.97之间。系统进化分析显示,81个云南栘[木衣]MADS-box基因可分为15个亚组,其中DdMADS27、DdMADS42、DdMADS45、DdMADS46、DdMADS53、DdMADS61、DdMADS76、DdMADS77和DdMADS79可能参与对云南栘[木衣]胚珠的发育调控。结合云南栘[木衣]种子转录组数据与qRT-PCR实验分析发现,DdMADS25和DdMADS42可能参与调控种子发育,DdMADS37和DdMADS38可能对种子休眠有负调控作用。前人报道中MIKC*亚组多参与调控花器官发育,本研究首次发现MIKC*亚组的转录因子在种子萌发前期具有较高表达量,由此推测MIKC*亚组在种子萌发过程中起到调控作用。为验证该推测准确性,挑选了MIKC*亚组的DdMADS60和DdMADS75进行qRT-PCR实验,实验结果与转录组测序的表达趋势一致。本研究可为进一步从分子进化角度研究云南栘[木衣]MADS-box基因家族的生物学功能提供参考。