含有Rubisco小亚基启动子和转运肽序列的通路克隆入门载体的构建和应用

Gateway(通路克隆)技术是最近开发出来的一种分子克隆技术,其特点是操作简单、省时高效,已经成功应用于很多基因表达载体的构建.然而,现有的通路克隆植物表达载体不包含任何将表达蛋白定位到叶绿体中的序列.将通路克隆入门质粒载体pENTR-2B的XmnⅠ位点改造成HindⅢ位点,产生入门载体pENTR*-2B,然后将番茄1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基3C的启动子(PrbcS)及其转运肽序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因亚克隆到pENTR*-2B中,构建通路克隆入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP.实验结果证实,用pENTR*-PrbcS-*T-GFP和通路克隆的植物表达载体进行LR反应,构建GFP的光诱导型植物表达载体,可以成功地将表达的GFP定位到转基因植物的叶绿体中.利用β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因替代该入门载体中的GFP基因做试验也得到相似的结果.这说明用目的基因替换该入门载体中的GFP可以构建目的基因的入门载体,然后用通路克隆技术可以快速构建其光诱导型植物表达载体,将表达的目的蛋白定位到转基因植物或组织细胞的叶绿体中.     

蝴蝶兰PhRCAβ基因的克隆及表达特性分析

为研究蝴蝶兰Rubisco活化酶(RCA)基因对低温胁迫的响应机制,以蝴蝶兰"满天红"为材料,分析了蝴蝶兰Rubisco活化酶基因PhRCAβ的全长序列(Gen Bank登录号为KU954548)及其表达特性。结果表明,PhRCAβ基因全长1 695 bp,编码440个氨基酸;其编码的蛋白具有RCA的特异位点,含叶绿体转运肽,定位于叶绿体中,其成熟蛋白的分子量为42.52 k D,等电点为蛋白5.54,属于RCA小亚基基因;该基因在绿色组织中转录表达;13℃/8℃(昼/夜)的低温胁迫抑制Ph RCAβ基因的转录表达,并随着低温胁迫时间的延长,PhRCAβ基因的表达水平逐渐降低,在温度恢复正常时其表达水平升高;4℃低温条件下,Ph RCAβ基因的表达水平随着低温处理时间的延长逐渐降低,并一直维持在较低水平。由此推测,PhRCAβ直接参与了蝴蝶兰叶片光合作用的调控。     

水稻Rubisco小亚基前体cDNA的克隆及其产物向豌豆叶绿体的运输

用RT-PCR方法克隆了完整的水稻Rubisco小亚基前体cDNA基因,经耦联的体外转录和翻译系统合成了带同位素标记的小亚基前体蛋白,然后与新制备的豌豆完整叶绿体共保温,进行蛋白质的跨膜运输研究显示：异源的水稻Rubisco小亚基前体能穿膜运输入豌豆叶绿体。成熟小亚基不能进入叶绿体,进入叶绿体的小亚基量在一定范围内与外加的小亚基前体量成正比,光对小亚基的跨膜运输有一定的促进作用,外加ATP能显著促进小亚基前体的运输,而ADP无此作用。     

通路克隆入门载体pEN-L4~*-PrbcS-~*T-gfp-L3~*的构建及其应用

为了利用通路克隆(Gateway)技术构建一个含有两个目的基因表达盒的植物表达载体,并把目的基因编码的蛋白质定位到转基因植物的叶绿体中,通过定点突变技术,在含有attL4和attL3重组位点的Gateway入门载体pEN-L4-2-L3中产生HindⅢ和XhoⅠ的酶切位点,然后在这两个酶切位点之间插入一个含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的光诱导型启动子(PrbcS)及其叶绿体基质定位序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因(gfp)的DNA片段,获得pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体.用该载体和另一个含有attL1和attL2重组位点的入门载体(pENTR*-PrbcS-*T-gus)与Gateway的目的载体pK7 m34GW2-8 m21GW3进行LR重组反应可以构建一个能串联gfp和gus两个报告基因表达盒的植物表达载体pKm-35S-PrbcS-*T-gfp-PROLD-PrbcS-*T-gus,所构建的植物表达载体转化烟草后,gfp和gus基因能插入到转基因烟草的基因组中并正常表达,所表达的GFP蛋白可正确定位到转基因植物的叶绿体中,而GUS蛋白也可以在叶片中表达.利用此表达载体通过一次转化事件不仅可以完成两个目的基因的转化操作,而且还可以利用叶绿体基质定位序列(*T)把PrbcS控制表达的目的蛋白直接定位到转基因植物的叶绿体中.因此pEN-L4*-PrbcS-*T-gfp-L3*入门载体的应用进一步扩大了Gateway技术及植物表达载体的应用范围,为叶绿体基因工程操作提供了一个更方便的技术平台.     

水稻 Rubisco 小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻(Oryza sativa)中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。     

不同生态型芦苇Rubisco免疫学特性差异

以河西走廊荒漠地区不同生态型芦苇为研究材料,提取并纯化得Rubisco蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳将Rubisco大、小亚基分离,用Rubisco全酶蛋白及其大、小亚基分别注射昆明系雄性小白鼠制备抗体,经Western-blotting鉴定结果表明:(1)水芦Rubisco全酶抗体可与水芦、沙芦及菠菜Rubisco大亚基发生反应,而与小亚基均未见显色反应,且水芦显色最深,沙芦略浅,菠菜最浅;(2)水芦、沙芦Rubisco大亚基抗体可与水芦、沙芦、菠菜大亚基发生抗原交叉反应,且均不与小亚基发生反应,并且其与菠菜Rubisco大亚基的反应程度明显低于水芦和沙芦;(3)用与Rubisco大亚基抗体同样的制备方法,均未检测到水芦、沙芦Rubisco小亚基抗体的产生;(4)菠菜Rubisco全酶抗体可与菠菜、水芦、沙芦、水稻Rubisco大亚基均发生抗原交叉反应,但仅与其自身小亚基反应,且与菠菜Rubisco大亚基显色反应最深,水稻略浅,沙芦、水芦稍有反应.由此说明,水芦、沙芦Rubisco全酶蛋白及其大亚基免疫学特性差异较小,而与双子叶植物菠菜相比差异较大;水芦、沙芦Rubisco蛋白免疫化学决定簇的差异主要决定于小亚基上,且其小亚基不具有抗原活性或抗原活性较弱.     

稗草PEPCase基因表达载体的构建并对根癌农杆菌的转化

为获得分别由不同启动子启动同一基因的表达载体,利用强组成性表达的玉米Ubiquitin1基因启动子pUbi、在叶组织特异性表达的Rubisco小亚基基因启动子pRbcS分别与稗草根型PEPCase基因(Ecppc)联接,以Nos为终止子,构建了2个植物表达载体pUbi-Eppc、pRbcS-Eppc、pZmp-Eppc,并对农杆菌进行了转化,为进一步转基因研究提供了研究材料。     

转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能

初步建立了利用病毒载体诱导转录后基因沉默系统研究烟草(Nicotiana benthamiana)1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亚基(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase／oxylase small subunit,rbcS)基因功能的模式。用携带与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亚基基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV．rbcS)侵染烟草(Nicotiana benthamiana),诱导内源rbcS基因沉默并在此基础上建立了研究rbcS基因功能的模式：初步进行了rbcS基因沉默后的表型分析、转录水平分析、蛋白质表达水平分析以及利用HPLC方法定量分析rbcS基因沉默后的光合色素变化。结果表明：病毒诱导基因沉默瞬时表达体系中烟草最佳侵染时期为苗龄21-24d,用于侵染的重组农杆菌的最佳浓度的OD值为1～1．5;烟草Rubisco小亚基的表达量可能调节Rubisco大亚基的表达量;烟草rbcS基因与光合作用中的光能收集无关。对rbcS基因沉默的烟草叶片及对照烟草叶片的部分重要光合作用指标分析表明,运用烟草脆裂病毒载体诱导转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能具有可行性,为进一步深入研究rbcS基因功能奠定了基础。     

光和糖对水稻Rubisco活化酶基因表达的影响

水稻黄化苗在光照2h内其Rubisco。活化酶的mRNA和蛋白量明显增加,然后维持在相对稳定的水平。光对水稻Rubisco活化酶的基因表达的诱导作用主要在转录水平上。Rubisco活化酶主要在绿叶中表达,这与Rubisco基因表达的器官特异性完全一致。用等渗葡萄糖喂养成熟的水稻叶片1h,促使水稻Rubisco大、小亚基和Rubisco活化酶可翻译mRNA含量下降。同样蔗糖对Rubisco小亚基和Rubisco活化酶的表达也有抑制,其作用弱于葡萄糖。     

拟南芥ats1A基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出ats1A基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,ats1A基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。     

羊草光合作用相关基因的克隆与分析

在构建了羊草叶片cDNA文库的基础上,利用M13载体通用引物筛选其亚文库,挑选阳性克隆进行测序,将测序结果在NCBI基因库中进行比对,得到一个Rubisco大亚基基因全长序列和Rubisco小亚基基因部分序列,并对其核苷酸及其编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,Rubisco大亚基基因长度为1 796 bp,与禾本科大麦、小麦、野雀麦、粗山羊草、旱麦草、异形花草、黑麦等的核苷酸序列同源性达98%以上;羊草的Rubisco小亚基基因部分序列含有一个开放阅读框,其长度为186 bp,编码61个氨基酸,与禾本科的小麦、大麦、燕麦、黑麦以及扁穗雀麦Rubisco小亚基基因氨基酸序列的同源性分别为93%、93%、91%、91%、92%。羊草Rubisco基因的克隆与分析有利于进一步研究其光合作用效率。     

香蕉Maasr1基因表达产物的亚细胞定位

利用SSH分离香蕉果实采后差异表达基因,获得香蕉的ASR基因,并将其命名为Maasr1。对该基因与香蕉采后成熟衰老进行相关性研究,发现其在果实采后早期表达上调。通过对Maasr1基因进行生物信息学分析表明,Maasr1基因编码的蛋白可能作为转录因子定位于细胞核或细胞质中。为进一步深入研究该基因功能,构建了香蕉Maasr1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pCAMBIA1304-Maasr1。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,荧光显微镜检测结果表明,Maasr1基因表达产物定位在细胞核中,符合转录因子特性。     

拟南芥atslA基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出atslA基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,atslA基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。     

利用GFP/RFP双荧光指示载体鉴定特异性启动子功能

在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。     

拟南芥信号肽AtRALF1的表达、纯化及活性分析

利用RT-PCR扩增获得拟南芥At RALF1基因的全长cDNA序列,将其构建入携带His标签的原核表达载体p ET28b中,获得重组表达载体p ET28b-At RALF1,并将其转入到大肠杆菌BL21(DE3)中。随后在不同的IPTG浓度、温度和诱导时间条件下,进行At RALF1蛋白的表达研究,建立了At RALF1融合蛋白的高效表达体系。结果表明,在30℃、1 mmol/L IPTG的条件下诱导4 h,At RALF1融合蛋白的表达量最大。进一步用获得的At RALF1融合蛋白处理苗龄5 d的野生型拟南芥(Col-0)植株,发现其根的生长受到了抑制,表明我们获得了具有活性的At RALF1小肽,为进一步研究该小肽奠定了基础。     

油菜BnrbcS基因超表达提高拟南芥种子重量和含油量

为深入分析光合作用关键酶二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）小亚基在油菜等＂绿色种子＂发育过程中的作用,采用RT-PCR技术从油菜种胚中克隆了一个含Rubisco小亚基全长编码区的cDNA序列,命名为BnrbcS（GenBank登录号DQ242646）。BnrbcS编码181个氨基酸残基,其推导的氨基酸序列中包含典型的Rubisco小亚基功能域并与其他高等植物Rubisco小亚基具有很高的同源性,暗示BnrbcS基因产物与拟南芥等植物的Rubisco小亚基在结构和功能上可能十分相似。除了在叶、子叶、角果皮等光合器官中有很高表达外,BnrbcS在贮藏物质高速积累时期的未成熟油菜种子中亦有中等水平的表达,且其＂钟型＂表达模式与一些脂肪酸合成酶系基因的表达模式相类似。将NAPIN启动子驱动的BnrbcS种子特异超表达结构转入拟南芥,转化株系的种子含油量和种子重量有一定程度提高,显示BnrbcS在调控种子油脂等贮藏物质积累过程中具有作用。     

甘蔗茎杆特异表达基因启动子的克隆及初步分析

甘蔗茎秆是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官,构建能在甘蔗茎秆中高水平表达异源蛋白质的表达载体是非常有意义的。而一个高效表达的载体,启动子则是其最重要元件之一,因此,茎秆特异性启动子的获得是甘蔗作为生物反应器的前提。利用染色体步移法克隆到甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a 5′端上游的一段长1968bp的序列（ Ppst2a ）,经序列测定及软件分析表明,该序列具有典型的启动子结构。此序列置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV 35S启动子,构建植物表达载体,命名为pCAMBIA1900,该启动子下游为gus基因。利用基因枪法转化甘蔗的茎和叶,对gus基因的瞬时表达进行测定,结果表明所获得的己糖转运蛋白基因启动子只在甘蔗茎中驱动gus基因瞬时表达,该启动子具有茎秆特异性。     

地上部特异性启动子驱动番茄原系统素表达的载体构建及转基因植株的获得

克隆地上部特异表达的启动子——cab2(chlorophyll a/b binding protein 2,cab2)基因的启动子,构建该启动子驱动下的番茄原系统素(Prosystemin;PS)与GFP融合的植物表达载体并获得转基因植株。利用农杆菌介导法转化拟南芥,通过RT-PCR的方法及激光共聚焦显微镜观察启动子驱动PS-GFP的表达及其亚细胞定位。以拟南芥基因组为模板,利用高保真聚合酶获得了cab2启动子的目的片段,并将其与接GFP的番茄原系统素载体(SlPS)融合,激光共聚焦显微镜观察表明,该启动子驱动的基因正常表达和并定位于细胞质中。克隆获得到了cab2基因的启动子,该启动子能够驱动番茄原系统素和GFP的融合蛋白正常表达和定位。     

新麦草IPT基因亚细胞定位、过表达载体构建及鉴定

摘要：为了验证IPT基因在新麦草中的功能,研究以DT型和ST型的新麦草分蘖节为材料,通过RNA-seq分析和qRT-PCR试验验证IPT的相对表达量并进行GO富集分析,采用PCR法克隆IPT基因,构建1300-cYFP-IPT过表达载体,并进行生物信息学分析;通过烟草瞬时转染法和蛋白质印迹法鉴定IPT蛋白的亚细胞定位及表达情况。结果显示：IPT与tRNA二甲基烯丙基转移酶活性相关,在新麦草分蘖中起上调作用;克隆得到新麦草IPT基因全长,并构建了1300-cYFP-IPT过表达载体,其开放阅读框（ORF）为1362bp;多序列比对与保守结构域分析表明,新麦草IPT蛋白存在PLN02840蛋白保守结构域,与二粒小麦、小麦及硬粒小麦IPT蛋白的亲缘关系较近;蛋白质二级结构预测显示新麦草IPT蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠和不规则卷曲组成;分析显示丝氨酸的磷酸化位点最有可能是蛋白发挥功能的潜在磷酸化位点;烟草瞬时转染显示IPT蛋白正常表达,定位于叶绿体中;Western blot结果显示连接载体的目的蛋白IPT正常表达,大小为76.8kDa。研究表明IPT基因在新麦草分蘖过程中上调分蘖数,1300-cYFP-IPT载体可在植株叶绿体中正常表达;该研究为后续新麦草IPT基因进一步功能验证提供试验材料和理论依据。     

人胰高血糖素样肽1在转基因番茄中的表达

人胰高血糖素样肽1 (GLP1)是一种短肽激素,对Ⅱ型糖尿病具有很好的疗效.本研究在设计合成GLP1基因并构建植物表达载体的基础上,通过农杆菌介导将GLP1基因导入番茄基因组中,经过PCR扩增和Southern Blot分析,证实GLP1基因已整合进入9个株系的番茄基因组中.Western Blot检测表明,其中4个株系转基因番茄的叶片能够检测到hGLP1融合蛋白的表达.通过Ni-NTA亲和层析分离纯化转基因番茄表达的hGLP1融合蛋白,动物实验表明该融合蛋白具有显著的降血糖生物活性.本研究结果将为转基因番茄作为生物反应器表达药用蛋白提供重要的理论和技术支持,并将为培育具有糖尿病治疗功能的番茄新品种奠定基础.