水稻Rubisco小亚基前体cDNA的克隆及其产物向豌豆叶绿体的运输

用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了完整的水稻Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基前体ｃＤＮＡ基因,经耦联的体外转录和翻译系统合成了带同位素标记的小亚基前体蛋白,然后与新制备的豌豆完整叶绿体共保温,进行蛋白质的跨膜运输研究显示：异源的水稻Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基前体能穿膜运输入豌豆叶绿体。     

水稻Rubisco小亚基前体cDNA的克隆及其产物向豌豆叶绿体的运输

用RT-PCR方法克隆了完整的水稻Rubisco小亚基前体cDNA基因,经耦联的体外转录和翻译系统合成了带同位素标记的小亚基前体蛋白,然后与新制备的豌豆完整叶绿体共保温,进行蛋白质的跨膜运输研究显示：异源的水稻Rubisco小亚基前体能穿膜运输入豌豆叶绿体。成熟小亚基不能进入叶绿体,进入叶绿体的小亚基量在一定范围内与外加的小亚基前体量成正比,光对小亚基的跨膜运输有一定的促进作用,外加ATP能显著促进小亚基前体的运输,而ADP无此作用。     

含有Rubisco小亚基启动子和转运肽序列的通路克隆入门载体的构建和应用

Gateway(通路克隆)技术是最近开发出来的一种分子克隆技术,其特点是操作简单、省时高效,已经成功应用于很多基因表达载体的构建.然而,现有的通路克隆植物表达载体不包含任何将表达蛋白定位到叶绿体中的序列.将通路克隆入门质粒载体pENTR-2B的XmnⅠ位点改造成HindⅢ位点,产生入门载体pENTR*-2B,然后将番茄1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基3C的启动子(PrbcS)及其转运肽序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因亚克隆到pENTR*-2B中,构建通路克隆入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP.实验结果证实,用pENTR*-PrbcS-*T-GFP和通路克隆的植物表达载体进行LR反应,构建GFP的光诱导型植物表达载体,可以成功地将表达的GFP定位到转基因植物的叶绿体中.利用β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因替代该入门载体中的GFP基因做试验也得到相似的结果.这说明用目的基因替换该入门载体中的GFP可以构建目的基因的入门载体,然后用通路克隆技术可以快速构建其光诱导型植物表达载体,将表达的目的蛋白定位到转基因植物或组织细胞的叶绿体中.     

水稻 Rubisco 小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻(Oryza sativa)中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。     

方穗山羊草Rubisco活性及小亚基基因克隆和功能分析

以方穗山羊草(Aegilops squarrosa L.)为母本,普通小麦(Triticum aestivum L.)为父本杂交,并以普通小麦为父本回交10代获得的核质杂种小麦为实验材料,测定了父母本及其核质杂种小麦rubisco的羧化活性和加氧活性。同时以方穗山羊草幼苗叶片为材料构建了库容量为5.5×10~5pfu的λgt10cDNA文库,并以水稻rbcS部分片段为探针筛选该cDNA文库,获得了方穗山羊草rbcS的cDNA克隆pRAS-1。核苷酸序列分析表明该cDNA全长815bp。比较以上三种材料中Rubisco活性和小亚基氨基酸的差异,推测小亚基上第56、84、98和117位氨基酸残基可能对酶的功能起着重要的作用。     

核编码叶绿体蛋白中的转运肽

大部分叶绿体蛋白是核编码并在细胞质中合成的,这些蛋白前体中都含有进入叶绿体时所必需的氨基酸序列,名为转运肽。转运肽不仅携带叶绿体蛋白,而且可携带外源蛋白。本文着重讨论转运肽的性质、结构和功能,以及外来叶绿体蛋白的转运和加工。     

大粉瘤菌小亚基rDNA片段的克隆测序

对大粉瘤菌Lycogalaflavofuscum的19SrDNA片段进行了克隆测序,序列长度为1443bp。同时将之与多头绒泡菌的相应序列进行了比较,其序列同源性为58.16%。     

杜氏盐藻RuBisCO小亚基基因的克隆和分析

根据莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、团藻(Volvox carteri)、伞藻(Acetabularia cliftonii)等生物的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的小亚基rbcS基因氨基酸的高度保守序列,设计一对简并引物,进行RT-PCR.209 bp的PCR产物经测序分析及进行氨基酸序列同源性比对,表明克隆的序列为盐藻rbcS基因的cDNA片段.根据该序列信息,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends) 方法扩增其5'上游未知区和3'下游未知区.5'RACE得到的cDNA长度为约300 bp,3'RACE得到的长度约380 bp.三段序列拼接后cDNA全长为878bp,其中开放读码框包括190个氨基酸.此cDNA序列,推导成氨基酸序列与已知物种的rbcS基因相比对,同源性分别为V.carteri 78%,C.reinhardtii 75%,A.cliftonii 67%,据此可推断所克隆的序列为盐藻RuBisCO的小亚基cDNA序列,GenBank收录号为AY739272.     

大粉瘤菌小亚基rDNA片段的克隆测序

对大粉瘤菌Lycogala flavofuscum的19S rDNA片段进行了克隆测序,序列长度为1443bp。同时将之与多头绒泡菌的相应序列进行了比较,其序列同源性为58．16％。     

蛋白质向叶绿体的转运

对近年来叶绿体蛋白质前导肽序列、叶绿体被膜中的蛋白质转运器、监护蛋白在蛋白转运过程中的作用、蛋白质导入叶绿体的途径、前体蛋白的加工的研究进展进行了介绍和评述     

ggpps 5'-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的:研究牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs)基因启动子的活性;方法:从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5'-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果:本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5'-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论:ggpps基因的5'-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5'-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础.     

小麦籽粒内AGPase质体型小亚基的克隆和序列分析

文章从小麦籽粒中克隆了淀粉合成关键酶AGPase的质体型小亚基(SSU II)的cDNA序列.其中间部分与3'端序列与大麦SSU II(Z48563)的同源性高达97%,但在5'端特异的转移肽切割位点却比Z48563缺失一段113 bp序列.本文克隆的SSU II其特异5'端序列与已报道的大麦(Z48563)、小麦(536819)、玉米(AF334960)进行多序列比对和同源性比较显示,它们的亲缘关系较远,表明这可能是一个新的SSU II基因.另外,在检测的22个现今推广面积较大的小麦品种中,SSU II 5'端缺失序列的现象都普遍存在.     

植物螯合肽的转运与功能研究进展

植物螯合肽（phytochelatins,PCs）是由植物螯合肽合酶催化谷胱甘肽合成的一类生物小分子,结构式为（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11）,在真菌和高等植物耐受重金属胁迫机制中具有重要作用。近年来,人们在Pc介导重金属脱毒害的分子机理研究上取得了重要进展,发JLSpHMT1和SpABC2是PC在裂殖酵母中介导重金属液泡区室化的主要转运蛋白,鉴定了拟南芥液泡膜PC转运蛋AtABCC1和AtABCC2。此外,PCs也可能在超积累植物细胞内对重金属脱毒害具有重要功能。     

褐飞虱核糖体小亚基蛋白S8基因NlRPS8的克隆及其表达分析

【目的】核糖体蛋白在生物体内具有重要作用,本研究旨在探明核糖体蛋白S8在褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育过程中的表达规律和功能。【方法】本文根据褐飞虱基因表达谱提供的差异表达基因信息及转录组提供的基因核心序列,结合褐飞虱基因组比对分析,对褐飞虱核糖体S8基因进行了预测,并通过RT-PCR获得了褐飞虱核糖体小亚基蛋白S8的全长c DNA序列,命名为NlRPS8(Gen Bank登录号:KU341337)。【结果】NlRPS8基因全长627 bp,编码208个氨基酸。进化分析表明,褐飞虱与桑粉介壳虫Maconellicoccus hirsutus亲缘关系最为接近。应用荧光定量PCR分析了基因NlRPS8的表达规律,结果表明,NlRPS8基因在褐飞虱怀卵雌虫中表达量最高,而在雄成虫、初羽化雌成虫与1~5龄若虫表达量相对较低;在褐飞虱体内,NlRPS8基因在卵巢中表达量最高,中肠次之,在其他部位表达量较低。在抗性品种ASD7和RHT上,NlRPS8基因表达量分别为感性品种TN1上的1.99倍和2.14倍。NlRPS8基因在经过饥饿处理1 d的褐飞虱组中表达量为正常组的1.6倍。【结论】研究结果显示NlRPS8基因在褐飞虱生长、繁殖中发挥作用,为进一步研究NlRPS8基因在褐飞虱生长发育和对抗性品种适应中的功能提供了线索。     

超高产水稻剑叶衰老过程中PSⅡ激发压与Rubisco大、小亚基含量的相关性

研究了大田生长条件下两系超高产杂交水稻(Oryza sativa L.)“两优培九”和我国大面积推广的三系杂交水稻“汕优63”从灌浆期到收获期剑叶PSⅡ光化学特性和Rubisco大、小亚基含量的变化。结果表明：可溶性蛋白质和叶绿素含量随剑叶生长时间的延长先缓慢下降,后期有一个快速降解的过程,“汕优63”降解的速率高于“两优培九”;Fv/Fm和qP都呈下降的趋势,qN则是先降然后上升。激发压(1-qP)在前期的变化较为平稳,后期则急剧增加,“汕优63”较“两优培九”增加快。Rubisco大、小亚基的含量与叶绿素、可溶性蛋白含量一样在前期下降比较慢,后期也有一个快速降解的过程,“汕优63”比“两优培九”降解快。激发压的增加与Rubisco大、小亚基的降解呈显著的线性相关性。我们推测PSⅡ激发压的急剧增加可能诱发了水稻剑叶的快速衰老过程。“两优培九”高产的重要生理原因之一,可能是它比“汕优63”有更强的光合能力并能维持更持久和较高的光合功能期。     

超高产水稻剑叶衰老过程中PSⅡ激发压与 Rubisco大、小亚基含量的相关性

研究了大田生长条件下两系超高产杂交水稻(Oryza sati va L.)"两优培九"和我国大面积推广的三系杂交水稻"汕优63"从灌浆期到收获期剑叶PSⅡ光化学特性和Rubjsco大、小亚基含量的变化.结果表明:可溶性蛋白质和叶绿素含量随剑叶生长时间的延长先缓慢下降,后期有一个快速降解的过程,"汕优63"降解的速率高于"两优培九";Fv/Fm和qP都呈下降的趋势,qN则是先降然后上升.激发压(1 qP)在前期的变化较为平稳,后期则急剧增加,"汕优63"较"两优培九"增加快.Rubi Sco大、小亚基的含量与叶绿素、可溶性蛋白含量一样在前期下降比较慢,后期也有一个快速降解的过程,"汕优63"比"两优培九"降解快.激发压的增加与Rubisco大、小亚基的降解呈显著的线性相关性.我们推测PSⅡ激发压的急剧增加可能诱发了水稻剑叶的快速衰老过程."两优培九"高产的重要生理原因之,可能是它比"汕优63"有更强的光合能力并能维持更持久和较高的光合功能期.     

Rubisco活化酶及其对Rubisco的调节作用

介绍了Robisco活化酶的发现和分子生物学特性，以及活化酶对光合作用中的关键酶──Ru－bisco的调节机制，这种调节主要是通过减轻磷酸糖的抑制作用实现的。     

ggpps 5′-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的：研究栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs）基因启动子的活性;方法：从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5′-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果：本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5′-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论：ggpps基因的5′-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5′-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础。     

小麦叶绿体psbA基因PCR扩增及其克隆

利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)对小麦叶绿体的psbA基因进行特异性扩增,并以pBSD+质粒为载体将完整的psbA基因克隆到E.c oli中。通过分子杂交,PCR反应和酶切分析证明,重组质粒pTD1Ⅱ中含有完整的小麦叶绿体psbA基因。     

对TMV不同抗性番茄品种叶绿体DNA限制性差异片段的克隆

对ＴＭＶ不同抗性番茄品种ｃｔ－ＤＮＡ经限制性内酶切后,将所获得的差异片段Ｂａｍ６克隆到质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ中,经筛选、菌落原位杂交、斑点杂交及电泳鉴定,证明重组体为抗性品种Ｂａｍ６差异片段克隆,对探讨番茄ｃｔ－ＤＮＡ与抗ＴＭＶ的关系有重要意义。