链霉菌Streptom yces olivaceusFXJ7.023多功能葡糖淀粉酶SoGA的克隆、表达及鉴定

根据海洋来源链霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因组测序结果设计特异引物,通过PCR扩增获得1条全长为1 788 bp的糖苷水解酶15家族蛋白新成员完全编码区DNA片段,该片段编码1个595个氨基酸残基、分子量为66.2 k D的预测蛋白。利用基因工程技术将该片段重组入原核表达质粒p ET32a并转化宿主菌BL21(DE3)ply Ss,IPTG诱导融合蛋白表达,表达的包涵体融合蛋白经纯化、复性后利用DNS法测定其在不同温度、p H条件下催化不同底物产生还原糖的活性。结果表明,该酶能够水解纤维素、淀粉等多种底物产生还原糖活性,且对不同底物表现不同的最适p H和最适反应温度。     

黄颡鱼Cu稳态相关基因ccs和cox17的原核表达及多克隆抗体制备

为深入研究黄颡鱼Tachysurus fulvidraco Cu稳态调控机制,从黄颡鱼cDNA中克隆获得了810和192 bp的ccs (Pfccs)和cox17 (Pfcox17)基因编码序列,并成功构建了p ET32a(+)-Pfccs和p ET32a(+)-Pfcox17重组表达载体;转化重组质粒到E. coli Rosetta (DE3)感受态细胞中,以IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达,发现PfCCS蛋白主要在沉淀中表达, PfCOX17蛋白主要在上清中表达;分别采用包涵体和亲和层析纯化的方法得到了纯度较高的重组PfCCS和PfCOX17蛋白;以纯化得到的PfCCS和PfCOX17蛋白免疫Balb/C小鼠3次,制备多克隆抗体。通过Western Blot鉴定了PfCCS和PfCOX17抗血清可以分别特异性识别重组PfCCS和PfCOX17蛋白,也可以分别特异性识别黄颡鱼内源性CCS和COX17蛋白。通过Western Blot对黄颡鱼CCS和COX17蛋白在鳃、心脏和肝脏中的分布情况进行检测,发现黄颡鱼CCS和CO...     

不吸水链霉菌ZB01 cyp107z基因的克隆及原核表达纯化

【目的】克隆不吸水链霉菌ZB01中的cyp107z基因,在E.coli中异源表达纯化,测定重组酶蛋白的酶动力学参数,为该基因的进一步研究奠定基础。【方法】根据cyp基因保守区序列设计引物,扩增不吸水链霉菌ZB01基因组中cyp107z基因的部分序列,通过染色体步移技术获取全长基因。利用pET28a表达载体构建该基因原核表达载体并于E.coli中诱导表达,以Ni-NTA亲和层析纯化表达出的重组蛋白。以阿维菌素为底物,构建重组蛋白体外催化体系,通过测定体系中NADPH的消耗,计算重组蛋白催化阿维菌素反应的酶动力学参数。【结果】从不吸水链霉菌ZB01基因组扩增出一条cyp107z基因同源基因,全长1290 bp,编码429个氨基酸残基,命名为cyp107z13,在E.coli中诱导表达了该重组酶蛋白,纯化后的重组酶蛋白催化阿维菌素的Km值为1.4μmol/L,Vmax为0.041μmol/min.mg,kcat为0.033 s-1。【结论】从不吸水链霉菌ZB01中克隆到cyp107z13基因,异源表达的CYP107Z13重组蛋白能够催化以阿维菌素为底物的氧化反应。     

苦瓜蛋白MAP30的抗菌作用及PTD-MAP30跨克氏原螯虾肠膜功能的研究

根据Gen Bank上MAP30基因的全序列,设计引物PCR扩增得到MAP30基因,并通过重叠PCR方法扩增得到PTD-MAP30基因,构建重组表达载体MAP30-p ET28a(+)和PTD-MAP30-p ET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌株在18℃ IPTG条件下诱导,表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测显示有与预期大小相符合的蛋白,并用Ni2+-柱纯化目的蛋白。抑菌圈实验发现MAP30蛋白对弧菌敏感性较高,MTT法测得最小抑制浓度MIC为300μg/m L,生长抑制曲线显示蛋白对弧菌的抑制作用具有浓度依赖性。ELISA实验说明TAT-MAP30蛋白可以快速穿过克氏原螯虾的肠上皮细胞并进入到血淋巴中,在1 h左右检测到的蛋白量最多,而且维持时间可以达到6 h。     

粉尘螨1类变应原T细胞表位重组蛋白的构建及鉴定

目的构建Der f1的T细胞表位融合肽基因的原核表达载体并表达鉴定。方法利用基因工程方法构建Der f1的T细胞表位融合肽嵌合基因,命名为Der f1T,并插入到原核表达载体p ET28a(+)中,形成重组原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T,进行双酶切和测序验证后的阳性克隆转化到E.coli BL21(DE3)诱导其表达。制样进行SDS-PAGE分析表达产物,再进行纯化,并Western bloting鉴定表达的蛋白。ELISA法测定重组蛋白对粉尘螨过敏的患者血清Ig E抗体的结合能力。结果双酶切和测序结果说明原核表达载体p ET28a(+)-Der f1T构建成功;SDS-PAGE说明Der f1T诱导且纯化成功;Western bloting进一步说明Der f1T蛋白纯化成功;ELISA试验结果说明Der f1T对粉尘螨过敏的患者血清中Ig E结合能力与Der f1相比明显下降(P0.05)。结论成功表达Der f1的T细胞表位重组蛋白,为后续粉尘螨过敏患者提供特异性免疫治疗奠定基础。     

解淀粉芽孢杆菌TF28抗菌蛋白AP1的表达、纯化与抑菌活性

本研究采用人工合成方法合成抗菌蛋白基因AP1,连接到p ET32a(+)表达载体,导入E.coli BL21菌株进行原核表达,表达产物经HIS柱纯化和肠激酶切割后测定抑菌活性。人工合成了分子量为321 bp的抗菌蛋白基因AP1,获得了p ET32a(+)-AP1-BL21基因工程菌株,该菌株在0.1 mmol/L IPTG,25℃诱导2 h,蛋白表达率为43.2%,HIS柱纯化后获得SDS-PAGE电泳一条带分子量为27 k D的融合蛋白,其含量为124.82 mg/L,收率为92%,肠激酶切割后的蛋白能抑制大豆根腐病菌和水稻恶苗病菌的生长。获得高效表达抗菌蛋白AP1的工程菌株,该菌株表达的抗菌蛋白纯化后具有抑菌活性,在植病生防方面具有应用潜力。     

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)干扰素调节因子2基因的克隆及原核表达

干扰素调节因子(Interferon regulatory factor,IRF)是一种多功能的转录因子。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了红鳍东方鲀干扰素调节因子2(Interferon regulatory factor 2,IRF2)基因的全长c DNA。该基因全长为1 552 bp,其中5'非编码区(5'-UTR)187 bp,3'非编码区(3'-UTR)429 bp,编码区(CDS)为936 bp,共编码311个氨基酸。将IRF2的编码区序列连接到原核表达载体p ET32a(+),成功构建了重组体p ET32a(+)-IRF2。将重组体p ET32a(+)-IRF2转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,获得了重组表达IRF2的基因工程菌。经IPTG诱导,p ET32a(+)-IRF2在BL21中得到了融合表达。通过对表达产物的纯化和Western blotting检测,结果显示红鳍东方鲀IRF2基因在大肠杆菌中的表达效果较高,目的蛋白准确。     

一株降解纤维素放线菌的产纤维素酶基因克隆与表达

【背景】纤维素在自然界中储量丰富,但天然纤维素的难降解性成为广泛应用纤维素资源的壁垒,近年来利用微生物来降解纤维素成为热点研究。【目的】筛选分离得到一株具有降解纤维素功能的放线菌菌株Lb1,通过全基因组测序确定其产纤维素酶关键基因5676,对基因5676进行克隆转化,使其在大肠杆菌中进行表达。【方法】通过基因工程技术将产纤维素基因连接到表达质粒上并导入表达菌株,对其降解纤维素生成葡萄糖的能力进行探究。【结果】将Lb1菌株的16S rRNA基因进行比对,确定菌株Lb1属于链霉菌属,命名为Streptomyces sp. Lb1。成功构建出纤维素酶表达载体,并且导入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3),重组菌株的产纤维素酶能力大于空载菌株。【结论】通过基因工程技术成功克隆出产纤维素酶基因,从而表达纤维素酶,为今后利用微生物降解纤维素的大规模应用提供参考。     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的:构建人胱硫醚β合成酶(human cystathionineβ-synthase,hCBS)基因原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法:以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因(基因bank号:BT007154.1)完全一致,转入E.coli BL21(DE3)中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果:经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS(rhCBS)。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS(约19 mg/L培养物),并测得其比活力约为57 kU/g。结论:成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

龟裂链霉菌RsigB基因提高大肠杆菌对环境胁迫的耐受性

龟裂链霉菌RsigB是与天蓝色链霉菌与枯草芽孢杆菌中的sigmaB基因同源的一个σ因子,其也可能为一种全局压力调控蛋白,在菌体遇到生长环境改变时起着重要的调控作用。本文以龟裂链霉菌基因组为模版,PCR扩增出RsigB基因,以pET28a为载体,构建重组质粒pET28aRsigB,并且转化至Escherichia coli BL21(DE3)中。将对照菌与重组子置于不同环境胁迫条件下培养,并用IPTG诱导蛋白表达,测其生长曲线,研究RsigB对于大肠杆菌对环境胁迫的耐受性的作用。结果表明,RsigB在大肠杆菌中的表达能够提高其对温度,高渗透压以及氧化还原压力的耐受性。RsigB的成功表达以及对于逆境的耐受性能为龟裂链霉菌中RsigB因子的功能以及机理研究提供实验基础。     

里氏木霉GH61家族糖苷酶的高效表达及酶学特性研究

【目的】GH61家族糖苷水解酶具有葡聚糖氧化酶活性,通过对葡聚糖链的随机氧化而破坏木质纤维素的结晶结构,从而使木质纤维素容易被纤维素酶降解。重组表达、纯化获得里氏木霉的GH61家族糖苷水解酶(TrGH61,原名为EGⅣ),并研究其在纤维素酶水解木质纤维素中的作用。【方法】通过Overlap PCR将里氏木霉丙酮酸脱羧酶的启动子、纤维二糖水解酶cbh1的信号肽、EGⅣ基因和PDC终止子依次连接构建了里氏木霉的表达盒,通过该表达盒使TrGH61蛋白基因整合到里氏木霉的基因组DNA上进行同源表达。研究表达产物TrGH61的水解活性、与纤维素酶水解协同效应,以及TrGH61作为金属氧化酶的特性研究。【结果】在PDC启动子的作用下,TrGH61得到高效表达,摇瓶培养的表达量达到2.33 g/L。TrGH61有微弱的内切葡萄糖苷酶活性,比活力为0.02 IU/mg,但能显著提高纤维素酶水解稻草粉的活性,协同度最高可达1.998。低浓度的金属离子Cu2+、Co2+和还原性电子供体还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸、焦性没食子酸均能显著促进其水解效应。TrGH61能够降低稻草粉纤维素聚合度和结晶度。【结论】通过PDC启动子可以实现TrGH61蛋白高效组成型表达,TrGH61作为纤维素酶活性促进因子,通过破坏纤维素结晶结构作用机制协同增强纤维素酶水解木质纤维素。     

基于磁蛋白标签的黄曲霉毒素氧化酶的分离及应用

建立了以家鸽磁蛋白(clMagR)分离标签为基础的黄曲霉毒素氧化酶(AFO)分离纯化策略及黄曲霉毒素B1(AFB1)清除体系.将具有AFB1降解活性的AFO与clMagR基因共编码,采用pET-28a(+)载体构建了 pET-28a(+)-AFO-clMagR重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)宿主异源表达融...     

金黄色葡萄球菌Cna基因的生物信息学分析及原核表达

[目的]对金黄色葡萄球菌的Cna基因进行生物信息学分析,并进行克隆和原核表达,为金黄色葡萄球菌重组疫苗的研发提供参考数据。[方法]使用Protparam、PSORT、Signal P-5.0、TMpred、Net Phos 3.1 Server、PSIPRED、SWISSMODEL等在线生物信息软件,分析Cna蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜区域、磷酸化修饰位点、二级结构和三维结构。以基因组DNA为模板扩增Cna基因编码N1-N2子域的片段,扩增产物经酶切回收后与载体p ET-32a(+)相连接,构建重组表达质粒,将该重组质粒转化E.coli TG1,经菌落PCR、测序鉴定后,增菌培养并抽提质粒,再转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。[结果]Cna蛋白由1 183个氨基酸残基组成,相对分子质量为133 006.82 Da,等电点为5.89,负电荷氨基酸残基数为180个,正电荷氨基酸残基数为167个,分子式:C5863H9241-N1569O1936S10,原子总数18 619个,是一种稳定的亲水蛋白质,定位于细胞膜上,第4～23、1 158～1 177位氨基酸残基分别形成一个典型的跨膜区,具有148个潜在的磷酸化修饰位点,二级结构中无规则卷曲和β折叠占较大比例,三维结构与二级结构预测结果相符。成功构建了重组表达质粒p ET-32a(+)-Cna,经IPTG诱导后重组蛋白(N1-N2子域)获得了表达,重组蛋白相对分子质量为52.1 k Da。[结论]Cna基因的生物信息学分析及该基因的成功表达,为研究Cna蛋白在免疫保护中的作用奠定了一定的基础。     

伤寒沙门菌线性质粒pBSSB1的p17基因的生物学功能分析

H:z66阳性伤寒沙门菌含有一特有的介导鞭毛单向相变换的线性质粒pBSSB1,其上第17号基因(p17)编码一未知功能蛋白(P17)。利用λ-Red系统制备p17基因缺陷变异株,测定变异株和野生株的生长曲线,比较其生长差异,同时通过半固体LB培养基进行动力试验比较其动力差异。利用PCR技术扩增获得p17基因,构建其重组表达载体pET28a(+)-p17,通过镍柱纯化目的蛋白P17-His6,纯化后蛋白作为抗原免疫兔子以制备多克隆抗体。结果显示,制备了p17基因缺陷变异株,变异株的生长明显迟缓于野生株(P0.05),变异株的动力明显减弱。构建了重组表达载体pET28a(+)-p17,纯化获得了高纯度的目的蛋白P17-His6并制得相应的多克隆抗体。     

紫杉醇合成关键酶BAPT基因的克隆及原核表达

目的:克隆曼地亚红豆杉紫杉醇生物合成途径中的关键酶3-氨基-3-苯基丙酰转移酶(3-amino-3-phenylpropanoyltrans-ferase,BAPT)基因,并在大肠杆菌中表达.方法:首先提取曼地亚红豆杉细胞的总RNA,反转录获得其sscDNA,并以其为模板扩增BAPT酶的基因,然后将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建重组质粒pET32a(+)-BAPT,并将重组质粒转入E.coli BL21宿主中诱导表达.结果:扩增获得1338 bp的BAPT基因序列,成功构建了原核表达质粒pET32a(+)-BAPT,并在E.coli BL21中实现高效表达.结论:BAPT基因表达产物的分子量约为51 kDa,与预期大小一致.该研究为进一步分析曼地亚红豆杉BAPT酶的酶学特性奠定了基础.     

罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析

表面免疫原性蛋白(Surface Immunogenic Protein,Sip)是B群链球菌(Group B Streptococcus,GBS)的一种表面蛋白,在GBS多种血清型的菌株中均有表达。研究从实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌广东株的基因组DNA中扩增出Sip基因,构建原核表达载体pColdII-Sip,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株。经诱导表达、SDS-PAGE电泳检测显示重组蛋白主要以可溶形式表达。重组蛋白用亲和层析的方法纯化,蛋白纯度达98%。纯化后的重组蛋白免疫罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)以分析其免疫原性。受免鱼免疫14d后进行人工攻毒试验,免疫组的相对保护率为70%—87%。酶联免疫吸附试验(Elisa)显示受免鱼对重组蛋白产生了较好的免疫应答,免疫剂量为3μg/g和5μg/g时受免鱼血清抗体滴度可达1:128000。研究结果显示重组蛋白Sip具有较强的免疫原性和保护作用,Sip基因可作为罗非鱼链球菌基因工程亚单位疫苗候选基因。     

南极衣藻谷胱甘肽-S-转移酶基因的表达及其对大肠杆菌低温耐受性的增强作用

谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase, GST, EC2.5.1.18)是生物体内一种重要的抗氧化酶, 为阐明GST在南极衣藻(Chlamydomonas sp. ICE-L)中的具体地位, 采用实时荧光定量PCR对不同温度下南极衣藻的GST基因的表达进行了分析; 并构建了原核表达载体pET28a(+)-GST, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达, 通过平板培养法探讨了重组菌E. coli BL21(pET28a(+)-GST)对低温胁迫的耐受性。结果显示, GST在0℃时表达量最高, 最高可达对照组的两倍多; pET28a(+)-GST重组表达载体在E. coli BL21中实现了高效表达, 且主要以包涵体形式存在, 经HisTrap HP柱分离纯化获得高纯度的GST融合蛋白, 并通过SDS-PAGE及Western blot分析得以验证; 对低温胁迫实验发现南极衣藻GST蛋白的表达可以提高重组菌E. coli BL21对低温的耐受性, 说明GST基因对南极衣藻适应南极低温环境具有重要作用。     

融合蛋白CBD-SPA“Z”基因的构建、表达与活性鉴定

针对金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)层析柱的应用问题,将SPA的Z结构域基因与纤维素结合结构域(CBD)重组,并在Z结构域C端引入1个半胱氨酸(Cys),构建并表达出一种新型免疫亲和材料。利用基因工程技术将质粒pEZZ18中的Z基因插入到含有CBD的质粒pET35b(+)质粒中,构建出原核表达载体pET35b(+)-ZCys,经IPTG诱导表达,获得CBD-Protein Z融合表达蛋白。pET35b(+)-Z-Cys在E.coli BL21中正确表达,所表达的融合蛋白具有与哺乳动物IgG抗体结合的生物学活性和与纤维素结合的活性。结果证明CBD-Protein Z蛋白具有Z结构域与CBD结构域的活性,预计能在免疫亲和层析中用于IgG抗体的纯化。     

环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO03877的原核表达

分别利用表达载体pET-32a(+)和pGEX-4T-1,对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzzae v.oryzae,简称Xoo)中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO_03877进行了原核表达,并进行可溶性检测.结果显示,用pET-32a(+)栽体构建的表达质粒栽体经诱导后,重组蛋白大多位于沉淀而非上清中,经诱导条件优化后,蛋白仍以包涵体形式存在;而利用pGEX-4T-1载体表达的含有GST标签的重组蛋白为可溶性蛋白,可用于下一步纯化后进行功能分析.     

关岭牛PPARγ基因原核表达载体的构建及生物信息学分析

本研究旨在通过克隆关岭牛PPARγ基因CDS区及构建p ET32a(+)-PPARγ真核表达载体。本研究通过RT-PCR技术克隆关岭牛PPARγ基因的CDS区,采用DNAStar和Ex PASy等软件对该基因CDS区进行序列分析;利用双酶切的方法构建原核表达载体p ET32a(+)-PPARγ,结果显示,关岭牛PPARγ基因的CDS区全长1 428 bp,编码475个氨基酸。本研究成功克隆了关岭牛PPARγ基因的CDS区,并构建了其原核表达载体p ET32a(+)-PPARγ,为进一步研究PPARγ基因调控机制提供了理论基础。